劉二田 陳 一 戰(zhàn) 欣 顧志峰 王愛(ài)民,

(1.海南大學(xué)海洋學(xué)院, ?？?570228; 2.海南大學(xué)南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海口 570228)

企鵝珍珠貝(Pteria penguin), 屬軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca), 雙殼綱(Bivalvia), 翼形亞綱(Pteriomorphia)珍珠貝科(Pteriidae), 珍珠貝屬(Pteria)。因其體型大、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、外套膜分泌珍珠質(zhì)機(jī)能旺盛, 殼內(nèi)所產(chǎn)附殼珠商品價(jià)值高, 珍珠層區(qū)厚大, 可做珍珠粉、珍珠化妝品、貝雕及工藝品的原材料,兼具藥用功效等一系列優(yōu)點(diǎn), 是我國(guó)大型海水附殼珍珠的主產(chǎn)貝種, 也是熱帶亞熱帶地區(qū)重要海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)[1—3]。在我國(guó)主要分布于海南、廣東大亞灣、廣西潿洲島和臺(tái)灣西南等地, 尤其以海南沿海為主產(chǎn)地[4,5]。

我國(guó)于1968年成功實(shí)現(xiàn)企鵝珍珠貝的人工育苗[6], 但長(zhǎng)期以來(lái), 人工育苗的孵化率偏低, 無(wú)法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化, 天然海區(qū)的采補(bǔ)和自然附苗仍是企鵝珍珠貝養(yǎng)殖種苗的主要來(lái)源[7]。貝類(lèi)苗種繁育過(guò)程中通常采用數(shù)量較少的繁殖親本, 連續(xù)人工繁育群體中近親配子結(jié)合的概率增加, 從而導(dǎo)致由近交引起的適合度降低[8]。育種過(guò)程中常利用近交培育純系, 但近交易導(dǎo)致繁殖力和生理機(jī)能相關(guān)性狀的表型值降低[9]。李思發(fā)等[10]和劉宇飛等[11]通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)分別對(duì)團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)近交群體的遺傳結(jié)構(gòu)和劍尾魚(yú)(Xiphophorus helleri)近親交配家系的遺傳多樣性進(jìn)行了研究, 結(jié)果表明近交能降低水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖群體基因頻率變化、稀有基因缺失以及遺傳多樣性指標(biāo)降低。傅強(qiáng)[12]對(duì)蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)自交家系的研究表明近交還可導(dǎo)致基因表達(dá)量的變化。目前, 我國(guó)養(yǎng)殖的貝類(lèi)幾乎全是野生型, 如果某種貝類(lèi)發(fā)生了遺傳衰退, 其在DNA水平上將表現(xiàn)出遺傳多樣性降低, 并在生長(zhǎng)和抗性等方面表現(xiàn)為低值化[8]。遺傳衰退對(duì)貝類(lèi)優(yōu)良種類(lèi)的培育以及高品質(zhì)貝類(lèi)的養(yǎng)殖是十分不利的。

微衛(wèi)星是一種基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù), 可靠性高, 被廣泛地應(yīng)用于物種進(jìn)化、遺傳結(jié)構(gòu)、親子鑒定、種質(zhì)資源評(píng)估及遺傳圖譜的構(gòu)建等各個(gè)領(lǐng)域的研究中, 成為應(yīng)用較廣的分子標(biāo)記之一[13]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中, 已在孔雀魚(yú)(Poecilia reticulata)[14]、草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella)[15,16]、西施舌(Coelomactra antiquata)[17]、魁蚶(Scapharca broughtonii)[17]和凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[18,19]等物種中, 采用微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)展了群體遺傳多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建及親緣關(guān)系的研究。在雙殼綱貝類(lèi)中, 蝦夷扇貝(Miiuhopecten yessoensis)[20]、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)[21]、馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)[22,23]和企鵝珍珠貝(P.penguin)[24]等均已有成功開(kāi)發(fā)利用的微衛(wèi)星標(biāo)記。

