歐陽雪梅 鄭毓毓 韓學凱 許如意 隋麗英

(天津科技大學海洋與環(huán)境學院, 亞洲區(qū)域鹵蟲參考中心, 天津 300457)

小型甲殼動物鹵蟲(Artemia)廣泛分布于沿海鹽池和內(nèi)陸鹽湖高鹽水體中, 是鹵水生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的重要組成部分和生物調(diào)節(jié)者[1]。鹵蟲具有兩種生殖方式, 分別為孤雌生殖和兩性生殖, 同時雌性鹵蟲以卵生(Oviparous, OVI)、卵胎生(Ovoviviparous, OVOVI)兩種方式進行繁育, 即雌性鹵蟲以產(chǎn)休眠卵或以生產(chǎn)無節(jié)幼體的方式來繁殖后代[2]。

鹵蟲的繁殖模式可能受內(nèi)在遺傳因子與外部環(huán)境因素的影響[3], 對于其繁殖模式形成的分子機制研究, 主要集中在休眠卵形成相關功能基因克隆和表達方面。目前已發(fā)現(xiàn)多種鹵蟲繁殖相關基因,如BAP1是一種參與調(diào)節(jié)G1/S期和休眠卵形成的分子, 有助于維持休眠卵的周期停滯[4]; 還鑒定了參與鹵蟲休眠卵形成過程的脅迫應答轉(zhuǎn)錄輔因子p8[5]。有研究報道, 在鹵蟲的卵生途徑中Afr-AMPKα基因的mRNA表達水平顯著降低, 這可能與鹵蟲的不同繁殖方式有關[6]。此外, 在鹵蟲中, 染色質(zhì)組蛋白的積累可能導致細胞周期阻滯, 影響胚胎發(fā)育, 并參與鹵蟲休眠胚胎形成過程[7]。然而目前哪些基因在鹵蟲產(chǎn)卵或產(chǎn)幼過程中起關鍵作用還不清楚, 其不同繁殖方式產(chǎn)生的內(nèi)在分子機制仍需進一步探究。

近年來轉(zhuǎn)錄組測序技術已被廣泛的應用于甲殼動物發(fā)育、繁殖和免疫等方面的研究, 并用于發(fā)掘參與其各種生理過程的關鍵基因及信號通路[8]。在鹵蟲轉(zhuǎn)錄組學研究方面, 有報道采用轉(zhuǎn)錄組測序技術進行鹵蟲耐鹽相關基因挖掘, 為研究鹵蟲獨特的耐鹽機制提供了基礎資料[9]; Diego等[10]構(gòu)建了雌雄差異轉(zhuǎn)錄組, 并開發(fā)了雌雄相關SNP標記, 為鹵蟲和其他甲殼類動物性別偏向基因的表達提供了重要信息。但迄今為止, 有關鹵蟲卵生和卵胎生不同繁殖模式的轉(zhuǎn)錄組學研究還未見報道, 相關的繁殖模式差異基因有待進一步發(fā)掘。因此本實驗利用Illumina HiSeq 2500測序平臺構(gòu)建了孤雌生殖鹵蟲在卵生和卵胎生兩種繁殖模式下的轉(zhuǎn)錄組文庫,并對差異表達基因進行功能注釋, 篩選與鹵蟲生殖相關的候選基因并開展表達研究, 為揭示其不同繁殖模式的發(fā)生機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗選取新疆艾比湖孤雌生殖鹵蟲, 在28℃和光照條件下孵化培養(yǎng)。在6個1 L錐形瓶中每個飼養(yǎng)200只鹵蟲并投喂新鮮培養(yǎng)的鹽生杜氏藻Dunaliella salina。根據(jù)王智超[11]在對光誘導鹵蟲卵生卵胎生不同繁殖模式的研究, 得到相應繁殖模式的鹵蟲, 以備后用。收集晚期胚胎的卵巢組織,解剖后迅速置于液氮中, –80℃冰箱中保存, 用于分析候選生殖相關基因在不同繁殖模式的表達情況。

1.2 文庫構(gòu)建與測序

從卵巢組織樣品中提取總RNA, 檢驗其濃度、純度及完整性。在樣品檢測合格后, 將mRNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA, 并將其純化。經(jīng)末端修復和接頭連接后通過PCR富集得到最終的cDNA文庫, 并對其質(zhì)量進行檢測, 然后在Illumina HiSeq 2500平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序[12]。

