去屑洗發(fā)露中羥吡啶酮的高效液相色譜法檢測及質(zhì)譜確證

聶明霞，汪 毅，梁文耀，賈 芳，李 露，夏澤敏，陳彥君，譚建華

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，國家化妝品質(zhì)量檢驗檢測中心，廣東 廣州 511447）

羥吡啶酮為1-羥基-2-吡啶酮類化合物，因含有與曲霉酸相似的異羥肟酸結(jié)構(gòu)而具有抑菌作用［1］。有報道稱該類化合物可用來治療溢脂性皮炎［2］、口腔黏膜疾病［3］及由真菌、細菌引起的皮膚感染疾?。?］，其作為配位體與2-氨乙基等化合物合成的鐵離子螯合劑也具有抑菌效果［5］。然而，相關(guān)毒理學(xué)試驗表明該化合物具有潛在的致突變性［6-7］。因此，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）［8］中明確規(guī)定，禁止在化妝品中使用羥吡啶酮。但目前尚無化妝品中羥吡啶酮的測定方法報道。

羥吡啶酮的極性強，反相色譜保留能力較弱，且和2-羥基吡啶-N-氧化物（HOPO）存在互變異構(gòu)現(xiàn)象［9-10］（圖1）。而HOPO與色譜系統(tǒng)中的金屬離子可能發(fā)生較強的絡(luò)合作用，兩種互變異構(gòu)形態(tài)在色譜柱上的異構(gòu)互變會引起色譜峰嚴重拖尾或分峰現(xiàn)象，從而給色譜分析帶來困難。本文以去屑洗發(fā)露為考察基質(zhì)，通過優(yōu)化儀器方法及提取條件等，解決了羥吡啶酮難以保留、峰形差和雜質(zhì)干擾等問題。同時，采用化妝品常用的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)［11］，結(jié)合硫酸二甲酯衍生化處理，建立了一種洗發(fā)露中禁用原料羥吡啶酮的快速、準確、靈敏的測定方法和質(zhì)譜確證方法，以為化妝品的安全監(jiān)管提供有效的技術(shù)支撐。

圖1 HOPO兩種形態(tài)的互變異構(gòu)Fig．1 Tautomerization of HOPO

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，配DAD檢測器（美國安捷倫公司）；島津液相色譜儀-SCIEX AB 5500+三重四極桿質(zhì)譜儀（日本島津與美國SCIEX公司）；BSA224S-CW電子天平（德國賽多利斯公司）；MS3 basic渦旋振蕩器（德國IKA公司）；KQ-250DV型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

羥吡啶酮（純度為95．0%，CAS：822-89-8，美國IL及Macklin公司）；2-羥基吡啶-N-氧化物（純度為98．0%，CAS：13161-30-3，美國Aladdin及Mackin公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；草酸、三乙胺（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；硫酸二甲酯（分析純，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）；實驗用純水（18．2 MΩ·cm）由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.2 標準溶液的配制

精密稱取羥吡啶酮對照品約0．1 g（精確至0．1 mg），置于50 mL燒杯中，加適量乙腈溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，混勻，即得質(zhì)量濃度為1 000 mg∕L的羥吡啶酮標準儲備液。

分別精密移取不同體積的標準儲備液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成質(zhì)量濃度分別為1．0、2．0、5．0、10．0、50．0、100．0 mg∕L和10．0、20．0、50．0、100．0、200．0、500．0 μg∕L的標準曲線工作溶液。

1.3 樣品前處理

稱取樣品0．5 g（精確至0．001 g）于10 mL具塞比色管中，加入1 mL乙腈，渦旋30 s使樣品分散，再用乙腈定容至刻度，渦旋30 s后，超聲提取15 min。冷卻至室溫后，上清液過0．22 μm濾膜，待測定。

1.4 儀器分析條件

色譜柱：Waters Atlantis Hilic（4．6 mm × 250 mm × 5 μm）；流動相：950 mL乙腈 + 50 mL 400 mmol∕L草酸溶液；流速：1．0 mL∕min；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃，檢測波長：306 nm。