許多學(xué)者通過(guò)對(duì)物種的表型性狀數(shù)據(jù)與微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 從而確定物種性狀位點(diǎn)的功能和在染色體上的具體位置。如張群英等[25]利用15對(duì)EST-SSR標(biāo)記對(duì)中華鱉(Pelodiscus sinensis)體長(zhǎng)、體重、背甲長(zhǎng)和裙邊寬4個(gè)生長(zhǎng)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析, 發(fā)現(xiàn)5個(gè)位點(diǎn)與體長(zhǎng)、體重、背甲長(zhǎng), 裙邊寬顯著相關(guān); 安泉泉等[26]分析了106個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記與62尾牙鲆的體質(zhì)量、體高和體長(zhǎng)性狀的相關(guān)性,獲得了17個(gè)與這3個(gè)性狀相關(guān)的標(biāo)記。陳瓊[27]利用6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)馬氏珠母貝(Pinctada fucata martensii)表型性狀的相關(guān)性進(jìn)行分析, 得到與馬氏珠母貝殼髙、殼長(zhǎng)、殼寬、總重、左殼重、右殼重及珠層厚度7個(gè)性狀具有相關(guān)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。本研究旨在利用5個(gè)企鵝珍珠貝高度多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn), 進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析, 為企鵝珍珠貝分子遺傳標(biāo)記輔助選擇育種提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和生長(zhǎng)性狀數(shù)據(jù)測(cè)量

實(shí)驗(yàn)所用企鵝珍珠貝為廣西北海海區(qū)養(yǎng)殖的1齡群體, 隨機(jī)挑選無(wú)明顯損傷、表觀(guān)無(wú)病變、活力好的個(gè)體500個(gè), 取外套膜置于1.5 mL離心管中,用75%酒精固定, 并于24h后更換1次酒精, 后存儲(chǔ)在–20℃冰箱保存?zhèn)溆谩＠糜螛?biāo)卡尺測(cè)量企鵝珍珠貝形態(tài)性狀(圖1), 包括殼長(zhǎng)(mm)、殼高(mm)和殼寬(mm), 精確度為±0.02 mm; 擦干表面水分用天平稱(chēng)量總重(Y, g), 精確度為±0.01 g。形態(tài)性狀和體質(zhì)量數(shù)據(jù)采集方法參照林先鑫等[28]和魏海軍等[29]。

圖1 企鵝珍珠貝形態(tài)性狀圖解Fig.1 Morphological characters of Pteria penguin

1.2 DNA提取

采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取企鵝珍珠貝基因組DNA(天根生化科技有限公司,北京), 具體方法如下: 向剪碎的企鵝珍珠貝外套膜組織中加入200 μL GA緩沖液和20 μL 蛋白酶K(20 mg/mL), 56℃消化2—3h后, 加入200 μL緩沖液GB,70℃放置10min至溶液變清亮; 加入200 μL無(wú)水乙醇, 將所得溶液轉(zhuǎn)移至放入收集管中的吸附柱CB3中, 12000 r/min離心30s, 棄廢液, 將吸附柱CB3放回收集管中。依次向CB3中添加500 μL緩沖液GD、600 μL漂洗液PW(2次), 反復(fù)漂洗后晾干吸附柱, 最后加入50 μL洗脫緩沖液TE, 提取的DNA產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè), 檢測(cè)合格的基因組DNA用于后續(xù)引物篩選和PCR擴(kuò)增。

1.3 基因型分型

本試驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的5個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行500個(gè)企鵝珍珠貝的PCR擴(kuò)增。其中3個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記來(lái)自于許友卿[24], 2個(gè)來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室企鵝珍珠貝轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果, 這5對(duì)微衛(wèi)星引物序列信息如表1所示。

表1 5對(duì)微衛(wèi)星引物序列信息Tab.1 Parameters of the five microsatellite primers

在微衛(wèi)星標(biāo)記的正向引物5′端加FAM標(biāo)記, 熒光標(biāo)記引物由上海生工生物工程有限公司合成。將基因組DNA用作模板, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL, 包含50 ng基因組DNA、10 μL 2×TaqPCR Mix(天根生化科技有限公司, 北京)、0.6 μL正向熒光引物(10 μmol/L)和0.6 μL反向引物(10 μmol/L)、滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min, 之后進(jìn)入3個(gè)步驟的循環(huán), 即94℃變性30s, 各引物按各自退火溫度退火30s, 之后72℃延伸30s, 此循環(huán)共30次, 最后72℃延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后,送由上海生工進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

釆用毛細(xì)管電泳法分離PCR產(chǎn)物, 電泳圖譜使用Genotyper4.0(Applied Biosysterms)軟件分析, 精確讀出擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度及基因型的分型, 參照Weir等[30]、Botstein等[31]和Yeh等[32]的方法, 用Pop-Gene1.32軟件計(jì)算群體的觀(guān)測(cè)等位基因(Observed number of alleles,Na)、有效等位基因(Effective number of alleles,Ne)、觀(guān)測(cè)雜合度(Observed Heterozygosity,Ho)、期望雜合度(Expected Heterozygosity,He)、哈迪溫伯格平衡值(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)、Shannon’s指數(shù)(Shannon's Information index,I); 利用遺傳分析軟件Cervus3.0.7計(jì)算多態(tài)信息含量(Polymorphic Information Content, PIC)。