1.3 從頭組裝和功能注釋

為獲取后續(xù)分析所需的參考序列, 將測序得到的原始序列進行過濾, 首先對原始數(shù)據(jù)進行測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估, 將帶接頭的、低質(zhì)量的數(shù)據(jù)過濾得到測序讀段, 后將獲得的測序讀段用Trinity[13]軟件進行序列拼接, 將Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄本序列, Corset層次聚類并去冗余后得到最長Cluster序列進行后續(xù)的分析。為獲得全面的基因功能信息, 將拼接所得的序列與NR、NT、PFAM、KOG、KO、SwissProt、GO和KEGG等數(shù)據(jù)庫進行比對注釋[14]。

1.4 差異表達基因

將測序讀段運用Bowtie 2進行比對, 利用DEG-seq得到鹵蟲卵生和卵胎生兩種繁殖模式間的差異表達基因[14], 在篩選過程中, 以qvalue<0.005且log2|fold_change|>1為篩選閾值。為了獲得關于差異表達基因更多信息, 通過KEGG通路富集和GO功能對其進行分析[15]。

1.5 qRT-PCR分析

從轉(zhuǎn)錄組篩選的差異基因中, 參照轉(zhuǎn)錄組注釋并結(jié)合文獻查找篩選得到Serine/threonine-like kinase(SLK)、Double sex and mab-3 related transcription factor(Dmrt)、Feminization-1(fem-1)和5-hydroxytryptamine receptor gene(5-HT), 以及參與原始生殖細胞的遷移和維持的Nanos和調(diào)節(jié)成熟促進因子亞基的周期蛋白cyclin B等6個候選生殖相關基因并進行引物設計(表1), 以β-actin作為內(nèi)參基因?qū)麓汽u蟲卵巢不同繁殖模式的mRNA表達量進行qRT-PCR檢測, 采用2–??Ct法[16]計算目的基因在生殖腺不同繁殖模式的相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.6 候選生殖相關基因的蛋白結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過在線軟件對候選生殖相關基因進行保守結(jié)構(gòu)域預測(https : //www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html); 采用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫對候選生殖相關基因的氨基酸序列進行BLAST比對, 分析與其他物種的相似性; 利用MEGA7.0軟件將不同物種的氨基酸序列進行多重比對, 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 Unigene的組裝和功能注釋

從原始數(shù)據(jù)中將低質(zhì)量序列剔除后, 共得到了94901316條序列, 從頭組裝后得到97146條unigene(表2), 長度大于2000 bp的有12338條, 平均長度為1023 bp, N50 unigene有1558個, N90 unigene有450個。

表2 Unigene序列在公共數(shù)據(jù)庫中的注釋結(jié)果Tab.2 Comment results of the unigene sequence in the public database

將獲得的97146條Unigene 數(shù)據(jù)信息分別在蛋白質(zhì)家族域數(shù)據(jù)庫(Pfam)、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Swiss Prot)、非冗余蛋白數(shù)據(jù)(NR)、真核生物蛋白相鄰類的聚簇(KOG)、基因本體論(GO)數(shù)據(jù)庫和基因組百科全書(KEGG)七大數(shù)據(jù)庫進行比對注釋。結(jié)果顯示, 注釋率最高的是GO數(shù)據(jù)庫, 達到37.39%; 注釋率最低的為NT數(shù)據(jù)庫中, 僅為13.01%(表2)。轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)已上傳至基因組數(shù)據(jù)中心,登錄號為: PRJNA788349。

2.2 差異表達基因分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得卵生和卵胎生鹵蟲卵巢的1452個差異表達基因, 上調(diào)基因與下調(diào)基因分別為601個和851個(圖1)。

圖1 卵胎生與卵生鹵蟲卵巢中上調(diào)和下調(diào)的差異表達基因Fig.1 Up-regulated and down-regulated differentially expressed genes in ovoviviparous vs oviparous Artemia ovary

