盛鋼 褚洪遷 劉丁一 孫照剛

2020年，全球約150萬(wàn)例患者死于結(jié)核病，其中約21.4萬(wàn)例患者合并HIV感染，結(jié)核病仍然是危害人類(lèi)健康的呼吸系統(tǒng)傳染病[1]。2010年，世界衛(wèi)生組織在一項(xiàng)關(guān)于控制結(jié)核病的報(bào)告中指出，由于各種結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)抗原檢測(cè)試劑盒的敏感度和特異度存在較大差異，且檢測(cè)效能有限，暫不建議將各種血清學(xué)MTB抗原及抗體診斷試劑用于結(jié)核病診斷[2]，其在我國(guó)結(jié)核病診斷的臨床工作中也不斷被弱化。

近年來(lái)，雖然痰液或者病灶中直接檢出MTB是肺結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但涂片鏡檢的陽(yáng)性率僅有50%左右[3-4]，且易受檢測(cè)人員技術(shù)水平的影響，存在一定的漏檢率；培養(yǎng)法周期較長(zhǎng)，不利于早診斷、早治療。考慮到MTB抗原成分無(wú)論是來(lái)源于MTB細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)，還是分泌蛋白和某些代謝組分，都是MTB在人體內(nèi)活動(dòng)的直接證據(jù)，具有區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染的能力；且不易受檢測(cè)人員、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等影響和結(jié)核菌素試驗(yàn)結(jié)果的干擾，具有即時(shí)檢測(cè)和床旁檢測(cè)的潛力，抗原檢測(cè)在某些角度上優(yōu)于細(xì)菌學(xué)直接檢查，也優(yōu)于抗體檢測(cè)。從檢測(cè)的便攜性、檢測(cè)成本、檢測(cè)能力來(lái)看，MTB抗原檢測(cè)值得重新關(guān)注和研究，以重新評(píng)價(jià)MTB抗原檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值[5]。

MTB抗原蛋白分布廣泛，可存在于血液、腦脊液、尿液、痰液、穿刺組織和結(jié)核肉芽腫中，因此，在這些標(biāo)本中鑒定出具有臨床意義的抗原直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。筆者將依據(jù)標(biāo)本類(lèi)型，對(duì)各種臨床樣本中的抗原蛋白的發(fā)現(xiàn)過(guò)程、鑒定方法及應(yīng)用前景進(jìn)行綜述，以探討MTB檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展過(guò)程與積極意義，為MTB抗原檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

