梁志波，劉平英，周有彩，陳必鏈，2，何勇錦，2

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117;2.福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建 福州 350117)

小球藻是地球上最早以光合自養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)方式繁殖的單細(xì)胞微生物之一，其細(xì)胞內(nèi)富含蛋白質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸等生物活性物質(zhì)．這些活性物質(zhì)具有抗氧化、抗病毒、抑菌活性以及提高人體免疫力等多種功效[1]．部分小球藻在黑暗條件下，能夠利用有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)[2-3]．與光自養(yǎng)模式相比，小球藻在異養(yǎng)條件下，可以顯著提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和密度[4]．影響小球藻異養(yǎng)生長(zhǎng)特性的主要因素有[5]：藻種自身異養(yǎng)生長(zhǎng)能力；培養(yǎng)基組成；培養(yǎng)環(huán)境．

當(dāng)前，有多種培養(yǎng)基配方已廣泛運(yùn)用于小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)，以獲得蛋白質(zhì)、淀粉、油脂、色素等目標(biāo)產(chǎn)物[6]．Xie等[7]使用SE培養(yǎng)基，評(píng)估了在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下，小球藻FACHB-8產(chǎn)蛋白質(zhì)的能力，結(jié)果表明，蛋白質(zhì)含量最高可達(dá)44.3%．Xiao等[8]以HA-SK為初始培養(yǎng)基，通過調(diào)控培養(yǎng)基的氮濃度，提高了異養(yǎng)小球藻MBFJNU-17的蛋白質(zhì)含量，達(dá)到60%左右．Yun等[9]以含有不同葡萄糖濃度的BG11培養(yǎng)基，評(píng)估了3株小球藻(KNUA104、KNUA114和KNUA122)，在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下有關(guān)于生物量產(chǎn)率、油脂、蛋白質(zhì)和色素的含量變化．Liu等[10]使用Basal培養(yǎng)基，并添加不同比例的含油酵母，培養(yǎng)2株小球藻(Chlorellapyrenoidosa15-2070和ChlorellavulgarisNIES-227)，以提高生物量和脂質(zhì)產(chǎn)量的潛力．Rosenberg等[11]使用BBM培養(yǎng)基，比較分析3株小球藻(ChlorellasorokinianaUTEX 1230、ChlorellavulgarisUTEX 265 和ChlorellaprotothecoidesUTEX 411)光合自養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)中的生長(zhǎng)速率、生物量產(chǎn)量和脂質(zhì)生產(chǎn)力．

不同的小球藻具有各自獨(dú)特的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成特性．在異養(yǎng)培養(yǎng)過程中，不同培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)元素種類和濃度是影響小球藻生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物合成的主要因素．本文就實(shí)驗(yàn)室分離純化的一株蛋白核小球藻CP-FJ9，研究了在異養(yǎng)培養(yǎng)模式下，不同培養(yǎng)基(SE、HA-SK、BG11、Basal和BBM)對(duì)小球藻CP-FJ9細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的影響；同時(shí)，使用HA-SK培養(yǎng)基在10-L發(fā)酵罐中異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻CP-FJ9，進(jìn)一步評(píng)估小球藻CP-FJ9生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)積累能力，旨在為開發(fā)富含蛋白質(zhì)藻粉原料提供理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 藻種與儀器

1.1.1 藻種

蛋白核小球藻ChlorellapyrenoidosaCP-FJ9，由本實(shí)驗(yàn)室從福建省閩侯縣溪源江分離獲得[12]，保存于含5 g·L-1葡萄糖和18 g·L-1瓊脂的BG11培養(yǎng)基中．

1.1.2 儀器

10 L發(fā)酵罐-FUS10-1853-2(上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司)；高速冷凍離心機(jī)-TG16-WS(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司)；精密分析天平-BS224S(北京賽多利斯系統(tǒng)儀器有限公司)；電熱恒溫干燥箱-DHG-9070A(上海一恒科技有限公司)；紫外分光光度計(jì)-F-4600(日立高新有限公司)；生物傳感分析儀-SBA-40E(山東省科學(xué)院生物研究所)；水浴鍋-DK-S-24(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；高溫蒸汽滅菌鍋-HVE-50(中原機(jī)械有限公司)； 超純水機(jī)-FBZ2002-UP-P(青島富勒姆科技有限公司)；超凈工作臺(tái)-SW-CJ-2G(蘇州凈化有限公司)；pH計(jì)-ST3100(奧豪斯儀器有限公司)等．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

