沈燁， 王子懿， 汪文平， 許文榮

(1. 江蘇大學附屬澳洋醫(yī)院普外科，江蘇 蘇州 215600； 2. 江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

常見消化道腫瘤包括食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等，根據(jù)2022中國癌癥統(tǒng)計[1-2]，結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、食管癌分別位列中國癌癥發(fā)病率的第2、3、4、6位，同時在中國癌癥死亡率中分列前5位，嚴重威脅著人類健康。因此，早診斷、早干預、早治療是消化道腫瘤個體化治療的迫切需求。

目前，小細胞外囊泡(small extracellular vesicles，sEV)正成為腫瘤診療臨床轉(zhuǎn)化研究的熱點。直徑<200 nm且具有脂質(zhì)雙分子層的sEV主要成分中包含外泌體(exosomes)，在體液中豐度較高，內(nèi)部富集蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和各類核酸分子及代謝物，這些分子具有來源細胞的特異性，因此，分析臨床樣本中sEV的種群大小、數(shù)量、理化成分變化等，將有助于闡明其來源腫瘤細胞的表型及其生物學作用，反映腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[3-4]。此外，sEV攜載特異性分子的藥物遞送系統(tǒng)有助于解決腫瘤治療中的特異性和靶向性問題，從而提高生物利用度、減少抗癌藥物的毒性次級效應(yīng)，表現(xiàn)出更佳的腫瘤靶向干預和增強藥物治療的效果[5]。

1 sEV與消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展機制

腫瘤來源的sEV參與調(diào)控腫瘤細胞侵襲遷移、促進血管生成、調(diào)節(jié)腫瘤干細胞特性和腫瘤微環(huán)境、影響腫瘤耐藥等消化道腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[6]。例如，肝癌細胞衍生的sEV可被脂肪細胞主動內(nèi)化，誘導產(chǎn)生炎癥表型，并在小鼠異種移植模型中觀察到腫瘤sEV處理的脂肪細胞可促進腫瘤生長，增加血管生成，并招募更多的巨噬細胞[7]。肝癌細胞分泌的sEV中miR-103通過靶向多個內(nèi)皮連接蛋白增加血管通透性，促進腫瘤轉(zhuǎn)移[8]。腫瘤來源的外泌體miR-1247-3p直接靶向β-1,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅲ，激活整合素β1-NF-κB信號通路，誘導癌癥相關(guān)成纖維細胞活化，促進肝癌的肺轉(zhuǎn)移[9]。

在胃癌細胞模型和小鼠腹膜腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)，胃癌患者惡性腹腔積液sEV可促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化信號通路[10]。在表達上調(diào)的胃癌患者血漿外泌體circRNA分子中，ciRS-133表達與棕色脂肪水平呈正相關(guān)，細胞來源外泌體可傳遞ciRS-133至前脂肪細胞，通過海綿miRNA-133上調(diào)PRDM16表達從而促進棕色樣細胞分化，參與胃癌惡病質(zhì)[11]。

一項女性食管癌研究報道[12]，干細胞樣細胞分泌的sEV中性別依賴的lncRNA FMR1-AS1通過激活TLR7-NFκB-c-Myc信號通路來維持干細胞樣細胞動態(tài)轉(zhuǎn)換狀態(tài)，進而促進FMR1-AS1介導的食管癌細胞重編程作用。

順鉑和紫杉醇可通過激活泛素特異性蛋白酶7/異質(zhì)核核糖核蛋白A1軸促進腫瘤微環(huán)境中癌癥相關(guān)成纖維細胞分泌sEV-miR-522，抑制花生四烯酸鹽脂氧合酶15，最終導致胃癌產(chǎn)生獲得性化療耐藥[13]。lncRNA前列腺雄激素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本1(PART1)通過調(diào)節(jié)miR-129/Bcl-2信號通路促進食管癌吉非替尼耐藥，并通過sEV傳播吉非替尼耐藥性[14]。