結(jié)核病患者不同臨床樣本MTB抗原蛋白鑒定

一、血清

血清是結(jié)核病檢測(cè)最常用的樣本之一，目前現(xiàn)行的MTB體外診斷實(shí)驗(yàn)諸如γ-干擾素和抗體檢測(cè)大多需要血清樣本。但是，血清樣本成分復(fù)雜，是人體蛋白質(zhì)含量最豐富的體液樣本，這為MTB抗原鑒定帶來(lái)了一定困難。目前，研究者應(yīng)用高分辨率的凝膠電泳技術(shù)或者蛋白濾過(guò)技術(shù)，仍舊可以從血清樣本中鑒定出一些有意義的MTB蛋白抗原。Banerjee等[6]利用TAC分餾和凝膠過(guò)濾柱層析技術(shù)進(jìn)行一級(jí)抗原分離，再利用快速蛋白質(zhì)液相色譜法(FPLC)進(jìn)行二級(jí)分離，獲得了與肺結(jié)核和骨結(jié)核患者血清高度反應(yīng)的組分，即肺結(jié)核血清循環(huán)抗原組分3C(PTS-G3C)和骨結(jié)核血清循環(huán)抗原組分3B(BJS-G3B)。這兩種組分顯示出與MTB體外釋放的排泄-分泌抗原41(ES-41)相似的FPLC模式。繼而，他們?cè)诹硪豁?xiàng)研究中采用硫酸銨沉淀法制備了循環(huán)結(jié)核抗原蛋白9(CTA-9)，應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和FPLC技術(shù)，對(duì)MTB體外培養(yǎng)濾液進(jìn)行逐級(jí)洗脫，獲得了與CTA-9具有相似抗原活性的高血清反應(yīng)性ES-20。利用ES-20建立的間接ELISA檢測(cè)方法，對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病，特別是淋巴結(jié)結(jié)核顯示出了不錯(cuò)的診斷潛力[7]。Harinath[8]利用間接和夾心法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)進(jìn)一步驗(yàn)證了ES-31和ES-41抗原對(duì)不同類(lèi)型結(jié)核病的診斷效果，發(fā)現(xiàn)ES-31抗原對(duì)淋巴結(jié)結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎(tubercular meningitis，TBM)有更好的診斷效能，而ES-41對(duì)腹膜結(jié)核、骨和關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷效果更好。Attallah等[9]利用55 kDa循環(huán)結(jié)核游離抗原的單克隆抗體(TB-55mAb)在血清、腦脊液、腹腔積液等多種體液標(biāo)本中鑒定到了分子量為55 kDa的循環(huán)結(jié)核游離抗原，并建立了基于55 kDa循環(huán)結(jié)核游離抗原的dot-ELISA檢測(cè)方法，結(jié)果具有較高的敏感度(88%)和特異度(97%)。除使用單克隆抗體進(jìn)行抗原捕獲外，也有研究利用純化的多克隆抗體鑒定出血液中存在具有免疫原性的抗原，例如43 kDa[10]。綜上認(rèn)為，雖然對(duì)血清中MTB抗原蛋白的鑒定有了一定進(jìn)展，但目前仍缺乏系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和鑒定血清中結(jié)核抗原的新方法，也沒(méi)有可用于臨床優(yōu)勢(shì)抗原的充分證據(jù)。

二、組織和肉芽腫

肉芽腫是一種由巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成的動(dòng)態(tài)空間結(jié)構(gòu)，這些免疫細(xì)胞會(huì)將MTB包裹，形成境界清楚的結(jié)節(jié)狀病灶，一方面限制了MTB感染擴(kuò)散，另一方面也使其成為結(jié)核病慢性進(jìn)程中的關(guān)鍵成分[11]。一些研究和臨床數(shù)據(jù)表明，結(jié)核肉芽腫中的細(xì)菌負(fù)載和MTB的代謝活性都會(huì)隨著疾病進(jìn)程發(fā)生變化，這些代謝變化和肉芽腫的包裹則會(huì)對(duì)抗酸染色效果產(chǎn)生不利影響[12]。Goel和Budhwar[13]利用MTB 38 kDa抗原的單克隆抗體對(duì)肉芽腫中的MTB進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(IHC)，結(jié)果顯示，在36例臨床確診的肺外結(jié)核患者中，使用萋-尼染色，僅有13例為陽(yáng)性結(jié)果，而在IHC組中，所有患者的樣本均為陽(yáng)性結(jié)果，并且無(wú)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。Mustafa等[14]比較了MTB感染的肺組織和淋巴結(jié)組織中的抗原表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)肺組織中的大多數(shù)MTB的分泌抗原(如MTP32、MTP46、MTP64等)可經(jīng)IHC染色觀察到，這可能是由于肺部形成保護(hù)性組織肉芽腫的能力有限，無(wú)法有效限制MTB的增殖所致，而在淋巴結(jié)中形成了控制細(xì)菌增殖的肉芽腫，使得細(xì)菌的分泌抗原表達(dá)量銳減，但體細(xì)胞抗原(如Mce1A、Hsp65、MPT57)的存在也可證明淋巴結(jié)結(jié)核持續(xù)感染的存在；另外，通過(guò)IHC方法還確定了15例具有硬化結(jié)節(jié)和空洞等影像學(xué)表現(xiàn)的肺結(jié)核患者。而對(duì)于細(xì)菌學(xué)陰性的既往肺結(jié)核患者的肺組織肉芽腫病灶，也可以通過(guò)病灶內(nèi)存在的Ag85A和分枝桿菌結(jié)合DNA結(jié)合蛋白1(MDP1)加以佐證[15]。