采用單因素方差分析法對(duì)5個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記和500個(gè)企鵝珍珠貝個(gè)體的生長(zhǎng)性狀(殼高、殼長(zhǎng)、殼寬和總重)進(jìn)行相關(guān)性分析。與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記不同基因型間再進(jìn)行多重比較, 找到與企鵝珍珠貝生長(zhǎng)性狀相關(guān)的基因型。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果若P＜0.05, 則認(rèn)為存在顯著差異。各微衛(wèi)星標(biāo)記不同基因型個(gè)體各生長(zhǎng)性狀的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差采用SPSS20.0軟件計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 遺傳多樣性分析

5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在企鵝珍珠貝群體中所檢測(cè)出的遺傳多樣性參數(shù)信息結(jié)果顯示(表2), 5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在500個(gè)企鵝珍珠貝中共檢測(cè)到48個(gè)等位基因,各個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)分別為8—12和3.87—6.70, QEB-C54的等位基因數(shù)(n=12)最多, QEB-C65和UN-4652的等位基因數(shù)(n=8)最少。QEB-D15有效等位基因數(shù)和CL-232標(biāo)記的有效等位基因數(shù)分別是最多和最少的。各位點(diǎn)的觀(guān)測(cè)雜合度為0.4286—0.5570, 其中CL-232的觀(guān)測(cè)雜合度最高, 位點(diǎn)UN-4652的觀(guān)測(cè)雜合度最低; 期望雜合度為0.7421—0.8512, 期望雜合度最高為QEB-D15, 最低為CL-232; 平均觀(guān)測(cè)雜合度為0.4907, 平均期望雜合度為0.7808, 顯示5個(gè)位點(diǎn)均具有較高的雜合性; 各位點(diǎn)多態(tài)信息含量均大于0.7000(0.7260—0.8520), 具有高度多態(tài)性。這5對(duì)微衛(wèi)星引物均顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P＜0.01)。

表2 五個(gè)SSR標(biāo)記在企鵝珍珠貝中的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of 5 SSR loci in the Pteria penguin population

2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記和生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性分析

在5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中, 微衛(wèi)星位點(diǎn)QEB-D15和CL-232與殼寬均呈極顯著相關(guān)(P＜0.01; 表3)。將這兩個(gè)位點(diǎn)不同基因型間進(jìn)行多重比較后發(fā)現(xiàn), 在QEB-D15位點(diǎn)中, 基因型是239/263的個(gè)體殼寬為最大值, 基因型是239/273的個(gè)體殼寬為最小值, 兩者之間存在顯著差異(P＜0.05)?；蛐褪?51/275的個(gè)體總重為最大值, 基因型為239/273的個(gè)體總重為最小值, 兩者之間差異顯著(P＜0.05; 表4)。在CL-232位點(diǎn)中, 基因型為157/174的個(gè)體殼寬為最大值, 基因型為177/192的個(gè)體殼寬為最小值, 兩者之間差異顯著(P＜0.05)?；蛐蜑?57/174的個(gè)體總重為最大值, 基因型為177/192的個(gè)體總重為最小值, 兩者之間差異顯著(P＜0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)基因型為157/174的個(gè)體殼長(zhǎng)、殼寬和總重的均值都是最大的, 推測(cè)為優(yōu)勢(shì)基因型, 與表型性狀存在正相關(guān)關(guān)系?；蛐蜑?77/192的個(gè)體殼長(zhǎng)、殼寬、殼高和總重的均值都最小, 推測(cè)為劣勢(shì)基因型(表5)。

表3 微衛(wèi)星位點(diǎn)與企鵝珍珠貝生長(zhǎng)性狀相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between microsatellite loci and phenotypic traits of Pteria penguin

表4 微衛(wèi)星位點(diǎn)QEB-D15不同基因型表型性狀的平均值及多重比較Tab.4 Means and multiple comparisons of different genotypic phenotypic traits of QEB-D15

表5 微衛(wèi)星位點(diǎn)CL-232不同基因型表型性狀的平均值及多重比較Tab.5 Means and multiple comparisons of different genotypic phenotypic traits of CL-232

