翟曉瑞，鞏永博，呂 偉，李雨果，魏豪杰，程蓉英，劉松財(cái)，張 英，郝林琳，張一寧

(1.吉林大學(xué) 第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130000；2.吉林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062；3.吉林公主嶺市鑫源牧業(yè)，吉林 公主嶺 136100)

梅花鹿屬哺乳綱、偶蹄目、鹿科、鹿屬的草食性動(dòng)物，是世界上現(xiàn)存41種可再生茸的鹿科動(dòng)物之一[1],被列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟》低危物種和中國(guó)國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物。梅花鹿是中國(guó)乃至世界鹿科的寶貴資源，我國(guó)吉林省占全國(guó)梅花鹿飼養(yǎng)量的50%[2-3]。據(jù)文獻(xiàn)記載，我國(guó)是世界上最早將鹿茸作為藥用的國(guó)家，至今已有2 000多年的歷史。《中華人民共和國(guó)藥典》記載：鹿茸有“強(qiáng)筋骨、益精血、精血虧虛、腎陽(yáng)不足、陽(yáng)痿滑精、羸瘦、宮冷不孕、畏寒、耳鳴、眩暈、腰脊冷痛、陰疽不斂、崩漏帶下”等藥效[4-5]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從鹿茸中提取出100多種化學(xué)成分，是鹿茸具有多種藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)[6]。鹿茸中獨(dú)特的化學(xué)成分以及再生機(jī)制也將會(huì)隨著科學(xué)發(fā)展為人類做出新的貢獻(xiàn)[7-9]。國(guó)內(nèi)外鹿茸市場(chǎng)的需求量與日俱增，以鹿茸為原料的藥品和保健食品也越來(lái)越多。目前，有研究表明鹿茸尖部含有豐富的氨基酸和多肽[10]，并且被證明能夠調(diào)控細(xì)胞增殖[11-12]，但是對(duì)于鹿茸根部骨化組織的功能卻鮮有報(bào)道。

鹿茸根部因骨化嚴(yán)重而不在出口之列，只能以鹿茸平均價(jià)格的1/4銷售，且深加工領(lǐng)域尚屬空白。因此對(duì)其根部骨化組織的研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)將成為提高鹿茸應(yīng)用價(jià)值的有效途徑。已有研究表明，鹿茸的不同部位無(wú)機(jī)元素含量明顯不同，鹿茸根部骨化部位鈣離子明顯高于尖部、中部，且鈣磷比接近2∶1[13]，是一種良好的潛在鈣來(lái)源[14]。因此，鹿茸根部骨化組織鈣提取工藝的建立，對(duì)增強(qiáng)鹿茸根部骨化組織市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。

鈣是人體內(nèi)含量最豐富的礦物質(zhì)元素，約占人體質(zhì)量的2%，不僅是構(gòu)成骨骼組織的主要礦物質(zhì)成分，而且在機(jī)體各種生理與生化反應(yīng)過(guò)程中起著重要作用。缺鈣現(xiàn)已成為影響人類生命質(zhì)量的一大公共衛(wèi)生問(wèn)題，根據(jù)2010—2013年全國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)城鄉(xiāng)居民一直處于不良的鈣營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)[15]，因此選擇適合的鈣補(bǔ)充劑是改善我國(guó)鈣營(yíng)養(yǎng)狀況的有效措施之一。目前市場(chǎng)上的鈣補(bǔ)充劑存在吸收率差、溶解度低、生物利用度低等缺陷。已有研究表明從生物的骨骼等組織中提取的有機(jī)鈣具有吸收率高、生物利用度高、毒副作用小、穩(wěn)定性佳等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的有機(jī)補(bǔ)鈣劑[12]。本研究通過(guò)優(yōu)化鹿茸根部骨化組織可溶性鈣提取工藝以獲得一種良好的新型鈣源，并建立人腸上皮細(xì)胞(Caco-2)模型以評(píng)價(jià)骨鈣的吸收效果，為鹿茸根部骨化組織的高值化利用提供新的發(fā)展方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑鹿茸根部骨化組織購(gòu)自吉林省長(zhǎng)生鹿業(yè)有限公司；無(wú)水蘋果酸、無(wú)水檸檬酸購(gòu)自河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；Caco-2細(xì)胞由吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院柳巨雄教授饋贈(zèng)；Transwell插入式培養(yǎng)皿購(gòu)自廣州潔特生物有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自HyClone公司；DMEM/F-12購(gòu)自Sigma公司；無(wú)鈣HBSS購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購(gòu)自Sigma公司；CCK-8試劑購(gòu)自日本同仁公司。