除了蛋白抗原外，甘露糖基化脂原甘露聚糖(ManLAM)是目前研究較多的MTB抗原，在病變組織中含量豐富。LAM是MTB細(xì)胞壁上的重要成分，能夠隨MTB的增殖代謝不斷地釋放出來(lái)。Zhou等[16]研究證明了LAM存在于病變組織中，并將基于ManLAM適配體的IHC檢測(cè)技術(shù)用于結(jié)核病檢測(cè)，其總體敏感度(86.38%)和特異度(92.86%)均較高。

以上研究均說(shuō)明了組織和肉芽腫中結(jié)核蛋白和脂類(lèi)抗原的發(fā)現(xiàn)和鑒定必將促進(jìn)結(jié)核病病理學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。但其困難的取樣方式制約了相應(yīng)病理快速診斷技術(shù)的發(fā)展。

三、痰液

痰液標(biāo)本中找到MTB是診斷結(jié)核病的可靠手段，但其陽(yáng)性率低(50%左右)、易漏檢，常需要聯(lián)合其他檢查方法。痰液中的MTB抗原檢測(cè)本應(yīng)是一項(xiàng)具有潛力的檢查手段，但并未在臨床工作中得以有效應(yīng)用。熱休克蛋白(HspX)是MTB的主要抗原，用于穩(wěn)定細(xì)菌的蛋白質(zhì)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)、提高細(xì)菌的抗宿主免疫能力、逃避宿主的免疫清除，幾乎存在于MTB的整個(gè)活動(dòng)期，是活動(dòng)性結(jié)核病公認(rèn)的生物標(biāo)志物[17]。Pelaez等[18]也開(kāi)發(fā)了一種無(wú)標(biāo)記表面等離子共振(SPR)生物傳感器，用于HspX的床旁檢測(cè)。這種基于EG硫醇的生物功能化策略的傳感器檢測(cè)系統(tǒng)，未對(duì)信號(hào)進(jìn)行任何放大操作，直接反映了機(jī)體內(nèi)的HspX水平，實(shí)現(xiàn)了HspX的納克級(jí)(ng)水平檢測(cè)。

目前，國(guó)際市場(chǎng)上已有針對(duì)痰液中LAM的ELISA檢測(cè)試劑盒，這種檢測(cè)試劑盒仍是基于單克隆抗體研發(fā)的，在關(guān)于其檢測(cè)效果的兩項(xiàng)隊(duì)列研究中，均發(fā)現(xiàn)痰液樣本中LAM的定量檢測(cè)結(jié)果與菌落形成單位(CFU)計(jì)數(shù)存在正相關(guān)，能夠在治療前有效地衡量機(jī)體內(nèi)的MTB細(xì)菌負(fù)荷[19-20]。另外，由于肺部MTB分泌抗原蛋白的高表達(dá)，一些研究針對(duì)MTB分泌蛋白MPT64作為靶抗原進(jìn)行檢測(cè)[21]，提示其對(duì)小兒肺外結(jié)核(EPTB)和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)展現(xiàn)出良好的診斷能力[22-23]。一些公司還推出了一系列針對(duì)痰液培養(yǎng)物中MPT64的抗原診斷產(chǎn)品，但絕大部分還未上市。值得一提的是，痰液樣本的處理對(duì)痰液標(biāo)本的抗原檢測(cè)是個(gè)考驗(yàn)，目前廣泛使用的以堿處理為代表的蛋白變性等液化方法可能會(huì)導(dǎo)致抗原被稀釋和某些重要抗原表位的丟失。

