王福紅 李銀塔 劉希鳳

1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 山東濰坊 261061 2.威海海洋職業(yè)學院 山東榮成 264300

副溶血性弧菌又稱嗜鹽弧菌，為革蘭氏陰性桿菌，呈絲狀、弧狀、桿狀等多種形狀，無芽孢。副溶血性弧菌屬于一種海洋細菌，主要存在于近海岸的海水、海底沉積物，以及魚、蝦、貝殼、蟹以及海藻等海產品中。在生產過程中，海產品由于殺菌不徹底、烹調加熱不足等因素容易造成交叉污染，人們食用含有副溶血性弧菌的食物，從而導致食物中毒。

近年來，利用蝦蟹殼為主要原料制備的海鮮調味料正越來越受到關注，蝦蟹殼是水產工業(yè)加工的固體廢棄物，將其加工成海鮮調味料，不僅減少生態(tài)環(huán)境污染，還可作為食品添加劑應用于肉類灌腸制品中，改善制品風味，滿足不同群體的消費需求。然而海鮮調味料制備過程若衛(wèi)生處理不當，會引起肉類灌腸制品中副溶血性弧菌污染[1]。據(jù)統(tǒng)計，副溶血性弧菌引起的食物中毒在中國細菌性食物中毒中位居第三，由此菌引發(fā)的衛(wèi)生問題已引起食品行業(yè)的高度重視[2]。

通過對基于海鮮調味料的不同肉類灌腸制品中副溶血性弧菌進行定性和定量的檢測分析[3]，以期為開發(fā)新型海鮮肉類灌腸制品，并控制其致病菌的污染，提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

3個生產批次、2種不同肉類灌腸制品(蟹味親親腸和蝦味旺旺腸)共120份樣品，均來自濰坊市中百大廚房肉制品有限公司。

1.1.2 試劑

氧化酶試劑、革蘭氏染色液、ONPG試劑、V-P試劑，均購自北京陸橋技術股份有限公司；

3%Nacl溶液，由山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院實驗室自行配置。

1.1.3 培養(yǎng)基

3%Nacl堿性蛋白胨水、TCBS瓊脂平板、3%Nacl胰蛋白胨大豆瓊脂平板、3%Nacl三糖鐵瓊脂斜面、3%Nacl甘露醇試驗培養(yǎng)基、3%Nacl賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、3%Nacl MR-VP培養(yǎng)基，均購于北京陸橋技術有限責任公司；

嗜鹽性試驗培養(yǎng)基(0%、6%、8%和10%不同Nacl濃度的胰胨水)，由山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院實驗室自行配置。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

無菌操作，稱取25g海鮮肉類灌腸制品，加入盛有225mL 3%Nacl堿性蛋白胨水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1～2min。

1.2.2 增菌

1.2.2.1 定性檢測

將制備的1∶10樣品勻液于36±1℃培養(yǎng)8～18h。

1.2.2.2 定量檢測

用無菌刻度吸管吸取1∶10樣品勻液1mL，注入含有9mL 3%Nacl堿性蛋白胨水的試管內，振搖試管混勻，制成1∶100的樣品勻液。另取一支1mL無菌刻度吸管，按上述操作程序，制成1∶1 000的樣品勻液。在做10倍遞增稀釋的同時，每個稀釋度分別接種3管3%Nacl堿性蛋白胨水，每管接種1mL，并做好標記。置36±1℃恒溫箱內，培養(yǎng)8～18h。

1.2.3 分離

對所有顯示生長(變渾濁)的增菌液，用接種環(huán)沾取一環(huán)增菌液，于TCBS平板上劃線分離，36±1℃培養(yǎng)18～24h。

1.2.4 純培養(yǎng)

每個有可疑菌落生長的平板上挑取至少3個，分別劃線接種3%Nacl胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36±1℃培養(yǎng)18～24h。

1.2.5 初步鑒定

1.2.5.1 氧化酶試驗

用無菌細玻璃棒挑取新鮮純培養(yǎng)的單個菌落，涂布在氧化酶試劑濕潤的濾紙上，10s內觀察顏色變化。

1.2.5.2 涂片染色鏡檢

將可疑菌落涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢，觀察其形態(tài)及染色特性。

1.2.5.3 3%Nacl三糖鐵試驗

挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，接種3%Nacl三糖鐵瓊脂斜面，接種時先斜面劃線后穿刺底層，36±1℃培養(yǎng)24h觀察結果。

1.2.5.4 嗜鹽性試驗

挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，分別接種0%、6%、8%和10%的不同Nacl濃度的胰胨水，36±1℃培養(yǎng)24h，觀察液體混濁情況。

1.2.6 確定鑒定

1.2.6.1 3%Nacl甘露醇試驗

取純培養(yǎng)物接種含3%Nacl的甘露醇培養(yǎng)基，36±1℃培養(yǎng)24～48h后觀察結果。

1.2.6.2 3%Nacl賴氨酸脫羧酶試驗

取純培養(yǎng)物接種含3%Nacl的賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基，36±1℃培養(yǎng)24～48h后觀察結果。