從BG11瓊脂斜面挑取適量小球藻CP-FJ9藻細(xì)胞，轉(zhuǎn)接于含10 g·L-1葡萄糖的BG11培養(yǎng)基中，放置恒溫振蕩搖床培養(yǎng)，搖床溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速150 r·min-1，遮光培養(yǎng)7 d．

1.2.2 培養(yǎng)基

(1)5種不同培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分組成如表1所示．

表1 不同培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分組成Tab.1 The composition of different culture media

(2)土壤提取液制備：取未施過肥的花園土0.5 kg置于燒杯或三角瓶中，加入蒸餾水1 L，瓶口透氣塞封口，在水浴中沸水加熱2 h，冷卻至室溫，在無菌條件下過濾，取上清液，將滅菌蒸餾水加入上清液至總體積1 L，4 ℃保存[7]．

1.2.3 微藻培養(yǎng)

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小球藻CP-FJ9，無菌離心(5 000 r·min-1，5 min)，棄上清，使用適量無菌水，洗滌3次，然后取適量藻體，分別轉(zhuǎn)接到SE、HA-SK、BG11、Basal和BBM培養(yǎng)基中，接種質(zhì)量濃度約為0.3 g·L-1，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行．培養(yǎng)條件設(shè)置搖床溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速150 r·min-1，黑暗培養(yǎng)10 d．

1.2.4 10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

應(yīng)用10 L發(fā)酵罐對(duì)小球藻CP-FJ9進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)．使用HA-SK培養(yǎng)基，發(fā)酵罐裝液量控制在7 L，初始小球藻CP-FJ9生物量為0.4 g·L-1，通氣量為0.84 m3·h-1．當(dāng)藻細(xì)胞停止生長(zhǎng)后，發(fā)酵結(jié)束．測(cè)定藻生長(zhǎng)過程的生物量、蛋白質(zhì)含量以及培養(yǎng)基葡萄糖和尿素的濃度．

1.3 分析測(cè)定

1.3.1 碳源和氮源的測(cè)定

采用生物傳感分析儀SBA-40E測(cè)定培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度．采用水中硝酸鹽氮的測(cè)定方法(紫外分光光度方法)測(cè)定培養(yǎng)基中NO3--N的濃度[13]．采用血尿素氮試劑盒(北京博克斯生物科技有限公司)測(cè)定尿素氮的濃度．

底物的微藻生物量得率(YX/G，g·g-1)，由以下公式估計(jì)：

(1)

其中，ρE和tE分別為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)微藻干生物量(g·L-1)和時(shí)間(d)；ρ0和t0分別為第0天的初始干生物量(g·L-1)和時(shí)間(d)．

1.3.2 培養(yǎng)基pH測(cè)定

采用實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)ST3100測(cè)定pH．

1.3.3 生物量及比生長(zhǎng)速率的測(cè)定

采用細(xì)胞干重法測(cè)定微藻生物量．收集1 mL微藻培養(yǎng)樣品并離心(8 000 r·min-1，10 min)以收集小球藻CP-FJ9細(xì)胞，微藻細(xì)胞用蒸餾水離心洗滌3次，并轉(zhuǎn)移至預(yù)先烘干稱質(zhì)量的玻璃平板，放置80 ℃烘箱干燥至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量并記錄數(shù)據(jù)．其中，微藻細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率μ由公式計(jì)算：

(2)

式中，ρ2為t2時(shí)間的微藻生物量；ρ1為t1時(shí)間的微藻生物量．

1.3.4 細(xì)胞生物大分子的測(cè)定

微藻生物質(zhì)的碳水化合物含量采用苯酚-硫酸法[12]進(jìn)行測(cè)定．蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法(GB 5009.5-2016)分析．油脂含量采用氯仿-甲醇法進(jìn)行測(cè)定[14]．

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

搖瓶和發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次．實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值(N=3)±標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用Microsoft Excel 2010和Origin 8.5軟件進(jìn)行分析，通過單因素方差分析 (ANOVA)檢查平均值之間的顯著差異(P<0.05)．