四、腦脊液

腦脊液標(biāo)本獲取困難，采集過(guò)程中患者需承受巨大痛苦，僅用于診斷TBM。MTB侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成的腦損傷和神經(jīng)炎癥是TBM的始動(dòng)環(huán)節(jié)，患者常表現(xiàn)為顱內(nèi)壓異常增高，出現(xiàn)腦膜刺激征[24]，在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，會(huì)引發(fā)腦膜炎癥，病灶部位出現(xiàn)炎性細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞的趨化和浸潤(rùn)，產(chǎn)生混合細(xì)胞反應(yīng)。Song等[25]使用免疫組織化學(xué)方法比較了急性起病的TBM患者第1～4周腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞的MTB早期分泌性靶抗原6(ESAT6)的抗原表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TBM患者在急性起病后的第1周和第2周的陽(yáng)性率均明顯高于對(duì)照組，且與第4周的陽(yáng)性率也有明顯差異，這表明EAST6是TBM患者早期診斷的有效抗原。在TBM患者中發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)循環(huán)游離抗原是30 kDa蛋白，經(jīng)過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)解離掃描，對(duì)產(chǎn)生最大相對(duì)豐度的成分進(jìn)行鑒定分析，證實(shí)30 kDa條帶的衍生肽存在的Ag85A和Ag85B兩個(gè)蛋白均屬于MTB的主要分泌蛋白—Ag85復(fù)合群蛋白。有研究表明，Ag85復(fù)合群蛋白參與MTB的細(xì)胞壁生物合成和免疫原性反應(yīng)，在MTB的抗宿主免疫中發(fā)揮著重要作用[26-27]。65 kDa是一類(lèi)熱休克蛋白，Mudaliar等[28]應(yīng)用TB-60mAb在TBM患者中檢測(cè)到65 kDa蛋白的存在，并建立了間接ELISA方法用于TBM患者的血清學(xué)抗原診斷，顯示出84%的敏感度和90%的特異度，但有8%的化膿性腦膜炎患者和10%的病毒性腦膜炎患者出現(xiàn)了假陽(yáng)性結(jié)果，這與Song等[25]的報(bào)道一致。腦脊液中檢測(cè)MTB是TBM的重要檢查方法，但臨床實(shí)踐證明，腦脊液直接涂片檢測(cè)的陽(yáng)性率較低，而GeneXpert MTB/RIF是檢測(cè)核酸的常用診斷技術(shù)，但存在對(duì)TBM檢測(cè)敏感度有限的缺點(diǎn)[29-32]。綜上所述，直接檢測(cè)腦脊液中的抗原蛋白是一種確認(rèn)MTB現(xiàn)癥感染的重要診斷手段，在TBM診斷方面具有光明前景。

五、尿液

尿液樣本容易獲取，患者依從性好。尿液中MTB抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率在免疫缺陷群體中更高，如HIV感染患者，這可能與MTB在免疫缺陷人群中負(fù)載量更大，進(jìn)入尿液中的MTB抗原更多有關(guān)[33-34]。早在2002年，Choudhry和Saxena[35]就對(duì)培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP10)在尿液標(biāo)本中診斷結(jié)核病的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了評(píng)估，他們使用純化的CFP抗體進(jìn)行夾心法ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)75%的樣本為陽(yáng)性。近年來(lái)，Seifert等[36]采用一種高敏感度的原型生物電子結(jié)核抗原(BETA)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行初診結(jié)核病患者的血清和尿液樣本中的CFP10的床旁檢測(cè)，均顯示出較好的診斷價(jià)值；另外，值得注意的是，該研究顯示尿液中CFP10的含量可能要比血清更高，提示當(dāng)以CFP10為靶標(biāo)時(shí)，尿液樣本也許是更好的選擇。

