劉俊 尹銳 李艷兵

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院脊柱外科診療中心，湖北 恩施 445000)

脊索瘤是一種罕見的原發(fā)性骨腫瘤，起源于胚胎殘余的脊索組織，占所有骨惡性腫瘤的1%～4%〔1〕。盡管脊索瘤被認(rèn)為是較低級別的惡性腫瘤，但其復(fù)發(fā)率很高，并且可轉(zhuǎn)移到附近的組織〔2〕。目前治療脊索瘤最有效的方法是外科手術(shù)切除，然而，由于其解剖學(xué)位置，通常不可能進(jìn)行完整的整塊切除，且患者在手術(shù)后很容易復(fù)發(fā)〔3〕。因此，迫切需要探索脊索瘤患者的新型治療靶標(biāo)。微小RNA(miRNA)是一類高度保守的小型非編碼RNA，其長度為17～25個核苷酸，可通過部分互補(bǔ)結(jié)合靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)抑制其翻譯或促進(jìn)靶基因的降解。miRNA的表達(dá)失調(diào)在各種癌癥(包括脊索瘤)中作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔4，5〕。miRNA作為一種新的、非侵入性的生物標(biāo)志物，可以在腫瘤的診斷及治療方面提供重要指導(dǎo)。目前研究顯示，miR-21-3p在卵巢癌、喉癌，乳腺癌等多種腫瘤患者中的表達(dá)異常升高，促進(jìn)癌癥的進(jìn)展〔6～8〕。Chen等〔9〕通過微陣列分析脊索瘤中差異表達(dá)的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21-3p在脊索瘤中呈上調(diào)表達(dá)，然而miR-21-3p在脊索瘤中的作用及機(jī)制尚不清楚。本實驗探究miR-21-3p對脊索瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的影響及可能的機(jī)制，以期為脊索瘤的診治提供新的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本 脊索瘤和配對癌旁正常組織標(biāo)本采集于恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，標(biāo)本從經(jīng)手術(shù)切除脊索瘤的患者中獲得，脊索瘤標(biāo)本均經(jīng)病理科審核確認(rèn)。入組患者在手術(shù)切除腫瘤病灶之前均未接受任何化學(xué)療法或放射療法。在參加本研究之前，每位患者都簽署了書面知情同意書。本研究得到恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2主要試劑 脊索瘤細(xì)胞系U-CH1從美國菌種保藏中心獲得；IMDM-RPMI培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗從美國Gibco公司獲得；胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑從美國Invitrogen公司獲得；MTT試劑、二甲基亞砜(DMSO)從美國Sigma公司獲得；miR-21-3p mimics、mimics NC、miR-21-3p inhibitors、inhibitors NC均從廣州市銳博生物科技有限公司獲得；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室、基質(zhì)膠從美國Corning公司獲得；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒從日本TaKaRa公司獲得；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒、結(jié)晶紫染色液從碧云天生物技術(shù)研究所獲得；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒從美國Promega公司獲得；RNF-11、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)抗體從美國Abcam公司獲得；辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG從北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司獲得；膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒從美國BD公司獲得；RNF-11野生型(RNF-11-Wt)和RNF-11突變型(RNF-11-Mut)熒光素酶重組載體質(zhì)粒上海生工生物工程有限公司獲得。

1.3脊索瘤U-CH1細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代 脊索瘤U-CH1細(xì)胞復(fù)蘇后接種到含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗、IMDM-RPMI培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，放置在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置為：37℃、5%CO2、100%飽和濕度。在顯微鏡下觀察U-CH1細(xì)胞生長情況，待懸浮細(xì)胞充滿整個視野時，使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞1 000 r/min離心5 min，棄上清培養(yǎng)液，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，分裝后加入新鮮含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的IMDM-RPMI培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 處于對數(shù)生長期的U-CH1細(xì)胞以胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞制成濃度為5×106/ml的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液種植到6孔板中，每孔接種200 μl，放置到細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞生長至60%匯合時，參照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000使用說明書將miR-21-3p mimics或mimics NC轉(zhuǎn)染至U-CH1細(xì)胞，按照轉(zhuǎn)染說明在轉(zhuǎn)染6 h后將原培養(yǎng)液更換成含血清的培養(yǎng)液，放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗檢測。其中轉(zhuǎn)染miR-21-3p mimics的U-CH1細(xì)胞命名為anti-miR-21-3p組，轉(zhuǎn)染mimics NC的U-CH1細(xì)胞命名為anti-NC組，未行轉(zhuǎn)染的U-CH1細(xì)胞命名為Blank組。