1.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法

1.5.1 標準曲線衍生制備移取“1．2”中10．0、20．0、50．0、100．0、200．0、500．0 μg∕L的羥吡啶酮標準溶液1 mL于比色管內(nèi)，加入0．5 mL 0．3 mol∕L NaOH 溶液，渦旋30 s后，加入50 μL硫酸二甲酯，渦旋30 s，于37 ℃水浴中加熱15 min后，再加入50 μL三乙胺，渦旋30 s，取衍生后的標準溶液用純水稀釋10倍，過0．22 μm濾膜，待測定。

1.5.2 樣品前處理與衍生方法取“1．3”中的樣液1 mL于比色管中，加入0．5 mL 0．3 mol∕L NaOH溶液，渦旋30 s后，加入50 μL硫酸二甲酯，渦旋30 s，于37 ℃水浴中加熱15 min后，再加入50 μL三乙胺，渦旋30 s，取樣液用純水稀釋10倍，過0．22 μm濾膜，待測定。

1.5.3 液相色譜條件色譜柱：Agilent SB C18（2．1 mm × 100 mm，2．7 μm）；流動相：A為0．1%甲酸水溶液，B為乙腈，等度洗脫，VA∶VB= 9∶1；流速：0．3 mL∕min；進樣量：2．0 μL；柱溫：30 ℃。

1.5.4 質(zhì)譜條件離子源為電噴霧離子源（ESI源）；監(jiān)測模式為正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子化電壓4 500 V；氣簾氣137．8 kPa；噴霧氣344．7 kPa；碰撞氣62．1 kPa；離子源溫度450 ℃；監(jiān)測離子對、碰撞電壓（CE）和去簇電壓（DP）參數(shù)見表1。

表1 羥吡啶酮的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of hydroxypyridone

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器方法的建立

2.1.1 色譜柱的選擇羥吡啶酮的logP值為-0．65，親水性強，極性較大，難以在色譜柱上獲得較好保留，因此對比了幾種規(guī)格相同（4．6 mm × 250 mm × 5 μm）的C18柱（Pronto SIL-C18、Ultimate AQ C18）和Waters Atlantis Hilic色譜柱的效果。以100%水為流動相對2 μg∕mL羥吡啶酮標準溶液進行分析發(fā)現(xiàn)，C18柱對羥吡啶酮的保留較弱，且色譜峰拖尾難以消除，因此難以對低濃度羥吡啶酮準確定量；而使用Hilic色譜柱時目標物的保留時間較使用C18柱有所延長，峰形更加對稱，因此選用Hilic柱進行后續(xù)方法開發(fā)。

2.1.2 檢測波長的選擇采用配備二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀對標準溶液進行檢測，羥吡啶酮的紫外吸收光譜圖顯示，其特征吸收波長為228 nm和305 nm，與用乙醇溶解的羥吡啶酮及其互變異構(gòu)體HOPO的特征吸收波長一致［1］。在實際樣品測試過程中，228 nm波長下的基質(zhì)干擾較大，而羥吡啶酮在305 nm波長處的響應(yīng)值滿足方法靈敏度與穩(wěn)定性要求，因此選擇305 nm作為檢測波長。

2.1.3 流動相的選擇比較了乙腈-水、乙腈-0．1%甲酸水溶液、乙腈-20 mmol∕L醋酸銨水溶液、乙腈（含0．1%甲酸）-甲醇和乙腈-草酸水溶液5種流動相體系對羥吡啶酮的分離效果。結(jié)果顯示，使用前3種流動相對羥吡啶酮進行分析，色譜峰均存在不同程度分峰現(xiàn)象；使用95%乙腈（含0．1%甲酸）-5%甲醇作流動相時，分峰現(xiàn)象有所改善，但拖尾仍然嚴重；采用乙腈-10 mmol∕L草酸水溶液為流動相，羥吡啶酮的分峰和拖尾現(xiàn)象被有效消除，色譜峰形良好。這可能是由于草酸水溶液能夠大大降低色譜柱上殘留金屬離子與化合物的絡(luò)合作用所致。

進一步比較了不同濃度的草酸（5、10、20、40 mmol∕L）對羥吡啶酮的色譜分離效果。結(jié)果顯示，隨著草酸濃度增大，羥吡啶酮的保留時間有所增加，草酸濃度達20 mmol∕L后，保留時間無明顯延長?？紤]到高濃度草酸溶液在高比例乙腈中有析出風(fēng)險，最終選擇950 mL乙腈 + 50 mL 400 mmol∕L草酸溶液為流動相，預(yù)先混合后使用。