2 結(jié)果與討論

2.1 不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)小球藻CP-FJ9的生長(zhǎng)情況

SE、Basal、HA-SK、BG11和BBM 5種不同培養(yǎng)基對(duì)小球藻CP-FJ9生物量的影響見圖1a．小球藻CP-FJ9分別在SE、Basal、HA-SK、BG11和BBM培養(yǎng)基中所得最終的生物量為1.55、12.93、11.47、3.97、0.62 g·L-1．桂林等[15]以Basal為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，異養(yǎng)培養(yǎng)蛋白核小球藻15-2070，得到最終生物量約13 g·L-1．Bouyam等[16]使用Basal培養(yǎng)基異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻TISTR 8990，獲得最高生物量10.90 g·L-1．在本研究中，小球藻 CP-FJ9在Basal培養(yǎng)基中最終生物量與桂林等研究獲得生物量水平相當(dāng)，高于Bouyam等研究結(jié)果．這種現(xiàn)象可能與小球藻種類以及培養(yǎng)條件不同有關(guān)[17-18]．

小球藻CP-FJ9在生長(zhǎng)過程的比生長(zhǎng)速率結(jié)果見表2．在5種培養(yǎng)基中，小球藻CP-FJ9在Basal培養(yǎng)基中有最高比生長(zhǎng)速率為0.64 d-1，其次為HA-SK實(shí)驗(yàn)組(0.51 d-1)，再次為BG11培養(yǎng)基(0.31 d-1)．然而，小球藻CP-FJ9在SE和BBM培養(yǎng)基中所得的比生長(zhǎng)速率僅有0.10 d-1和0.02 d-1，顯著低于其他培養(yǎng)基．實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，小球藻CP-FJ9在不同培養(yǎng)基中所表現(xiàn)的生長(zhǎng)性能不同(圖1a)，進(jìn)而導(dǎo)致了其比生長(zhǎng)速率存在明顯差異．因此就生長(zhǎng)能力方面，Basal培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻CP-FJ9，可獲得較多的生物量．

2.2 小球藻CP-FJ9對(duì)培養(yǎng)基碳源和氮源的消耗

圖1b顯示了小球藻CP-FJ9培養(yǎng)過程中葡萄糖的消耗情況．小球藻CP-FJ9可以完全消耗Basal和HA-SK培養(yǎng)基中的葡萄糖．在葡萄糖質(zhì)量濃度分別為20、15、10 g·L-1的BG11、BBM、SE培養(yǎng)基中，小球藻CP-FJ9并沒有充分利用葡萄糖，葡萄糖利用率分別為65.69%、4.11%、43.55%．底物(葡萄糖)的微藻生物量得率YX/G，結(jié)果見表2．由表2可知，小球藻CP-FJ9在Basal和HA-SK培養(yǎng)基中，其YX/G最高，分別為0.33、0.30 g·g-1，沒有顯著性差異．而在BG11、BBM、SE培養(yǎng)基中，小球藻CP-FJ9的YX/G僅為 0.27、0.12、0.27 g·g-1．這可能是在這3種培養(yǎng)基中，小球藻CP-FJ9將較多的能量用于呼吸代謝作用[19]．因此就葡萄糖對(duì)小球藻CP-FJ9細(xì)胞生物量的轉(zhuǎn)換率方面， Basal和HA-SK培養(yǎng)基最適合．

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)小球藻CP-FJ9比生長(zhǎng)速率及底物的微藻生物量得率的影響Tab.2 Effects of different media on specific growth rate of Chlorella pyrenoidosa CP-FJ9 and microalgae biomass yield of substrate

圖1c為小球藻CP-FJ9對(duì)5種培養(yǎng)基氮源的利用情況．小球藻在Basal和HA-SK 利用的氮最多，分別利用1.02 g·L-1氮(利用率97.77%)和1.28 g·L-1的氮(利用率69.51%)．盡管小球藻在HA-SK培養(yǎng)基的生物量比Basal培養(yǎng)基中的低，但是氮的利用量更高，可能原因是小球藻在HA-SK培養(yǎng)基中可以利用更多的氮以合成更多的含氮量較高的產(chǎn)物．在SE培養(yǎng)基中，微藻利用0.04 g·L-1(利用率100%)，然而，在BG11和BBM培養(yǎng)基中，小球藻CP-FJ9未能較好利用氮源，經(jīng)培養(yǎng)10 d后，小球藻培養(yǎng)體系中氮還分別剩余0.20、0.01 g·L-1．這可能原因是， BG11和BBM 2種培養(yǎng)基未能促使小球藻CP-FJ9優(yōu)良生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基中的碳源和氮源利用能力較差．

