基于磁性金屬有機(jī)框架模擬酶電化學(xué)檢測(cè)鄰苯二酚的研究

關(guān)樺楠， 邢 珂， 張 悅， 劉樹(shù)萍

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)旅游烹飪學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076)

鄰苯二酚(CC)，又稱(chēng)兒茶酚，是化學(xué)生產(chǎn)、農(nóng)藥、橡膠染料中常見(jiàn)有機(jī)污染物。鄰苯二酚被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為潛在致癌物，即使?jié)舛葹?～25 ppm，也被認(rèn)為對(duì)生物具有毒性[1 - 3]，因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速、靈敏的鄰苯二酚檢測(cè)方法就顯得尤為重要。與常用的檢測(cè)方法如高效液相色譜法(HPLC)[4]、熒光探針?lè)╗5]和化學(xué)發(fā)光分析法[6]等相比，電化學(xué)生物傳感分析技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)[7,8]，并且有很好的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)前景。

大多數(shù)電化學(xué)生物傳感分析技術(shù)的核心原件是以天然酶為基礎(chǔ)進(jìn)行分析檢測(cè)的，而天然酶卻因其高昂的制備成本、不穩(wěn)定性和難再生等不足，嚴(yán)重限制了其實(shí)際應(yīng)用[9,10]。為解決電化學(xué)生物傳感分析技術(shù)中天然酶的不足，納米模擬酶逐漸成為研究熱點(diǎn)。與天然酶相比，基于納米材料的人工模擬酶因其成本低、穩(wěn)定性高而受到越來(lái)越多的關(guān)注，其中金屬-有機(jī)框架材料(metal-organic frameworks，MOFs)以其可調(diào)的結(jié)構(gòu)、高孔隙率、高催化活性和高穩(wěn)定性等特點(diǎn)引起了廣泛的研究興趣[11,12]。然而，單MOFs的酶活性較差，因此通常在單MOFs的基礎(chǔ)上添加其他納米材料來(lái)制備復(fù)合MOFs，以提高酶的活性[13]。在眾多納米材料中，F(xiàn)e3O4和金納米粒子(AuNPs)均具有過(guò)氧化物模擬酶活性，添加到MOFs中可以顯著提高復(fù)合納米粒子的過(guò)氧化物模擬酶活性和催化能力[14,15]。Fe3O4@Au/MOF模擬酶具有AuNPs良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性[16]，并且可以提高體系的靈敏度和選擇性[17]，也具有Fe3O4可以被磁鐵回收和再利用[18]的優(yōu)點(diǎn)。

本文通過(guò)將Fe3O4磁性粒子和Cu2+分散在對(duì)苯二甲酸(PTA)形成的二維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，合成了銅基金屬有機(jī)框架(Fe3O4@Cu-MOF)，同時(shí)將金納米粒子嵌入網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)后，制備出具有過(guò)氧化物酶活性的新型金屬有機(jī)框架模擬酶(Fe3O4@Au/MOF)。Fe3O4@Au/MOF可催化分解體系中的H2O2，釋放出具有氧化活性的羥基自由基，進(jìn)一步加速電化學(xué)信號(hào)物質(zhì)鄰苯二酚在玻璃碳電極表面的氧化反應(yīng)，從而增加系統(tǒng)中電荷的運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生微電流，進(jìn)而提高電化學(xué)檢測(cè)體系的的靈敏度。利用Fe3O4@Au/MOF模擬酶構(gòu)建增強(qiáng)的電化學(xué)檢測(cè)鄰苯二酚系統(tǒng)，成功用于檢測(cè)飲用水中的鄰苯二酚。鑒于此，基于模擬酶的電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)將為環(huán)境分析、食品分析以及生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域提供一種新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學(xué)工作站(上海晨華儀器有限公司)：采用三電極結(jié)構(gòu)體系，包括玻璃碳電極(GCE)作為工作電極，鉑電極作為對(duì)電極，Ag/AgCl作為參比電極；YH-101水熱反應(yīng)釜(河南裕華儀器科技有限公司)；F200X S透射電子顯微鏡(北京歐博通光學(xué)技術(shù)有限公司)；EDK 9500傅里葉變換紅外光譜儀，X射線光電子能譜儀(北京杜克科技有限公司)。