另一個(gè)被確定出現(xiàn)在尿液中的經(jīng)典MTB抗原是LAM，由Hamasur等[37]首先報(bào)道，他們將H37Rv的細(xì)胞壁超聲產(chǎn)物注射到小鼠腹腔，17 h后收集尿液進(jìn)行夾心法ELISA分析，證實(shí)了尿液中有LAM存在。Dahiya等[38]認(rèn)為尿液中的LAM和CFP10的一種存在形式是細(xì)胞外囊泡(EVs)，通過(guò)EVs這種獨(dú)特的形式，將結(jié)核抗原組分包裹于脂質(zhì)雙分子層中，以參與細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸與代謝[39]。他們利用免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(I-PCR)對(duì)尿液中的LAM和CFP10進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示I-PCR的檢測(cè)限低于ELISA方法106倍。但尿液LAM檢測(cè)的敏感度在不同患者人群中存在較大異質(zhì)性，如低CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的患者(例如HIV合并MTB感染者)對(duì)LAM檢測(cè)的敏感度(67%～85%)明顯高于HIV陰性的結(jié)核病患者(13%～51%)[40]。

目前，國(guó)際上已有來(lái)自美國(guó)雅培公司和日本富士膠片株式會(huì)社的基于側(cè)流尿脂阿拉伯甘露聚糖(LF-LAM)技術(shù)的商業(yè)化檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)尿液中的LAM，但其目前的應(yīng)用范圍較窄，僅用于HIV合并MTB感染者，且在不同研究中存在敏感度的較大差異，如在未評(píng)估結(jié)核病癥狀的HIV陽(yáng)性患者中診斷結(jié)核病的敏感度為35%；在具有結(jié)核病臨床表現(xiàn)的HIV陽(yáng)性患者中診斷結(jié)核病的敏感度為42%，這可能是HIV陰性患者尿液中LAM濃度更低，且檢測(cè)結(jié)果易被尿液中與LAM結(jié)合的基質(zhì)蛋白所干擾有關(guān)[41]。另外，一項(xiàng)Meta分析發(fā)現(xiàn)這兩種試劑盒對(duì)HIV陽(yáng)性的疑似結(jié)核病兒童患者檢測(cè)的敏感度和特異度更高[42]。Paris等[43]提出的一種用于濃縮LAM的水凝膠納米籠有效地隔絕了基質(zhì)蛋白的干擾，提高了尿液中LAM的檢出能力。De等[44]認(rèn)為這可能是由于體內(nèi)分離獲得的LAM與體外培養(yǎng)獲得的LAM在結(jié)構(gòu)或者功能方面有所差異，從而導(dǎo)致了檢測(cè)結(jié)果的不一致。因此，他們分別對(duì)從C3HeB/FeJ小鼠感染模型的肺臟和HIV陰性結(jié)核病患者尿液中分離純化獲得的LAM進(jìn)行了抗原表位的差異分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)自肺臟的LAM的非還原末端高度琥珀?；⒁早牾；木€性4阿拉伯呋喃糖苷(Ara4)綴連的甘露糖封端和支鏈5阿拉伯呋喃糖苷(Ara5)綴連的甘露糖末端基序?yàn)橹鲗?dǎo)，而尿液來(lái)源的LAM雖也以高豐度的Ara4和Ara5末端基序?yàn)橹鲗?dǎo)，但嚴(yán)重缺乏支鏈6阿拉伯呋喃糖苷(Ara6)綴連的甘露糖末端基序，這說(shuō)明LAM結(jié)構(gòu)上的差異可能會(huì)直接影響LAM與抗體的親和力，從而影響檢測(cè)結(jié)果。

Pollock等[45]在2例肺結(jié)核患者的尿液中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)獨(dú)特的MTB多肽序列：TBCG_03312，經(jīng)過(guò)BLAST分析，發(fā)現(xiàn)該肽段與不同的MTB臨床分離株高度同源，與來(lái)自MTBC 菌株的TBCG_03312和來(lái)自MTB423菌株的氧化還原酶的序列相匹配。進(jìn)行MTB的體液學(xué)抗原鑒定，一個(gè)需要考慮的問(wèn)題是除去患者體液中高豐度的非MTB抗原蛋白，避免其對(duì)低豐度MTB抗原的掩蓋，Young等[46]使用了50 kDa分子截留過(guò)濾器(MWCO)去除尿液中高豐度的大分子量蛋白，收集了30 kDa內(nèi)的蛋白質(zhì)，經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定了10種僅出現(xiàn)在結(jié)核病患者尿液中的分枝桿菌蛋白。