2.1.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法由于洗發(fā)水的配方組分復(fù)雜，常用的吡硫鎓鋅、吡羅克酮等去屑劑與羥吡啶酮有相似的特征吸收，僅依靠保留時間和紫外吸收光譜定性可能會因存在干擾而產(chǎn)生假陽性。因此，建立了羥吡啶酮的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法，對陽性樣品或疑似陽性樣品進行確證，以保證檢測結(jié)果的準確性。

直接使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對羥吡啶酮標準樣品進行分析時，其質(zhì)譜響應(yīng)極弱，過高的檢出限無法滿足分析要求。將硫酸二甲酯在堿性條件下與氨基羥基發(fā)生反應(yīng)［7］，使化合物甲基化，可提高電離效率，從而大大增強化合物的質(zhì)譜響應(yīng)，且解決了化合物的分峰拖尾問題，滿足分析確證要求。確證條件見“1．5”。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇比較了不同比例的乙腈-水對羥吡啶酮的提取效果，結(jié)果如圖2所示，當提取溶劑為10%和50%乙腈水時，雜質(zhì)峰及目標化合物的色譜峰嚴重變形。這是由于10%和50%乙腈在Hilic柱上的洗脫能力強于流動相，可能存在溶劑效應(yīng)使峰形展寬。另外，根據(jù)相關(guān)文獻［11］，由于乙腈-水體系極性更大，減弱了目標化合物的分子內(nèi)氫鍵，不利于發(fā)生分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移，反而導(dǎo)致分子間二聚體發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移形成新的化合物，該原因也會導(dǎo)致峰形展寬。而采用純乙腈作為提取溶劑，進行陰性樣品加標實驗時，其回收率均在90%以上且羥吡啶酮的峰形對稱。因此本文采用純乙腈為提取溶劑。

圖2 不同含量乙腈提取的羥吡啶酮色譜圖Fig．2 Chromatograms of hydroxypyridinone extracted with acetonitrile in different proportions

2.2.2 超聲時間的優(yōu)化超聲提取具有操作方便、高效等特點，考察了超聲時間對加標回收率的影響。將樣品渦旋提取后，分別超聲0、5、10、15、20 min，取樣液進行分析。結(jié)果顯示，隨著超聲時間的增加，目標化合物的峰面積有所增加，但超過15 min后，峰面積無明顯增加，所以選擇超聲15 min進行提取。

2.3 線性方程及檢出限

在優(yōu)化條件下，對質(zhì)量濃度為1．0 ～ 100．0 mg∕L的標準工作溶液進行測定，以目標物的峰面積（Y）對其質(zhì)量濃度（X，mg∕L）進行線性回歸分析，獲得線性回歸方程Y= 58．573X -85．464，結(jié)果表明羥吡啶酮在1．0 ～ 100．0 mg∕L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r= 0．999。對樣品進行加標，以3倍信噪比計算方法檢出限（LOD），以10倍信噪比計算方法定量下限（LOQ），羥吡啶酮的LOD和LOQ分別為8．0 μg∕g和20．0 μg∕g，可滿足洗發(fā)水中羥吡啶酮的檢測需求。

2.4 回收率及相對標準偏差

選取去屑洗發(fā)水陰性樣品，分別添加40、100、400 mg∕kg 3個水平的羥吡啶酮標準工作溶液，按照本方法進行前處理和測定，每個水平平行測定6次，計算得到羥吡啶酮的平均回收率為91．8% ～96．7%，相對標準偏差（RSD）為1．3% ～ 3．7%。結(jié)果表明該方法有良好的回收率和精密度。

2.5 吡硫鎓鋅中羥吡啶酮的測定及來源分析

對9個不同批次的吡硫鎓鋅原料使用上述方法進行測定，結(jié)果有8批次檢出羥吡啶酮，含量范圍為28．3 ～ 87．2 mg∕kg。由于羥吡啶酮與HOPO為同一種化合物的互變異構(gòu)體，且羥吡啶酮是較穩(wěn)定的一種存在方式［1］，為進一步探究吡硫鎓鋅中測得目標物的形態(tài)，分別購買IL和Macklin兩個品牌的羥吡啶酮標準品，Aladdin和Mackin兩個品牌的HOPO標準品，進行對比實驗。