1.5qRT-PCR實驗 將待測組織標(biāo)本研磨成粉末，收集待測U-CH1細(xì)胞，分別向組織和細(xì)胞中加入Trizol試劑，抽提總RNA，使用微量核酸檢測儀測定RNA的純度和濃度，選擇合格的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，具體步驟參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。合成的cDNA檢測其濃度，調(diào)整cDNA的濃度并將其作為模板，使用SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，miR-21-3p的相對表達(dá)量以U6為內(nèi)參，RNF-11、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的相對表達(dá)量以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)結(jié)束后以2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。引物：RNF-11正義鏈：5′-ACATCTCCCTGCTTCACGAG-3′,反義鏈：5′-GGGTGGTAGACTGGAACTGG-3′；E-cadherin正義鏈：5′-TCCATTTCTTGGTCTACGCC-3′,反義鏈：5′-CACCTTCAGCCATCCTGTTT-3′；N-cadherin正義鏈：5′-GTGCCATTAGCCAAGGGAATTCAGC-3′,反義鏈：5′-GCGTTCCTGTTCCACTCATAGGAGG-3′；Vimentin正義鏈：5′-GGCTCGTCACCTTCGTGAAT-3′,反義鏈：5′-TCAATGTCAAGGGCCATCTTAA-3′；U6正義鏈：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反義鏈：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH正義鏈：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3′,反義鏈：5′-CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3′。

1.6MTT實驗 用胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的脊索瘤U-CH1細(xì)胞，將細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞貼壁后按照上述1.4的方法轉(zhuǎn)染和分組，轉(zhuǎn)染48 h后分別向各孔細(xì)胞中添加濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去上清液，再向細(xì)胞中加入150 μl DMSO，于震蕩儀上振蕩10 min，待結(jié)晶沉淀完全溶解后，在全自動酶聯(lián)免疫檢測儀上分析各孔細(xì)胞的光密度(OD)值，以不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的對照孔進(jìn)行調(diào)零。

1.7克隆形成實驗 3組脊索瘤U-CH1細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞以新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后接種到60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞培養(yǎng)皿放置在37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)14 d后除去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞，加入1 ml甲醇固定15 min，流水下洗去甲醇，再加入1 ml Gimsa染液染色30 min，流水洗去染液，使用顯微鏡觀察并計數(shù)大于50個的細(xì)胞克隆。

1.8流式細(xì)胞術(shù) 3組U-CH1細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，以預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞約1×105個，向細(xì)胞中加入100 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，依次向細(xì)胞懸液中添加AnnexinⅤ-FITC和PI染液各5 μl，放置在室溫下避光孵育15 min，在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測，檢測結(jié)果使用CELL Quest軟件分析細(xì)胞凋亡情況。