MTB抗原蛋白鑒定與檢測(cè)的發(fā)展歷程與目前存在的問(wèn)題

早在1987年的一項(xiàng)研究中，科研人員就利用放射免疫技術(shù)(RIA)觀察到TBM患者腦脊液中的MTB特異性抗原(TB-Ag)和特異性抗體(TB-Ab)均明顯升高，認(rèn)為這些抗原或者抗體檢查可能要比腦脊液常規(guī)檢查更具有診斷意義[47]。隨后越來(lái)越多的科學(xué)家開(kāi)始關(guān)注到MTB抗原檢測(cè)，根據(jù)所檢測(cè)的抗原類(lèi)型，抗原鑒定的發(fā)展過(guò)程大致分為3個(gè)階段：(1)抗原蛋白原始鑒定期：聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)被廣泛應(yīng)用于MTB抗原的發(fā)現(xiàn)與識(shí)別中，常以健康人血清為對(duì)照進(jìn)行結(jié)果比對(duì)，找出結(jié)核病患者異常的血清條帶，鑒定結(jié)果有一定意義，但限于當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件，大多數(shù)研究并未對(duì)這些蛋白的多肽和氨基酸序列進(jìn)行明確分析，其結(jié)構(gòu)和表位大多未知，一些研究者認(rèn)識(shí)到這些蛋白可能融合有多個(gè)抗原表位，與非結(jié)核性呼吸系統(tǒng)疾病患者血清存在交叉反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果的特異性難以保證[48]。(2)分泌蛋白鑒定期：這一時(shí)期，色譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)和等電點(diǎn)聚焦電泳等物質(zhì)分析技術(shù)逐漸興起，隨著對(duì)編碼MTB抗原蛋白基因結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)與發(fā)展，MTB抗原鑒定逐漸向分子生物學(xué)水平靠近。分泌蛋白EAST6和CFP10的分離與表征是MTB抗原蛋白鑒定的重要突破。S?rensen等[49]在MTB培養(yǎng)濾液中發(fā)現(xiàn)了一種由95個(gè)氨基酸組成的多肽序列，經(jīng)DNA序列翻譯后比對(duì)和N段系列分析，發(fā)現(xiàn)其具有刺激T細(xì)胞分泌γ-干擾素的能力，而并非污染蛋白，這也標(biāo)志著以EAST6為代表的MTB培養(yǎng)濾液蛋白抗原的發(fā)現(xiàn)。隨后，Berthet等[50]鑒定出了與EAST6共同轉(zhuǎn)錄的新基因：lhp，該基因的產(chǎn)物是來(lái)自MTB培養(yǎng)濾液的低分子量蛋白質(zhì)CFP10，這兩個(gè)低分子量蛋白目前仍舊是MTB抗原研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)[51-53]，但EAST6和CFP10目前也僅用于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的篩查和肺外結(jié)核的輔助診斷，其輔助診斷結(jié)核病的價(jià)值、區(qū)分潛伏性和感染性結(jié)核病的能力也有待評(píng)估。(3)活性肽序列抗原鑒定期：雖然已經(jīng)在各種臨床標(biāo)本諸如血清、尿液、腦脊液標(biāo)本中鑒定出了多種具有意義的MTB抗原蛋白，但正如世界衛(wèi)生組織所質(zhì)疑的，這些抗原蛋白檢測(cè)結(jié)核病患者的敏感度和特異度在不同的研究中具有明顯差異，抗原蛋白鑒定的穩(wěn)定性及試驗(yàn)的可重復(fù)性目前也難以保證，這限制了抗原檢測(cè)技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用推廣。