1.2 鹿茸骨粉的制備清洗鹿茸根部骨化組織并去除其外表皮，切片，去離子水清洗骨片上的血污等雜物，使用濾紙吸去骨片表面水分后室溫干燥，使用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)將其粉碎，經(jīng)100目篩得到鹿茸骨粉，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 單因素優(yōu)化鹿茸根部骨化組織鈣提取工藝1)酸種類對(duì)鈣含量的影響：在溫度為60℃、提取時(shí)間為40 min、酸用量為20%的條件下，分別用蘋果酸、檸檬酸以及混合酸(蘋果酸與檸檬酸1∶1混合)提取可溶性鈣，考察酸種類對(duì)鈣含量的影響。2)酸用量對(duì)鈣含量的影響：設(shè)定溫度為60℃，分別在酸用量為10%，20%，30%，40%和50%的條件下提取40 min，考察酸用量對(duì)鈣含量的影響。3)提取時(shí)間對(duì)鈣含量的影響：在溫度60℃，酸用量為20%的條件下，分別提取20，40，60，80和100 min，考察提取時(shí)間對(duì)鈣含量的影響。4)提取溫度對(duì)鈣含量的影響：設(shè)定酸用量為20%，分別在40，50，60，70和80℃的條件下提取40 min，考察提取溫度對(duì)鈣含量的影響。

1.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化鈣提取工藝在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取酸用量、提取溫度和提取時(shí)間作為考察變量，采用三因素三水平進(jìn)行正交分析，對(duì)鹿茸根部骨化組織鈣提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 鹿茸根部骨化組織鈣含量測(cè)定配制容量為10.00 mL，質(zhì)量濃度依次為2.5，5.0，10.0，20.0，40.0和80.0 mg/L Ca2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用火焰原子吸收光譜儀測(cè)定鈣含量。

1.6 骨鈣對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性試驗(yàn)根據(jù)ZOU等[16]的方法，將Caco-2細(xì)胞以1×105/孔細(xì)胞的密度接種于96孔板中，將其放置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，待細(xì)胞貼壁后，除去培養(yǎng)基，將100 μL不同濃度的樣品添加到培養(yǎng)基中。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培育24 h后，向培養(yǎng)皿添加10 μL CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱溫育1 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率，公式如下：細(xì)胞存活率=[D測(cè)定組/D空白組]×100%。

2 結(jié)果

2.1 骨鈣提取的酸種類結(jié)果如圖1所示，蘋果酸對(duì)骨鈣的提取效果更佳，相較于檸檬酸具有顯著性差異(P<0.05)，相較于混合酸具有極顯著性差異(P<0.01)，骨鈣含量為(5.941±0.008)mg/g，因此蘋果酸為最適的酸種類。

*.差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化骨鈣提取工藝

2.2.1蘋果酸用量對(duì)骨鈣含量的影響 結(jié)果如圖2所示，蘋果酸的用量對(duì)骨鈣含量影響較大，當(dāng)酸用量為10%時(shí)，骨鈣含量已達(dá)到(5.115±0.143)mg/g，隨著蘋果酸用量的增加,骨鈣含量的增加趨于平緩;當(dāng)酸用量為50%時(shí)，骨鈣含量為(5.691±0.051)mg/g，相較于10%酸用量?jī)H增加了0.576 mg/g?？紤]到成本及添加劑用量的限制，選擇蘋果酸的最適酸用量為10%。

圖2 蘋果酸用量對(duì)骨鈣含量的影響

2.2.2提取溫度對(duì)骨鈣含量的影響 結(jié)果如圖3所示，當(dāng)提取溫度小于50℃時(shí)，隨著溫度的增加骨鈣含量增加趨勢(shì)明顯；當(dāng)提取溫度超過(guò)50℃時(shí)，隨著溫度的增加骨鈣含量減小趨勢(shì)明顯，因此骨鈣最適的提取溫度為50℃，鈣含量為(5.925±0.013)mg/g。

圖3 提取溫度對(duì)骨鈣含量的影響

2.2.3提取時(shí)間對(duì)骨鈣含量的影響 結(jié)果如圖4所示，當(dāng)提取時(shí)間小于60 min時(shí)，隨著時(shí)間的增加骨鈣含量增加趨勢(shì)明顯；當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)60 min時(shí)，骨鈣含量隨著提取時(shí)間的增加逐漸趨于平緩;當(dāng)提取時(shí)間為100 min時(shí)，骨鈣含量為(5.623±0.008)mg/g，相較于60 min僅增加了0.061 mg/g，考慮到加工效率，選擇最適的提取時(shí)間為60 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)骨鈣含量的影響

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化骨鈣提取工藝由單因素試驗(yàn)結(jié)果，建立正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案(表1)其中A為酸用量，B為提取時(shí)間，C為提取溫度。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案因素水平表