GO數(shù)據(jù)庫涵蓋3個方面(圖2): 生物過程(Biological process)、細胞組成(Cellular component)和分子功能(Molecular function)。統(tǒng)計結(jié)果顯示: 注釋到生物過程數(shù)據(jù)庫中的差異表達基因有1243個,其中22.84%富集在有機氮化合物代謝, 碳水化合物衍生物代謝過程占11.19%; 注釋富集至分子功能數(shù)據(jù)庫的有530個差異表達基因, 17.13%為結(jié)構(gòu)分子活性, 幾丁質(zhì)結(jié)合占6.06%; 富集至細胞組分的有306個, 細胞組分占11.54%, 核蛋白復合體占7.11%,核糖體蛋白占6.41%。

圖2 GO富集分析圖Fig.2 Enrichment scatter diagram of GO pathway

在本研究中, 對卵生、卵胎生的差異表達基因進行KEGG富集分析, 共富集到220條代謝調(diào)節(jié)通路, 挑選了富集最顯著的20條信號通路條目在圖3中進行展示。表3為卵生和卵胎生差異表達上調(diào)和下調(diào)基因富集的前10個信號通路, 其中上調(diào)富集基因數(shù)目最多的通路為蛋白質(zhì)消化吸收, 下調(diào)富集基因數(shù)目最多的為核糖體通路。

表3 鹵蟲表達上調(diào)和下調(diào)基因富集的10個信號通路Tab.3 The top -ten enriched pathways of up -regulated and down-regulated unigene in Artemia

圖3 KEGG pathway富集散點圖Fig.3 Enrichment scatter diagram of KEGG pathway

從KEGG富集通路中篩選后利用NCBI比對,挑選可能對鹵蟲不同生殖模式起到調(diào)控作用的基因, 并結(jié)合文獻查找獲得了Serine/threonine-like kinase(SLK)、Double sex and mab-3 related transcription factor(Dmrt3)、Feminization-1(fem-1)和5-hydroxytryptamine receptor gene(5-HT), 以及參與原始生殖細胞的遷移和維持的Nanos和調(diào)節(jié)成熟促進因子亞基的周期蛋白cyclin B共6個候選生殖相關基因。

2.3 候選生殖相關基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預測

對SLK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預測發(fā)現(xiàn)該蛋白共包含1個結(jié)構(gòu)域, 其中第334—581位氨基酸為 MPP_PPP_family結(jié)構(gòu)域(圖4A)。對Dmrt3蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預測發(fā)現(xiàn)該蛋白共包含1個結(jié)構(gòu)域, 其中第68—208位氨基酸為 DM superfamily結(jié)構(gòu)域(圖4B)。對Fem-1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預測發(fā)現(xiàn)該蛋白共包含5個結(jié)構(gòu)域, 其中第92—183位氨基酸、第158—240位氨基酸、第44—116位氨基酸都為Ank_2結(jié)構(gòu)域, 第527—571位氨基酸為 Ank_2超家族結(jié)構(gòu)域, 第486—582位氨基酸為ANKYR結(jié)構(gòu)域(圖4C)。對CyclinB蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預測發(fā)現(xiàn)該蛋白共包含2個結(jié)構(gòu)域, 其中第61—190位氨基酸為CYCLIN_CCNB1-like_rpt1結(jié)構(gòu)域, 第195—315位氨基酸為CYCLIN_SF 超家族結(jié)構(gòu)域(圖4D)。對5-HT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預測發(fā)現(xiàn)該蛋白共包含1個結(jié)構(gòu)域,其中第32—371位氨基酸為7tmA_5-HT7結(jié)構(gòu)域(圖4E)。對Nanos蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預測發(fā)現(xiàn)該蛋白共包含1個結(jié)構(gòu)域, 其中第232—279位氨基酸為zf-nanos結(jié)構(gòu)域(圖4F)。