鄰苯二酚購(gòu)自廣福精細(xì)化工研究所；FeCl3·6H2O，NaAc·3H2O，HAuCl4，CuSO4，NaBH4，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙二醇(PEG-4000)，乙二醇，對(duì)苯二甲酸，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，2,2′-氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)等試劑均購(gòu)于科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 Fe3O4@Au/MOF的合成

采用水熱法制備Fe3O4納米顆粒。分別將3 g的FeCl3·6H2O、6.3 g的NaAc·3H2O和1.8 g的PEG-4000依次加入到裝有80 mL乙二醇的燒杯中。充分震蕩30 min后，將混合均勻的溶液轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中，在200 ℃條件下恒溫反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，離心去上清液，分別采用乙醇和去離子水依次清洗黑色沉淀3個(gè)循環(huán)，隨后將沉淀真空干燥至恒重，此為所制備的Fe3O4納米顆粒，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

采用改良的綠色還原法[19]，以新鮮的橘子皮為原料，制備金納米粒子。將20 g切碎的橘子皮在80 ℃的去離子水中浸泡1 h，然后將濾液以3 500 r/min離心5 min，得到上清液。用去離子水稀釋上清液，得到橙皮備用溶液，并在4 ℃下保存。將20 mL預(yù)冷4 ℃的HAuCl4加入至燒杯中，放置于磁力攪拌器上均勻攪拌，并迅速向燒杯中加入5 mL橘子皮備用液。隨著攪拌速度的不斷加快，體系的顏色從黃色變?yōu)榫萍t色并在30 min內(nèi)沒(méi)有變化時(shí)，即反應(yīng)結(jié)束。金納米粒子定量為31.3 mg/mL，合成的含有金納米粒子的溶液需要保存在4 ℃的環(huán)境下。

將2 g合成的Fe3O4納米粒子和10 mL 99.7%的乙醇在搖床上充分混合30 min。然后再依次加入3 g PVP、20 mL的乙醇和45 mL的DMF，并超聲震蕩處理45 min。加入10 mL Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液和2 g對(duì)苯二甲酸粉末，搖床震蕩反應(yīng)30 min。將混合后的溶液置于200 ℃的水熱反應(yīng)釜中反應(yīng)6 h。用乙醇和蒸餾水對(duì)混合溶液進(jìn)行3次洗滌。將清洗后的金屬有機(jī)框架(Fe3O4@Cu-MOF)置于真空干燥箱中，干燥至恒重，備用。

將Fe3O4@Cu-MOF進(jìn)行超聲波震蕩處理，使之分散在5 mL蒸餾水中，加入5 mL所制備金納米粒子凝膠工作液，在搖床中緩慢晃動(dòng)6 h，然后加入10 mL濃度為0.1 mol/L的NaBH4水溶液，超聲處理45 min。最后，用蒸餾水清洗，再干燥至恒重后得到Fe3O4@Au/MOF二維磁性金屬有機(jī)框架。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4@Au/MOF的表征

采用透射電子顯微鏡對(duì)所制備的Fe3O4@Au/MOF粒子的表觀形貌進(jìn)行表征。由圖1可知，F(xiàn)e3O4@Au/MOF是由表面粗糙的分散球體組成的磁性團(tuán)簇。Fe3O4磁性納米粒子具有磁性吸引力和范德華力，所以Fe3O4納米粒子易產(chǎn)生聚集，導(dǎo)致分散穩(wěn)定性差。將AuNPs固定在其表面可以有效降低Fe3O4納米粒子之間的聚集效應(yīng)，提高復(fù)合納米粒子的催化活性。根據(jù)TEM圖像顯示，磁性納米粒子和AuNPs均勻地分散在Fe3O4@Au/MOF團(tuán)簇中，并成功地與銅基金屬有機(jī)框架結(jié)合。

圖1 Fe3O4@Au/MOF金屬有機(jī)框架在50 nm(a)和200 nm(b)下的透射電子顯微鏡(TEM)Fig.1 TEM images of Fe3O4@Au/MOF metal-organic framework at 50 nm (a) and 200 nm (b)