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)小球藻CP-FJ9的影響Fig.1 Effects of different media on Chlorella pyrenoidosa CP-FJ9

2.3 不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)小球藻CP-FJ9的pH變化情況

pH是微藻生長(zhǎng)過程中重要的影響因子之一．小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基pH過高或過低，會(huì)影響小球藻生長(zhǎng)代謝，例如，影響細(xì)胞對(duì)有機(jī)碳源的吸收和轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)會(huì)改變細(xì)胞膜的通透性，影響一些離子的吸收、代謝物和毒素的排放、某些關(guān)鍵酶的活性，造成細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，甚至死亡[1]．圖1d顯示了小球藻CP-FJ9在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)過程pH的變化情況．由圖1d可知，以尿素為氮源的HA-SK培養(yǎng)基中培養(yǎng)小球藻CP-FJ9，pH的變化幅度小，總體較為穩(wěn)定．周有彩等[20]利用HA-SK培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻MBFJNU-17，培養(yǎng)過程中引發(fā)的pH波動(dòng)較?。緦?shí)驗(yàn)中，以KNO3或NaNO3為氮源的Basal、BG11和SE培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻，pH都呈上升趨勢(shì)．可能原因是，微藻在對(duì)氮源進(jìn)行吸收利用后，大量的陽離子殘留于培養(yǎng)液中生成 K2CO3或Na2CO3等一類弱酸強(qiáng)堿鹽，促使pH升高．以NaNO3為唯一氮源的BBM培養(yǎng)基中，pH從初始的6.11降至5.30，隨后保持不變，可能是因?yàn)樾∏蛟錍P-FJ9在BBM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，NaNO3利用率低，在利用部分葡萄糖后，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH變化[21]．因此就培養(yǎng)pH調(diào)控方面，可以選擇HA-SK培養(yǎng)基作為小球藻CP-FJ9的異養(yǎng)培養(yǎng)基，以避免規(guī)?；瘧?yīng)用過程中繁瑣的pH調(diào)控．

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)小球藻CP-FJ9主要組分的影響

小球藻CP-FJ9在5種培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)收集生物量測(cè)定蛋白質(zhì)、碳水化合物和油脂含量，其結(jié)果見如圖2．小球藻CP-FJ9在SE培養(yǎng)基中有最高的碳水化合物含量為47.44%，在HA-SK培養(yǎng)中有最高的蛋白質(zhì)含量為44.82%，在BBM中有最高的油脂含量為37.08%．值得注意的是，在SE培養(yǎng)基中，培養(yǎng)小球藻CP-FJ9至第2 天，培養(yǎng)基中的氮源已全部耗完，在缺氮條件下，小球藻CP-FJ9更傾向于合成碳水化合物．相關(guān)研究表明，氮源消耗完后，微藻可以通過調(diào)控蛋白質(zhì)的碳代謝通量，以促進(jìn)碳水化合物或油脂生物合成[22]．Xiao等[8]研究發(fā)現(xiàn)，小球藻Chlorellasp.MBFJNU-17在高碳低氮條件下，與氮源消耗和氨基酸合成的相關(guān)酶基因下調(diào)，蛋白質(zhì)含量降低，淀粉生物合成基因的表達(dá)程度上調(diào)，碳水化合物快速積累(55.01%)．

圖2 不同培養(yǎng)基對(duì)小球藻CP-FJ9理化成分的影響Fig.2 Effects of different media on physical and chemical composition of Chlorella pyrenoidosa CP-FJ9

通過對(duì)比5種不同培養(yǎng)基配方，營(yíng)養(yǎng)元素相對(duì)較為豐富的 HA-SK和Basal培養(yǎng)基，培養(yǎng)得到的小球藻CP-FJ9蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高；而氮源濃度低，碳氮比高的SE、BG11和BBM培養(yǎng)基，小球藻CP-FJ9所合成碳水化合物和油脂含量較高．因此選擇碳源和氮源濃度高，營(yíng)養(yǎng)元素含量豐富的培養(yǎng)基，例如HA-SK培養(yǎng)基，在一定程度上，不僅能夠促進(jìn)小球藻CP-FJ9生長(zhǎng)，而且有利于提高蛋白質(zhì)含量．