2.4 候選生殖相關基因的相似性分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

分別對候選生殖相關基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析可知,SLK基因氨基酸序列與昆蟲綱中的馬鈴薯的SLK序列相似性最高(圖5A)。Dmrt3基因氨基酸序列與兩棲綱、鰓足綱(節(jié)肢動物門)相關物種的Dmrt3基因氨基酸序列相對較近, 其中Dmrt3基因與兩性鹵蟲和鹽湖鹵蟲的Dmrt3序列相似性最高(圖5B)。fem-1基因氨基酸序列與鰓足綱(節(jié)肢動物門)和橈足綱相關物種的fem-1基因氨基酸序列相對較近,其中fem-1基因與兩性鹵蟲的fem-1序列相似性最高(圖5C)。cyclinB基因氨基酸序列與輻鰭魚綱(脂鯉科)相關物種的cyclinB基因氨基酸序列相對較近(圖5D)。5-HT基因氨基酸序列與介形蟲的5-HT序列相似性最高(圖5E)。Nanos基因氨基酸序列與昆蟲綱的相關物種的Nanos基因氨基酸序列相對較近, 其中Nanos基因與多胚跳小蜂和竹節(jié)蟲的Nanos序列相似性最高(圖5F)。

圖5 SLK、Dmrt3、Fem-1、CyclinB、5-HT和Nanos蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of SLK, DMRT3, Fem-1, CyclinB, 5-HT and Nanos proteins

2.5 qRT-PCR驗證和鹵蟲候選生殖相關基因的表達分析

qRT-PCR的結(jié)果表明, 所選的與生殖相關候選基因在卵生和卵胎生兩種繁殖模式中的表達量具有顯著性差異。SLK、Dmrt3、fem-1、cyclin B、5-HT和Nanos在鹵蟲卵巢中的表達量均為卵生高于卵胎生(P<0.05; 圖6)。

圖6 SLK、Dmrt3、fem-1、cyclinB、5-HT和Nanos基因在不同繁殖模式下的表達情況Fig.6 Expression of SLK, Dmrt3, fem-1, cyclinB, 5-HT and Nanos genes in different reproductive modes of Artemia oocysts

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)錄組測序分析

本研究以卵生和卵胎生生殖方式的孤雌鹵蟲為材料進行轉(zhuǎn)錄組測序, 獲得了97146條非冗余Unigene序列, 其中注釋到已知基因的Unigene為37.39%, 注釋率相對較低。在其他關于甲殼動物的轉(zhuǎn)錄組測序比對注釋的報道中也出現(xiàn)了許多未被注釋到的情況, 如日本沼蝦(Macrobrachium nipponensis)轉(zhuǎn)錄組中只有23.89%為被注釋的序列[17], 銀色小長臂蝦(Palaemonetes argentinusfan)中注釋到的序列只有24%[18], 而凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的注釋率也只有37.28%[19]。出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組注釋率低的原因可能是在目前公共基因數(shù)據(jù)庫中相關物種基因注釋信息有限。而隨著鹵蟲基因組測序結(jié)果的完成與公布, 這些潛在的與生殖相關功能基因有望得到進一步挖掘。

已有研究證實, 甲殼動物的卵巢發(fā)育受到內(nèi)部因子如類固醇激素、神經(jīng)多肽、神經(jīng)遞質(zhì)以及外源環(huán)境因子的綜合調(diào)控[14,20—24]。本研究從GO富集數(shù)據(jù)庫中篩選到一些參與卵泡細胞發(fā)育、卵母細胞分化、生殖細胞發(fā)育、卵殼形成和性腺發(fā)育等過程的基因, 這些基因可能參與鹵蟲不同繁殖模式的生殖過程。Unigene在KOG真核直系同源數(shù)據(jù)庫中注釋到參與信號轉(zhuǎn)導機制、細胞周期控制、細胞分裂、染色體分裂及核苷酸運輸和代謝等相關基因, 可能與鹵蟲生殖有關。另外從KEGG代謝通路注釋分析中, 篩選到一些代謝通路如甾體激素生物合成[25]、PI3K-Akt信號通路[26]、TGF-beta信號通路[27—29]及Wnt信號通路[30], 這些都與甲殼動物卵巢的發(fā)育和成熟相關, 因此我們推斷這些代謝通路可能參與鹵蟲不同生殖模式的發(fā)生過程。