1.9Transwell實驗 收集轉(zhuǎn)染后的U-CH1細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制成3×104/ml的單細(xì)胞懸液，再以基質(zhì)膠包被的Transwell小室的上室中加入細(xì)胞懸液200 μl，在下室加入含血清的培養(yǎng)液600 μl，將小室放置在37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h，取出小室，用棉簽擦去上室未穿膜的細(xì)胞，以甲醛固定，隨后以結(jié)晶紫染色，放置在顯微鏡下隨機(jī)選5個視野觀察并統(tǒng)計侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.10劃痕實驗 轉(zhuǎn)染后的3組U-CH1細(xì)胞生長至單層匯合時進(jìn)行劃痕實驗，即使用滅菌的200 μl移液槍槍頭垂直于細(xì)胞培養(yǎng)板劃線，被劃下的細(xì)胞用PBS洗去，加入不含血清的培養(yǎng)液，放置在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)0 h和48 h時分別用顯微鏡觀察細(xì)胞劃痕寬度，計算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.11Western印跡實驗 收集轉(zhuǎn)染48 h的3組U-CH1細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液在冰上提取總蛋白，蛋白樣品采用BCA法進(jìn)行定量，在蛋白中加入上樣緩沖液，沸水浴致蛋白變性，取40 μg蛋白樣品加樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，隨后電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，PVDF膜浸潤在含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫孵育2 h，取出膜并用TBST漂洗3次，加入相應(yīng)一抗，其中RNF-11一抗1∶800稀釋，E-cadherin一抗1∶500稀釋，N-cadherin一抗1∶500稀釋，Vimentin一抗1∶500稀釋，4℃過夜孵育，取出膜并用TBST漂洗3次，加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h，以ECL顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，以GAPDH標(biāo)定，用Imag J軟件分析各組U-CH1細(xì)胞中目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.12雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?將RNF-11-Wt和RNF-11-Mut熒光素酶重組載體質(zhì)粒分別與miR-21-3p mimics和或mimics NC共轉(zhuǎn)染至U-CH1細(xì)胞，放置在37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒使用說明書對細(xì)胞進(jìn)行檢測，獲得螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以二者比值表示細(xì)胞的相對熒光素酶活性。

1.13統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-21-3p在脊索瘤組織中表達(dá)上調(diào) 與癌旁組織相比，脊索瘤組織中miR-21-3p表達(dá)明顯上調(diào)(1.00±0.09 vs 3.61±0.34,P<0.05)。

2.2轉(zhuǎn)染miR-21-3p inhibitors對U-CH1細(xì)胞中miR-21-3p表達(dá)的影響 與Blank組相比，anti-miR-21-3p組U-CH1細(xì)胞中miR-21-3p的表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，anti-NC組miR-21-3p的表達(dá)量變化差異不顯著(P>0.05)，見表1。

2.3抑制miR-21-3p對U-CH1細(xì)胞增殖能力的影響 與Blank組相比，anti-miR-21-3p組U-CH1細(xì)胞OD值明顯下降(P<0.05)，克隆形成數(shù)明顯減少(P<0.05)，anti-NC組細(xì)胞OD值和克隆形成數(shù)變化差異均不顯著(P>0.05)，見表1、圖1。

表1 各組U-CH1細(xì)胞OD值、克隆形成數(shù)、miR-21-3p表達(dá)量、凋亡率、侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移率比較

圖1 克隆形成實驗檢測各組U-CH1細(xì)胞克隆形成能力(Gimsa染色，×200)

2.4抑制miR-21-3p對U-CH1細(xì)胞凋亡能力的影響 與Blank組相比，anti-miR-21-3p組U-CH1細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，anti-NC組細(xì)胞凋亡率差異不顯著(P>0.05)，見表1、圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組U-CH1細(xì)胞凋亡情況

2.5抑制miR-21-3p對U-CH1細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響 與Blank組相比，anti-miR-21-3p組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，細(xì)胞遷移率明顯降低(P<0.05)，而anti-NC組侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率差異均不顯著(P>0.05)，見表1、圖3。

A：Transwell實驗檢測3組U-CH1細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×200)；B：劃痕實驗檢測3組U-CH1細(xì)胞遷移能力(×200)圖3 3組U-CH1細(xì)胞侵襲和遷移能力比較

2.6抑制miR-21-3p對U-CH1細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)能力的影響 與Blank組相比，anti-miR-21-3p組U-CH1細(xì)胞中E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，anti-NC組E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)差異均不顯著(P>0.05)，見表2、圖4。

表2 各組U-CH1細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)比較

圖4 Western印跡檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)