用X射線光電子能譜(XPS)來(lái)進(jìn)一步分析Fe3O4@Au/MOF復(fù)合材料的組成。在XPS光譜中，三個(gè)突出的峰分別是Fe 2p,Au 4f和Cu 2p。如圖2a所示，F(xiàn)e 2p的高分辨率XPS光譜包含兩個(gè)結(jié)合能，分別為710.55和724.32 eV。這兩個(gè)結(jié)合能代表了Fe 2p3/2和Fe 2p1/2的雙峰，即Fe3O4磁性粒子的特征峰。根據(jù)圖2b和2c可以看出，在93.55 eV和932.52 eV處可以觀察到Au 4f和Cu 2p的光譜，這意味著AuNPs和Cu2+已經(jīng)成功嵌入Fe3O4@Au/MOF復(fù)合納米粒子中。

圖2 Fe3O4@Au/MOF金屬有機(jī)框架中Fe (2p) (a),Au (4f) (b)和Cu (2p) (c)的X射線光電子能譜Fig.2 X-ray photoelectron spectra of Fe (2p) (a),Au (4f) (b) and Cu (2p) (c) in Fe3O4@Au/MOF

圖3 Fe3O4@Au/MOF金屬有機(jī)框架的紅外光譜Fig.3 FT-IR spectrum of Fe3O4@Au/MOF metal-organic framework

對(duì)Fe3O4@Au/MOF進(jìn)行了FT-IR檢測(cè)，如圖3所示。在560.19 cm-1處的峰值來(lái)自磁性顆粒中Fe-O鍵的振動(dòng)；由于C-O拉伸，約在1 117.31 cm-1處產(chǎn)生了吸收峰；1 631.33 cm-1處產(chǎn)生的吸收峰是由于氨基的存在。在2 250～2 750 cm-1之間有兩個(gè)吸收峰分別來(lái)自長(zhǎng)鏈烷基-CH2和-CH3的振動(dòng)，此外，3 846.44 cm-1處為-OH鍵的特征峰。

2.2 Fe3O4@Au/MOF復(fù)合材料的模擬酶活性的驗(yàn)證

設(shè)計(jì)5個(gè)不同的反應(yīng)體系：(1)H2O2+Fe3O4@Au/MOF；(2)單獨(dú)鄰苯二酚；(3)鄰苯二酚+Fe3O4@Au/MOF；(4)H2O2+鄰苯二酚；(5)H2O2+Fe3O4@Au/MOF+鄰苯二酚。采用循環(huán)伏安法(CV)監(jiān)測(cè)5個(gè)體系氧化峰電流的變化情況。以在H2O2存在下，鄰苯二酚的催化氧化反應(yīng)程度來(lái)評(píng)估Fe3O4@Au/MOF的過(guò)氧化物酶活性。

圖4 Fe3O4@Au/MOF過(guò)氧化物模擬酶活性的電化學(xué)驗(yàn)證Fig.4 Electrochemical validation of Fe3O4@Au/MOF peroxidase-like activity

如圖4所示，在Fe3O4@Au/MOF的存在下，低濃度的H2O2不能產(chǎn)生氧化電流峰，說(shuō)明玻璃碳電極表面沒(méi)有可產(chǎn)生電流的移動(dòng)電子，或者體系中的反應(yīng)不滿(mǎn)足產(chǎn)生電流的反應(yīng)條件。當(dāng)HAc-NaAc緩沖體系中只有鄰苯二酚時(shí)，產(chǎn)生了微弱的電化學(xué)信號(hào)，這是因?yàn)猷彵蕉泳哂歇?dú)特電化學(xué)活性[20]。鄰苯二酚+Fe3O4@Au/MOF緩沖溶液體系和H2O2+鄰苯二酚緩沖溶液體系都產(chǎn)生了較為突出的氧化峰電流，并且電流呈上升趨勢(shì)。因?yàn)镕e3O4@Au/MOF催化了溶液中的幾種氧化性物質(zhì)并與鄰苯二酚發(fā)生反應(yīng)，從而促進(jìn)了電子轉(zhuǎn)移。與其他體系相比，H2O2+Fe3O4@Au/MOF+鄰苯二酚體系的氧化電流峰值明顯增大。這是因?yàn)镕e3O4@Au/MOF作為過(guò)氧化物模擬酶，催化H2O2重新引入大量的氧化活性物質(zhì)(主要是具有氧化活性的·OH和HOO·自由基)，進(jìn)一步促進(jìn)了鄰苯二酚的氧化。結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4@Au/MOF表現(xiàn)出了過(guò)氧化物酶模擬酶的活性，有效催化H2O2并進(jìn)一步氧化鄰苯二酚，因此它可以加入到鄰苯二酚的電化學(xué)檢測(cè)中，以提高檢測(cè)靈敏度。