3.2 生殖相關候選基因表達分析

鹵蟲產(chǎn)卵和產(chǎn)幼的機制復雜, 可能與p26基因[31]、卵殼[32]、卵黃蛋白和外部環(huán)境因素有關[3,33]。本研究的不同生殖模式中的319個差異表達基因顯著富集至抗原處理和呈遞、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工過程、PI3K-Akt信號通路、核糖體、吞噬體等KEGG通路中, 這些代謝通路對于鹵蟲生長發(fā)育相關蛋白的合成和轉(zhuǎn)運起到調(diào)控作用。為進一步探究這些過程是否與鹵蟲不同繁殖模式的生殖過程有關, 從這些通路中篩選到了可能與鹵蟲不同生殖模式相關的候選基因SLK、Dmrt3、cyclin B、Nanos、fem-1和5-HT, 對鹵蟲在不同繁殖模式下生殖相關基因進行了蛋白結(jié)構(gòu)域預測和表達情況分析。研究發(fā)現(xiàn)上述6個基因預測得到的蛋白結(jié)構(gòu)域與之前報道的相應基因保守結(jié)構(gòu)域一致, 且均與生殖相關。這預示著本研究所選6個生殖候選基因在鹵蟲中可能同樣參與生殖發(fā)育過程。

在關于卵胎生鹵蟲研究中發(fā)現(xiàn),SLK主要參與調(diào)控細胞周期、細胞凋亡等過程[34], 并且胚胎發(fā)育時期SLK蛋白表達量比卵母細胞發(fā)育時期高[35]。對Artemia franciscana的雌蟲及雄蟲做轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),Dmrt相關基因調(diào)控性腺分化過程中蛻皮素的生物合成, 并參與性別決定過程, 表明鹵蟲中Dmrt基因參與生殖腺的早期發(fā)育[36]。對中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)fem-1基因研究發(fā)現(xiàn), 該基因的表達量在卵巢組織和睪丸組織中最高, 并且在早期胚胎發(fā)育時高度表達, 說明該基因?qū)τ谛韵侔l(fā)育后期有潛在作用, 同時與中華絨螯蟹的生殖密切相關[37]。在克氏原螯蝦(Procarabarus clarkii)中發(fā)現(xiàn)cyclin B基因在細胞分化、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運體活性和減數(shù)分裂周期過程中都發(fā)揮著重要作用, 說明cyclin B在甲殼類卵母細胞成熟調(diào)控中起著不可或缺的翻譯激活作用[38]。5-HT既是神經(jīng)遞質(zhì)又是神經(jīng)激素, 存在于卵巢和雄激素腺中, 并對性腺成熟產(chǎn)生影響。5-HT基因在遠洋梭子蟹(Portunus pelagicus)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和卵巢中存在, 并可能通過作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的某些生殖激素對遠洋梭子蟹的繁殖起著關鍵作用[39]。Nanos基因在成年雌性斑馬魚(Brachydanio rerio)生殖系的初期卵母細胞中表達, 對于斑馬魚卵母細胞的持續(xù)產(chǎn)生起著重要作用[40]; 在多倍體銀鯽(Carassius gibelio)中發(fā)現(xiàn),Nanos2在生殖干細胞中呈現(xiàn)出偏向表達的特征, 調(diào)控卵巢早期胞囊的發(fā)育過程[41]。在本研究中, 通過實時熒光定量PCR得到SLK、Dmrt、fem-1、cyclin B、5-HT和Nanos的表達情況, 在鹵蟲不同繁殖模式下, 以上基因在鹵蟲卵生繁殖模式中的表達量均顯著高于卵胎生表達量, 因此推測這些基因可能更多參與鹵蟲休眠卵形成過程。

4 結(jié)論

利用高通量測序技術分析了鹵蟲卵生和卵胎生差異轉(zhuǎn)錄組文庫, 結(jié)合KEGG富集通路及GO功能分類對兩種繁殖模式間的差異表達基因進行了分析。挑選6個生殖相關候選基因, 分別對其蛋白結(jié)構(gòu)域進行預測并分析其在不同生殖模式下的表達情況, 發(fā)現(xiàn)SLK、Dmrt3、cyclin B、fem-1、5-HT和Nanos在卵生鹵蟲卵囊的表達量顯著高于卵胎生鹵蟲, 說明這些基因可能更多地參與鹵蟲休眠卵形成過程, 影響鹵蟲卵生繁殖模式形成。在后續(xù)研究中將進一步利用RNAi技術精確地靶向敲降目的基因,檢測出下游基因表達量的變化, 并結(jié)合蛋白印跡技術對目標基因功能進行深入研究。