1.2.6.3 3%Nacl V-P試驗

取純培養(yǎng)物接種含3%Nacl的MR-VP培養(yǎng)基，36±1℃培養(yǎng)24～48h后，向培養(yǎng)基中加V-P甲液和V-P乙液各2滴，輕輕搖動，觀察結果。

1.2.6.4 ONPG試驗

挑取3%Nacl三糖鐵瓊脂隔夜培養(yǎng)物1滿環(huán)，接種于0.25mL 3%Nacl溶液，在通風櫥中滴加1滴甲苯，搖勻后，置37℃水浴5min，加0.25mL ONPG溶液，36±1℃培養(yǎng)24h后觀察結果。

2 結果

2.1 菌落形態(tài)

TCBS平板上可疑菌落呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質感，直徑2～3mm。

2.2 鑒定結果

2.2.1 氧化酶試驗結果

濾紙在10s之內呈現(xiàn)粉紅或紫紅色，為陽性結果。

2.2.2 涂片染色鏡檢結果

革蘭氏陰性菌，菌體呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，未見有芽孢。

2.2.3 3%Nacl三糖鐵試驗結果

培養(yǎng)基斜面顏色不變或紅色加深，底層變黃不變黑，有動力，無氣體產生。

2.2.4 嗜鹽性試驗結果

在6%Nacl和8%Nacl的胰胨水中生長旺盛，無Nacl和10%Nacl的胰胨水中微弱生長或不生長。

2.2.5 3%Nacl甘露醇試驗結果

培養(yǎng)基變黃，為陽性結果。

2.2.6 3%Nacl賴氨酸脫羧酶試驗結果

培養(yǎng)基紫色，為陽性結果。

2.2.7 3%Nacl V-P試驗結果

培養(yǎng)基未呈現(xiàn)粉紅，為陰性結果。

2.2.8 ONPG試驗結果

溶液不變色，為陰性結果。

2.3 不同批次海鮮肉類灌腸制品中副溶血性弧菌定性、定量檢測結果

副溶血性弧菌在TCBS平板上的可疑菌落呈圓形、半透明、表面光滑、綠色。副溶血性弧菌的生化性狀見表1所示。

表1 副溶血性弧菌的生化性狀

根據(jù)檢出的可疑菌落生化性狀進行結果報告，不同批次海鮮肉類灌腸制品中副溶血性弧菌定性、定量檢測結果見表2所示。

從表2可知：蟹味親親腸有2個生產批次檢出副溶血性弧菌各1株，蝦味旺旺腸3個生產批次均未檢出副溶血性弧菌，定性檢測結果陽性樣品占比為1.66%；第1個生產批次蟹味親親腸陽性樣品中副溶血性弧菌MPN值是3MPN/g，第2個生產批次蟹味親親腸陽性樣品中副溶血性弧菌MPN值是3.6MPN/g。

表2 不同批次海鮮肉類灌腸制品中副溶血性弧菌定性、定量檢測結果

本次檢測結果與試生產時的相比(2022年6月試生產的海鮮肉類灌腸制品中，蟹味親親腸和蝦味旺旺腸共60份樣品中，檢出3株副溶血性弧菌，其檢測方法與本次檢測相同，參考GB 4789.7-2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》)，陽性樣品占比從5%下降為1.66%，陽性樣品占比下降了3.34%。

3 討論

(1)在3個生產批次的120份海鮮肉類灌腸制品中共分離出3株弧菌，經菌落形態(tài)觀察、染色特性觀察、生化試驗等證實分離出的3株疑似弧菌有2株為副溶血性弧菌菌株；同時進行定量檢測，其中1份蟹味親親腸陽性樣品中副溶血性弧菌MPN值是3MPN/g，另1份陽性樣品中副溶血性弧菌MPN值是3.6MPN/g。因本實驗室檢測條件有限，未對分離到的副溶血性弧菌菌株使用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進一步鑒定。

(2)副溶血性弧菌又稱嗜鹽弧菌，是一種海洋性細菌，存在于海水和海產品中。蟹味親親腸由于生產過程中殺菌不徹底、烹調加熱不足等造成交叉污染[4]，存在副溶血性弧菌菌株。本菌是致病性的菌株，可引起食物中毒。中毒癥狀以急性發(fā)病，腹痛、腹瀉、嘔吐等為主，亦有大便膿血，一般3～5d天痊愈，但重癥者亦可造成脫水、休克。中毒的發(fā)生無年齡、種族的差異[1]。

(3)本次檢測結果與前期試生產的海鮮肉類灌腸制品相比，陽性樣品占比下降3.34%。這可能與正式投產后調整殺菌溫度、時間及加強衛(wèi)生管理有關。

本實驗只對基于海鮮調味料的肉類灌腸制品中副溶血性弧菌進行了檢驗，基于海鮮調味料的肉類灌腸制品中是否存在其它致病菌，還有待進一步研究鑒定。