3 討論

微衛(wèi)星標(biāo)記因具有高度多態(tài)性、易檢測(cè)、引物通用性強(qiáng)、重復(fù)性好和信息含量大等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用廣泛[13]。本研究利用5個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)企鵝珍珠貝500個(gè)個(gè)體進(jìn)行分型檢測(cè), Bostein等[31]對(duì)PIC的度量做出了具體限定, 本研究5個(gè)位點(diǎn)多態(tài)信息含量在0.726—0.852, 均為高度多態(tài)性位點(diǎn)。這5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記共檢測(cè)到48個(gè)等位基因, 其中等位基因數(shù)目最多的有12個(gè)(位點(diǎn)QEB-C54), 基本符合SSR位點(diǎn)對(duì)等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)的要求。

5個(gè)SSR標(biāo)記中, 平均每個(gè)SSR位點(diǎn)有9.6個(gè)等位基因, 平均觀(guān)測(cè)雜合度為0.4907, 平均期望雜合度為0.7808, 所有位點(diǎn)的觀(guān)測(cè)雜合度均小于期望雜合度。這種種質(zhì)退化現(xiàn)象在經(jīng)過(guò)多代人工繁育和近親繁殖的貝類(lèi)群體中普遍存在, 李琪等[33]對(duì)皺紋盤(pán)鮑(Pacific abalone)和葉瑩瑩等[34]對(duì)厚殼貽貝(Mytilus coruscus)的研究也證實(shí)了上述現(xiàn)象。微衛(wèi)星標(biāo)記雖然是一種優(yōu)點(diǎn)眾多的分子標(biāo)記手段, 但其有一個(gè)明顯缺點(diǎn)是: 存在無(wú)效等位基因, 使擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)純合子過(guò)剩, 從而導(dǎo)致了觀(guān)測(cè)雜合度比實(shí)際情況低的現(xiàn)象[35]。本研究檢測(cè)的企鵝珍珠貝為養(yǎng)殖群體, 存在一定程度的近交問(wèn)題, 加之微衛(wèi)星標(biāo)記無(wú)法檢測(cè)無(wú)效等位基因的問(wèn)題, 最終導(dǎo)致觀(guān)測(cè)雜合度小于期望雜合度。

微衛(wèi)星標(biāo)記在水產(chǎn)動(dòng)物的標(biāo)記-性狀相關(guān)性分析中應(yīng)用廣泛。陳瓊[27]對(duì)馬氏珠母貝的研究, 將6個(gè)SSR位點(diǎn)與7個(gè)表型性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn), 與貝殼珍珠質(zhì)層厚度具有相關(guān)性的有4個(gè)位點(diǎn), 其中兩個(gè)位點(diǎn)(PM6和4PM50)表現(xiàn)正相關(guān), 兩個(gè)位點(diǎn)(2PM206和3PM10)表現(xiàn)負(fù)相關(guān); 張曼等[36]從19個(gè)蝦夷扇貝SSR位點(diǎn)中找到4個(gè)與生長(zhǎng)性狀具有相關(guān)性的SSR標(biāo)記。在本研究中, 利用5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)企鵝珍珠貝表型性狀(包括殼長(zhǎng)、殼寬、殼高和總重)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn), QEB-D15和CL-232兩個(gè)位點(diǎn)與企鵝珍珠貝的殼寬均呈極顯著相關(guān)(P＜0.01),出現(xiàn)了殼寬與兩個(gè)SSR位點(diǎn)同時(shí)相關(guān)的現(xiàn)象, 這說(shuō)明殼寬這個(gè)表型性狀可能并非由單個(gè)基因控制, 這種單一性狀與多個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)存在相關(guān)性的現(xiàn)象在其他研究中也出現(xiàn)過(guò), 推測(cè)可能存在基因連鎖或多因一效現(xiàn)象[37—40]。

位點(diǎn)QEB-D15基因型為239/263的個(gè)體殼寬為最大值, 基因型為239/273的個(gè)體殼寬為最小值,263 bp等位基因可能與殼寬之間存在正相關(guān)關(guān)系,而273 bp等位基因可能與殼寬之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系;位點(diǎn)CL-232基因型為157/174的個(gè)體殼長(zhǎng)、殼寬、總重的均值較同一位點(diǎn)的其他基因型均為最大值,該基因型推測(cè)為優(yōu)勢(shì)基因型, 在育種實(shí)踐中, 可以作為優(yōu)先選擇的基因型; 而基因型為177/192的個(gè)體殼長(zhǎng)、殼寬、殼高和總重的均值較同一位點(diǎn)的其他基因型均為最小值, 推測(cè)該基因型為劣勢(shì)基因型。篩選出的微衛(wèi)星標(biāo)記可以為企鵝珍珠貝分子標(biāo)記輔助選擇育種提供理論依據(jù)和參考。