2.3 單因素優(yōu)化Fe3O4@Au/MOF模擬酶電化學(xué)檢測(cè)體系

將不同添加量的Fe3O4@Au/MOF(0.050、0.075、0.10、0.125和0.150 g)分別加入不同pH值(4、5、6、7和8)的10 mL HAc-NaAc緩沖溶液中混勻，并將其加熱至不同的恒定溫度(40、50、60、70和80 ℃)，加入600 μL 50 mmol/L H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分反應(yīng)10 min后，再加入200 μL 0.01 mmol/L的鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，并采用不同掃描速率(0.02、0.04、0.06、0.08和0.1 V/s)的電化學(xué)工作站進(jìn)行檢測(cè)。再進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，篩選出最佳檢測(cè)條件。

圖5 不同因素對(duì)電化學(xué)檢測(cè)體系的影響Fig.5 Effect of different factors on the electrochemical detection system(a)the reaction temperature;(b) Fe3O4@Au/MOF addition amount;(c) the scan rate;(d) pH of buffer solution

從圖5a可以看出，當(dāng)溫度在40～70 ℃范圍內(nèi)時(shí)，反應(yīng)速率隨著溫度的上升而提高。由于溫度變化導(dǎo)致鄰苯二酚的溶解度增加，與Fe3O4@Au/MOF催化產(chǎn)生的自由基充分反應(yīng)，所以|Ipa|持續(xù)上升。當(dāng)溫度超過(guò)70 ℃時(shí)，|Ipa|下降，這是由于Fe3O4@Au/MOF模擬酶的活性在較高溫度下受到抑制。因此，在正交優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇溫度為60、70、80 ℃。如圖5b所示，當(dāng)Fe3O4@Au/MOF的添加量在0.005至0.075 g時(shí)，|Ipa|上升速率最快。體系中的模擬酶活性增強(qiáng)會(huì)促進(jìn)H2O2產(chǎn)生更多的氧化活性自由基，使電子加快轉(zhuǎn)移速度、增加轉(zhuǎn)移數(shù)量。然而，當(dāng)繼續(xù)添加Fe3O4@Au/MOF時(shí)，體系的|Ipa|依然上升但上升速度逐漸變慢，是因?yàn)楫?dāng)體系中存在大量的Fe3O4@Au/MOF時(shí)，納米粒子會(huì)進(jìn)一步聚集，導(dǎo)致復(fù)合酶的催化活性逐漸降低。因此選擇模擬酶添加量0.10、0.125和0.150 g參與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。圖5c中鄰苯二酚的|Ipa|隨著掃描速率的增加而不斷增加，這進(jìn)一步證明了鄰苯二酚在GCE上的電化學(xué)過(guò)程是擴(kuò)散控制過(guò)程[21]。從0.08 V/s到0.1 V/s的上升速率已經(jīng)明顯降低，故沒(méi)有必要研究超過(guò)0.1 V/s的掃描速率。因此選擇了0.06、0.08和0.1 V/s三個(gè)級(jí)別，參加正交設(shè)計(jì)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。由圖5d可以看出，氧化電流峰值在pH=5時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，隨著pH值的不斷增加，當(dāng)pH值在5～8范圍內(nèi)變化時(shí)，|Ipa|明顯呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)橘|(zhì)子參與了體系中的氧化還原反應(yīng)[22]，隨著pH值的增加，體系中的質(zhì)子持續(xù)減少，所以系統(tǒng)中的電子轉(zhuǎn)移量和電化學(xué)反應(yīng)都減少了。根據(jù)結(jié)果可知，酸性和堿性環(huán)境都會(huì)抑制反應(yīng)的進(jìn)行。因此，選擇pH值4.0、5.0和6.0繼續(xù)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化Fe3O4@Au/MOF模擬酶電化學(xué)檢測(cè)體系