用乙腈分別配制羥吡啶酮與HOPO的標準溶液，并分別對空白洗發(fā)水樣品進行相同濃度加標實驗，采用上述方法分別對標準溶液與提取樣液進行分析。結(jié)果顯示，兩種化合物的保留時間及光譜圖一致。

使用傅里葉變換紅外光譜對4個標準品進行鑒別，如圖3所示，1 626 cm-1處的吸收峰為羰基C= = O的伸縮振動，同時羰基大幅度紅移；1 626 cm-1和1 508 cm-1之間的弱峰為C= = C共軛雙鍵的伸縮振動，1 508 cm-1處為—N—O—的伸縮振動，3 075、3 040 cm-1處為C—H的伸縮振動。而3 650 ～ 3 200 cm-1處未發(fā)現(xiàn)OH的強吸收峰，說明化合物存在分子內(nèi)氫鍵；718、752 cm-1處為C—H的彎曲振動吸收峰。羥吡啶酮與HOPO標準品紅外譜圖的主要特征吸收峰波長基本一致，但吸光強度有所差異，說明標準品中發(fā)生了互變異構(gòu)，兩種異構(gòu)體共存，且互變異構(gòu)體可能主要以酮式存在。該結(jié)果與文獻［12］報道的互變異構(gòu)過程相符。

圖3 羥吡啶酮和HOPO的紅外光譜Fig．3 FTIR spectra of hydroxypyridinone and HOPO

進一步查閱資料發(fā)現(xiàn)吡硫鎓鋅與HOPO的合成路線相似［13-15］，如使用2-氯代吡啶為原料，用H2O2氧化生成N-氧化-2-氯吡啶，在堿性條件下巰基化后再與ZnSO4螯合即可生成吡硫鎓鋅。該合成路線與文獻［16］所報道的HOPO的制備方法十分相似。因此在吡硫鎓鋅合成過程中極易生成HOPO雜質(zhì)。

對比兩種形態(tài)的標準品無法對兩者進行有效區(qū)分，而紅外光譜結(jié)果表明兩者均以更穩(wěn)定的羥吡啶酮形態(tài)存在，推測從原料中檢出的羥吡啶酮很可能由HOPO互變產(chǎn)生。

2.6 實際樣品測定

采用該方法對市面上采集的20個批次的去屑洗發(fā)水進行測定，結(jié)果在14個批次產(chǎn)品中檢出羥吡啶酮，含量范圍為16．8 ～ 120．2 mg∕kg。陽性樣品的色譜圖如圖4所示。樣品中的雜質(zhì)峰未對目標物造成干擾，說明該方法能準確對去屑洗發(fā)水中的目標物進行定性定量分析。而檢出羥吡啶酮的洗發(fā)水中均添加了吡硫鎓鋅，因此羥吡啶酮極有可能是作為吡硫鎓鋅原料中的雜質(zhì)引入的。

圖4 羥吡啶酮的色譜圖Fig．4 Chromatograms of hydroxypyridinone

3 結(jié) 論

通過優(yōu)化樣品前處理條件、色譜分離條件和質(zhì)譜確證條件，建立了一種原料及洗發(fā)露中羥吡啶酮的測定方法，該方法前處理簡單，快速、高效、準確，能夠為去屑洗發(fā)露及吡硫鎓鋅原料的質(zhì)量監(jiān)管提供有效的技術(shù)支持。該文首次報道了洗發(fā)露中禁用成分羥吡啶酮的添加情況及帶入原因，為相關(guān)監(jiān)管機構(gòu)及生產(chǎn)企業(yè)提供了重要的風(fēng)險線索。目前歐盟已將吡硫鎓鋅列入禁用名單，我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）規(guī)定吡硫鎓鋅在去屑淋洗類發(fā)用產(chǎn)品中的使用限量為1．5%，在駐留類發(fā)用產(chǎn)品中的使用限量為0．1%［7］，故羥吡啶酮仍然存在引入風(fēng)險?？紤]到羥吡啶酮的潛在基因毒性，呼吁相關(guān)部門重新評價吡硫鎓鋅作為去屑劑使用的安全性，并對吡硫鎓鋅原料加強監(jiān)管，以保護廣大消費者的健康。