2.7miR-21-3p靶向RNF-11關(guān)系的驗證 采用TargetScan軟件預(yù)測miR-21-3p的靶基因，結(jié)果顯示，RNF-11的3′UTR中存在與miR-21-3p互補(bǔ)的序列(圖5)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，相較于miR-NC組過表達(dá)miR-21-3p后在轉(zhuǎn)染RNF-11-Wt的U-CH1細(xì)胞相對熒光素酶活性明顯降低(1.00±0.03 vs 0.41±0.07,P<0.05)，而轉(zhuǎn)染RNF-11-Mut的U-CH1細(xì)胞相對熒光素酶活性變化不明顯(1.00±0.07 vs 0.97±0.08,P>0.05)。與Blank組相比，anti-miR-21-3p組U-CH1細(xì)胞中RNF-11 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，anti-NC組中RNF-11 mRNA和蛋白的表達(dá)差異均不顯著(P>0.05)，見圖6、表3。

圖5 生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測miR-21-3p與RNF-11的靶向結(jié)合位點

圖6 Western印跡檢測RNF-11蛋白表達(dá)

表3 各組U-CH1細(xì)胞中RNF-11 mRNA和蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

脊索瘤早期無明顯的臨床癥狀，晚期往往會破壞周圍的骨骼侵犯鄰近的組織。研究顯示，在許多致癌過程中，miRNA已成為關(guān)鍵調(diào)控因子〔10，11〕。已經(jīng)確定了許多miRNA與幾種類型的人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)〔12，13〕。目前證據(jù)表明，異常表達(dá)的miRNA在脊索瘤的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。例如，Osaka等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-1可靶向調(diào)控Slug的表達(dá)抑制脊索瘤細(xì)胞增殖，而且還能夠抑制細(xì)胞遷移和侵襲活性。Ma等〔15〕實驗發(fā)現(xiàn)，miRNA-124負(fù)調(diào)控iASPP的表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白的變化，并影響脊索瘤細(xì)胞增殖，侵襲和對順鉑的敏感性。有研究顯示，miR-16-5p通過靶向Smad3抑制脊索瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，在脊索瘤進(jìn)展中起著抑癌作用〔16〕。Chen等〔9〕進(jìn)行了miRNA陣列分析以篩選脊索瘤樣品中差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)脊索瘤組織中miR-21-3p的表達(dá)明顯上調(diào)，這意味著miR-21-3p可能起促癌作用。本研究首次證明了miR-21-3p靶向RNF-11在脊索瘤中的促癌作用。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-21-3p在脊索瘤組織中的表達(dá)顯著升高，這與Chen等〔9〕的研究相符。為探究miR-21-3p對脊索瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本實驗通過在脊索瘤U-CH1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染抑制miR-21-3p的表達(dá)，實驗結(jié)果顯示，抑制miR-21-3p的表達(dá)能夠抑制U-CH1細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。腫瘤遷移和侵襲能力對于脊索瘤等癌癥的初始轉(zhuǎn)移過程至關(guān)重要〔17〕。因此抑制遷移和侵襲能力可能會減少脊索瘤常見的局部復(fù)發(fā)，從而提高生存率。研究指出，EMT是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制之一〔18，19〕。當(dāng)EMT發(fā)生時，上皮細(xì)胞表面標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，同時間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)上調(diào)。本實驗結(jié)果顯示，miR-21-3p表達(dá)的抑制減少了脊索瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，這由E-cadherin的表達(dá)升高和N-cadherin和Vimentin的表達(dá)降低所揭示。本實驗證實RNF-11是miR-21-3p的直接靶標(biāo)，并且miR-21-3p在轉(zhuǎn)錄后水平上直接調(diào)節(jié)RNF-11的表達(dá)。RNF-11基因?qū)儆?RING finger 基因家族成員之一，王季〔20〕利用基因芯片技術(shù)探究與脊索瘤發(fā)病相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)RNF-11在脊索瘤組織中表達(dá)顯著下調(diào)，提示RNF-11在脊索瘤中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。以上實驗結(jié)果提示，miR-21-3p靶向調(diào)控RNF-11影響脊索瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為。

綜上所述，miR-21-3p在脊索瘤組織中呈高表達(dá)，下調(diào)miR-21-3p的表達(dá)能夠抑制脊索瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其可能的作用機(jī)制與靶向調(diào)控RNF-11的表達(dá)有關(guān)。miR-21-3p在脊索瘤發(fā)展中具有促癌作用，這可能為脊索瘤的治療提供有希望的預(yù)后和治療策略。