當(dāng)前需要對(duì)所鑒定的抗原蛋白的臨床可靠性和檢測(cè)方法的適用性進(jìn)行深刻反思。需要考慮的因素主要包括以下幾個(gè)方面：(1)不同臨床標(biāo)本中的MTB抗原蛋白是否與天然結(jié)構(gòu)一致，經(jīng)過(guò)機(jī)體復(fù)雜的代謝后這些抗原蛋白發(fā)生了怎樣的變化？(2)所檢測(cè)的MTB抗原蛋白是否適用于所有類(lèi)型的結(jié)核病患者？例如，結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者與活動(dòng)期結(jié)核病患者、單純結(jié)核感染患者與合并免疫缺陷疾病的患者、菌陰患者與菌陽(yáng)患者等，目前已有一些研究針對(duì)不同患者類(lèi)型的檢測(cè)效果進(jìn)行了詳細(xì)探究，但總體來(lái)說(shuō)還沒(méi)有定論。此外，是否有抗原蛋白存在于MTB感染的全周期，并能夠以穩(wěn)定的形式存在于臨床樣本中也鮮有研究。(3)為了使檢測(cè)方法更為靈敏，多應(yīng)用ELISA、免疫熒光等技術(shù)將檢測(cè)信號(hào)顯著放大，這也可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，過(guò)度的信號(hào)放大以及檢測(cè)原理的差異是導(dǎo)致各檢測(cè)方法結(jié)果差異較大的重要原因。(4)檢測(cè)單一MTB抗原可能會(huì)與其他致病菌產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

基于以上問(wèn)題的考量，科學(xué)家們不再將抗原鑒定的目標(biāo)集中于菌體本身或者分泌的抗原蛋白，而是開(kāi)始應(yīng)用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析標(biāo)本中抗原的存在形式與結(jié)構(gòu)，逐漸關(guān)注抗原蛋白的體內(nèi)外差異，已經(jīng)在結(jié)核病患者血液和尿液中發(fā)現(xiàn)了一些不同于以往發(fā)現(xiàn)的任何天然蛋白的多肽序列。為避免抗原交叉反應(yīng)導(dǎo)致的假陽(yáng)性和提升對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病及結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的鑒別能力，一些研究采用聯(lián)合抗原檢測(cè)[54-55]，也有研究將不同的抗原表位進(jìn)行融合，建立融合蛋白檢測(cè)，這是一個(gè)頗有潛力的思路[56]。另外，有的研究已經(jīng)關(guān)注到過(guò)度的信號(hào)放大給檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)的不利影響，研究者在不進(jìn)行任何信號(hào)放大的條件下，使用新型技術(shù)如無(wú)標(biāo)記表面等離子共振生物傳感器直接對(duì)MTB抗原蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。同時(shí)，基于適配體的抗原檢測(cè)技術(shù)也值得我們關(guān)注，適配體內(nèi)涵廣泛，核酸、蛋白、脂質(zhì)都可以作為抗原的適配體，并且隨著物質(zhì)互作分析技術(shù)的不斷發(fā)展，適配體技術(shù)將為MTB抗原蛋白的鑒定與檢測(cè)開(kāi)創(chuàng)新的格局[57]。

結(jié) 論

MTB抗原鑒定是抗原檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)和前提，鑒定出具有臨床意義的抗原對(duì)MTB抗原檢測(cè)新技術(shù)的研發(fā)具有重要意義。而目前基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等分子生物學(xué)方法的快速發(fā)展，為MTB抗原鑒定開(kāi)辟了一條新渠道。另外，要著重關(guān)注抗原蛋白在機(jī)體內(nèi)的存在形式，探究抗原蛋白的體內(nèi)外差異，這將為MTB抗原蛋白鑒定創(chuàng)造積極意義，并且有助于疫苗的研發(fā)。同時(shí)，納米技術(shù)、生物傳感技術(shù)、抗原富集技術(shù)與MTB抗原檢測(cè)的不斷融合[58]，也將推動(dòng)MTB抗原檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用，使之獲得更多青睞。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)盛鋼：資料收集、分析與撰寫(xiě)；褚洪遷和劉丁一：文章修改；孫照剛：提出文章撰寫(xiě)思路