由表2和3正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知，各因素對(duì)骨鈣含量影響的主次順序?yàn)椋篊(提取溫度)>B(提取時(shí)間)>A(酸用量)。因此，提取骨鈣含量的最佳組合為A1B3C3，即蘋果酸用量為5%、提取溫度55℃、提取時(shí)間70 min。因正交試驗(yàn)得出的最佳組合A1B3C3，在正交試驗(yàn)表里已列出，故得出在最佳組合條件下，骨鈣含量為(6.136±0.015)mg/g。

表2 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)分析

2.4 骨鈣對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，分別將31.25,62.50,125.00,250.00,500.00 mg/L的骨鈣作用于Caco-2細(xì)胞進(jìn)行毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明當(dāng)骨鈣質(zhì)量濃度從31.25變化至500.00 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率都在90%以上，即沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的毒性；并且當(dāng)骨鈣濃度從31.25變化至250.00 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率都在100%以上，表明骨鈣對(duì)細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用。

圖5 不同質(zhì)量濃度的骨鈣對(duì)Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性

2.5 Caco-2細(xì)胞對(duì)鈣攝取率的分析結(jié)果如圖6所示，分別將200 μg的骨鈣和CaCl2溶液置于上室，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30,60,90,120,150,180,240 min。結(jié)果表明：隨著時(shí)間的增加，Caco-2細(xì)胞單層模型中骨鈣組和CaCl2組的轉(zhuǎn)運(yùn)效率都有所提高并且骨鈣組轉(zhuǎn)運(yùn)效率明顯高于對(duì)照組，在30,60,90,120,150,180和240 min，骨鈣組的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)量相較于CaCl2組均具有差異極顯著(P<0.001)。

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)骨鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)量

3 討論

我國(guó)人工馴養(yǎng)的梅花鹿現(xiàn)總量約110萬(wàn)頭，我國(guó)吉林省鹿茸產(chǎn)量一直穩(wěn)居世界前列，但是鹿茸副產(chǎn)品卻并未得到合理的開(kāi)發(fā)利用，其深加工產(chǎn)品較少。骨化嚴(yán)重的鹿茸根部只能低價(jià)銷售，其附加值極低，為提高鹿茸根部骨化組織的應(yīng)用價(jià)值，本研究通過(guò)優(yōu)化鹿茸根部骨化組織可溶性鈣提取工藝，挖掘其深度利用價(jià)值。根據(jù)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)分析得到最優(yōu)提取工藝：蘋果酸用量5%，提取溫度55℃，提取時(shí)間70 min。在此條件下，骨鈣含量為(6.136±0.015)mg/g。

在我國(guó)，將近90%的人群存在缺鈣現(xiàn)象，通過(guò)增加食品中鈣的含量還不足以解決缺鈣問(wèn)題，提高吸收利用率是更有效的途徑。有機(jī)鈣是在無(wú)機(jī)鈣的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的第二代鈣源，相比較無(wú)機(jī)鈣溶解度、吸收率更高[15]，最常見(jiàn)的有機(jī)鈣是葡萄糖酸鈣和乳酸鈣，其吸收也不依賴于胃酸的消化，適合吸收障礙或腸炎的患者以及長(zhǎng)期膳食攝入鈣不足的個(gè)體。人體每天能吸收飲食攝入鈣的30%～80%。鈣主要通過(guò)腸道吸收，Caco-2細(xì)胞來(lái)自人體結(jié)腸癌細(xì)胞株，成熟、分化好的Caco-2細(xì)胞在體外環(huán)境中與小腸上皮細(xì)胞具有相似的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和標(biāo)志酶的功能表達(dá)，因此常被用于體外藥物吸收效果的評(píng)價(jià)。本研究通過(guò)蘋果酸溶解提取的蘋果酸鈣，實(shí)際上也具有低毒和更佳的吸收效果，研究建立了Caco-2細(xì)胞單層吸收模型并以CaCl2為對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)效果評(píng)價(jià)。試驗(yàn)結(jié)果表明有機(jī)補(bǔ)鈣劑組呈現(xiàn)低毒性，高轉(zhuǎn)運(yùn)并且相較于無(wú)機(jī)鈣組具有極顯著性差異。

本研究建立了一種鹿茸根部骨化組織有機(jī)補(bǔ)鈣劑的制備、檢測(cè)與評(píng)價(jià)工藝，所得提取工藝簡(jiǎn)單、骨鈣含量高、原料易得、毒性低、轉(zhuǎn)運(yùn)效果佳且具有一定實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。該研究也為復(fù)合鈣制劑、螯合鈣制劑等補(bǔ)鈣劑的發(fā)展提供理論依據(jù)，為鹿茸根部骨化組織的綜合利用提供了新的方向。