本實(shí)驗(yàn)在異養(yǎng)模式下，采用SE、Basal、HA-SK、BG11和BBM 5種培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻CP-FJ9，經(jīng)10 d異養(yǎng)發(fā)酵后，小球藻CP-FJ9在 Basal培養(yǎng)基中可獲得最高生物量(12.93 g·L-1)，在HA-SK培養(yǎng)基中最有利于蛋白質(zhì)合成(44.82%)．將小球藻CP-FJ9在5種培養(yǎng)基異養(yǎng)培養(yǎng)的生物量和主要產(chǎn)物含量及產(chǎn)量，與已報(bào)道異養(yǎng)小球藻藻株的研究結(jié)果進(jìn)行了比較．由表3可知，小球藻CP-FJ9在Basal培養(yǎng)基中獲得的最高生物量為12.93 g·L-1，低于魏東等[23]培養(yǎng)蛋白核小球藻Chlorellapyrenoidosa獲得的生物量，可能原因是所用培養(yǎng)基的碳源濃度不同以及藻的種間差異．小球藻CP-FJ9在HA-SK培養(yǎng)基中獲得的生物量和蛋白質(zhì)含量稍低于周有彩等[20]的報(bào)道．周有彩等優(yōu)化了HA-SK培養(yǎng)基，提升了藻生物量和蛋白質(zhì)含量．因此今后的工作還可以根據(jù)小球藻CP-FJ9的特性進(jìn)一步優(yōu)化所用培養(yǎng)基，以提高藻生物量和蛋白質(zhì)的生產(chǎn)效率．

表3 不同小球藻在異養(yǎng)條件下生物量和主要產(chǎn)物含量及產(chǎn)量Tab.3 The biomass, main product content and yield of different Chlorella species under heterotrophic conditions

2.5 10 L發(fā)酵罐異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻CP-FJ9

用10 L發(fā)酵罐進(jìn)一步評(píng)估小球藻CP-FJ9在HA-SK培養(yǎng)基中生產(chǎn)富含蛋白質(zhì)生物質(zhì)的潛力．小球藻CP-FJ9在HA-SK 培養(yǎng)基中進(jìn)行分批發(fā)酵，生物量、葡萄糖和尿素消耗以及細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的結(jié)果見圖3．小球藻CP-FJ9在0～24 h處于延滯期，24 h后生物量快速生長(zhǎng)，在48 h時(shí)達(dá)到最大值22.85 g·L-1，隨后保持相對(duì)穩(wěn)定．10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)所得的小球藻最高生物量高于搖瓶獲得的值(12.90 g·L-1)．這可能原因是，與 250 mL 搖瓶相比，10 L發(fā)酵罐有更好的溶氧性能，能有效促進(jìn)微藻生長(zhǎng)，也提高了細(xì)胞對(duì)葡萄糖和尿素的吸收轉(zhuǎn)化．從圖3可以看到，在 10 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)的小球藻CP-FJ9能夠在72 h內(nèi)完全消耗完葡萄糖和尿素．培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，小球藻CP-FJ9最終生物量為20.05 g·L-1，細(xì)胞蛋白質(zhì)含量為49.88%．

圖3 小球藻CP-FJ9在10 L 發(fā)酵罐中生長(zhǎng)和代謝情況Fig.3 Growth and metabolism of Chlorella pyrenoidosa CP-FJ9 in 10 L fermenter

3 結(jié)論

本文研究了SE、Basal、HA-SK、BG11和BBM培養(yǎng)基對(duì)小球藻CP-FJ9生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的影響．通過對(duì)比，小球藻CP-FJ9在Basal培養(yǎng)基中可獲得最大生物量12.93 g·L-1，在HA-SK培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)產(chǎn)量最高為5.14 g·L-1，在SE培養(yǎng)基中碳水化合物的含量最高為47.44%，在BBM培養(yǎng)基中，可獲得最大油脂含量為37.08%．利用10 L發(fā)酵罐驗(yàn)證了HA-SK培養(yǎng)基異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻CP-FJ9，得到結(jié)果最終生物量為20.05 g·L-1，蛋白質(zhì)含量為49.06%．結(jié)果表明，小球藻CP-FJ9是一株有潛力用于開發(fā)富含蛋白質(zhì)的優(yōu)良藻種．