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇溫度(A因素)、Fe3O4@Au/MOF添加量(B因素)、掃描速率(C因素)和pH值(D因素)4種因素進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的影響。測(cè)定指標(biāo)為氧化峰電流絕對(duì)值μA，用L9(34)正交表優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。如表1所示，正交試驗(yàn)分析的結(jié)果表明，最佳組合為A1B3C3D2，即反應(yīng)溫度為60 ℃，F(xiàn)e3O4@Au/MOF添加量為0.15 g，掃描速率為0.1 V/s，pH值為5.0；根據(jù)結(jié)果可知，掃描速率是影響體系的主要因素，H2O2濃度、添加量和pH對(duì)鄰苯二酚含量的測(cè)定也有相應(yīng)的影響。在最佳條件下進(jìn)行了平行試驗(yàn)，結(jié)果表明，該Fe3O4@Au/MOF模擬酶電化學(xué)檢測(cè)體系具有良好的精密度。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

圖6 不同濃度鄰苯二酚的CV曲線(a)及檢測(cè)鄰苯二酚的工作曲線(b)Fig.6 CV curves of the different concentrations of catechol (a) and the calibration curve for the detection of catechol(b)

2.5 電化學(xué)檢測(cè)鄰苯二酚工作曲線及回收率

在最佳檢測(cè)條件檢測(cè)了不同濃度鄰苯二酚在系統(tǒng)中的氧化還原反應(yīng)行為。如圖6a所示，隨著鄰苯二酚的濃度從0.001到0.1 mmol/L的增加，|Ipa|也呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。此外，從圖6b可以看出，鄰苯二酚在0.001 到0.1 mmol/L的濃度范圍內(nèi)與|Ipa|有良好的線性關(guān)系，工作曲線的回歸方程為|Ipa|=2 048.5c+67.83，R2=0.9912。同時(shí)檢測(cè)限為1.12×10-7mol/L(S/N=3)，回收率在98.8%～105.1%之間。結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4@Au/MOF模擬酶催化的電化學(xué)檢測(cè)體系對(duì)檢測(cè)鄰苯二酚具有較高的靈敏度和精密度。

2.7 電化學(xué)檢測(cè)鄰苯二酚的抗干擾性研究

在最佳檢測(cè)條件下，研究模擬食品廢水中濃度為10 mmol/L的6種常見(jiàn)物質(zhì)蔗糖、葡萄糖、CaCl2、NaCl、KCl和MgSO4，作為干擾物質(zhì)來(lái)評(píng)估體系的抗干擾性能。干擾物質(zhì)的濃度是鄰苯二酚的100倍。如圖7所示，與較高濃度的干擾物質(zhì)相比，檢測(cè)體系對(duì)鄰苯二酚顯示出明顯的電流響應(yīng)。這表明，基于Fe3O4@Au/MOF模擬酶的電化學(xué)檢測(cè)體系在檢測(cè)鄰苯二酚時(shí)表現(xiàn)出良好的選擇性和抗干擾性能。

圖7 鄰苯二酚檢測(cè)體系的抗干擾性Fig.7 Interference resistance of the catechol detection system

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

將優(yōu)化后的電化學(xué)檢測(cè)體系應(yīng)用于實(shí)際樣品中鄰苯二酚的檢測(cè)，選擇在飲用水中加入不同濃度的鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表2所示，標(biāo)準(zhǔn)品的回收率為95.5%～106.3%，RSD小于2.05%，說(shuō)明該電化學(xué)檢測(cè)體系對(duì)實(shí)際樣品具有良好的添加回收率和精確度，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)際樣品中鄰苯二酚的檢測(cè)。

表2 實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

本文成功構(gòu)建了基于Fe3O4@Au/MOF的電化學(xué)生物傳感器，該傳感器將電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)與金屬有機(jī)框架模擬酶相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)鄰苯二酚的高效、定量分析檢測(cè)。在H2O2的存在下通過(guò)自組裝方法合成的Fe3O4@Au/MOF，可以催化鄰苯二酚的氧化還原反應(yīng)。該電化學(xué)傳感器表現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏度和對(duì)共存分子更強(qiáng)的抗干擾能力，并且對(duì)鄰苯二酚具有良好的電化學(xué)響應(yīng)線性關(guān)系及回收率，可應(yīng)用于實(shí)際樣品飲用水的檢測(cè)。因此，F(xiàn)e3O4@Au/MOF電化學(xué)生物傳感器具有優(yōu)異的檢測(cè)環(huán)境污染物的潛力。