2 sEV在消化道腫瘤診斷中的應(yīng)用

目前臨床常規(guī)采用的腫瘤篩查與診斷指標仍為血清中蛋白類分子，其特異性及敏感性均不高[15]，但蛋白組學技術(shù)的發(fā)展使得血液外泌體中腫瘤蛋白類標志物的特異性和敏感性均可達到90%以上[16]。而隨著分離檢測技術(shù)的發(fā)展，sEV中的各種遺傳信息作為診斷標志物越來越受到關(guān)注[17]，在生物信息學技術(shù)的輔助分析下不斷挖掘sEV中富集的miRNA、lncRNA、circRNA、tsRNA等高特異性和敏感性的標志物(表1)，且檢測方法也不斷優(yōu)化。

表1 消化道腫瘤中sEV分子標志物與臨床診斷相關(guān)性

2.1 蛋白類標志物

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種消化道腫瘤sEV來源的蛋白類分子標志物。例如，sEV中的S100A4通過激活STAT3磷酸化上調(diào)骨橋蛋白表達，從而促進肝癌轉(zhuǎn)移，這表明S100A4可作為肝癌轉(zhuǎn)移的預后標志物[34]。結(jié)腸癌患者血清sEV中熱休克蛋白40家族蛋白DNAJB8高表達，除與較低的總生存期和無病生存期相關(guān)以外，還可作為奧沙利鉑耐藥的標志物[35]。

血清sEV中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican 1，GPC1)可以有效鑒別早期胰腺癌與良性胰腺疾病[35]。Li等[36]利用分層表面增強拉曼散射底物和快速富集策略磁珠@外泌體@SERS檢測探針構(gòu)建了一個高靈敏度的檢測系統(tǒng)，并基于外泌體蛋白質(zhì)組學分析選擇富亮氨酸α2糖蛋白1(leucine-rich α2-glycoprotein 1,LRG1)+外泌體(LRG1-Exos)和GPC1+外泌體(GPC1-Exos)為標志物組合，直接定量檢測臨床樣本中的特異性外泌體，結(jié)果顯示胰腺癌的診斷效率顯著提高，曲線下面積(area under curve,AUC)為0.95。

2.2 miRNA分子標志物

miRNA是腫瘤sEV相關(guān)研究報道中常見的標志物。例如，結(jié)直腸癌患者血清sEV中miR-17-92a高表達與復發(fā)相關(guān)，miR-19a高表達則與預后差相關(guān)[25]。食管癌患者組織和血清sEV中miR-339-5p低表達，且與放療敏感性相關(guān)，故可預測局部晚期食管癌術(shù)前放療的病理反應(yīng)[19]。

越來越多的研究報道將這些特異性標志物檢測方法與計算機功能進行合理組合，可獲得更優(yōu)異的診斷效能。例如，一項胰導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)多中心研究挖掘并設(shè)計了8個sEV-miRNA的檢測Panel，可診斷PDAC各個階段，尤其是對Ⅰ和Ⅱ期PDAC的診斷效率較高(AUC達0.93)[31]。

2.3 lncRNA分子標志物

lncRNA主要通過影響腫瘤增殖、遷移、耐藥、促進血管生成等方式參與調(diào)控[6]，因此，消化道腫瘤sEV內(nèi)的lncRNA分子同樣具有重要的診斷應(yīng)用價值。例如，血漿sEV內(nèi)lncRNA-GC1作為胃癌早期檢測指標具有較高的診斷效能(AUC達0.90)[37]。食管癌患者血清sEV中l(wèi)ncRNA PART1的表達水平可用于吉非替尼療效的評估指標[14]。腫瘤相關(guān)巨噬細胞sEV內(nèi)lncRNA CRNDE表達上調(diào)，并通過腫瘤相關(guān)巨噬細胞來源的sEV轉(zhuǎn)移到胃癌細胞中，促進PTEN泛素化，降低了順鉑敏感性，故可作為順鉑耐藥的預測標志物[23]。

2.4 circRNA分子標志物

近年來，circRNA分子因其穩(wěn)定的生物學特性和在體液中較高的豐度成為腫瘤標志物的研究熱點。肝癌患者血清sEV中circTMEM181與抗PD-1耐藥相關(guān)，通過上調(diào)巨噬細胞中CD39的表達，進而協(xié)同肝癌細胞中CD73激活細胞外ATP-腺苷通路，促進免疫抑制和抗PD-1耐藥性[30]。胃癌患者組織和血清sEV內(nèi)circSHKBP1高表達與TNM晚期和低生存率相關(guān)，通過miR-582-3p/HUR/VEGF路徑抑制HSP90降解，從而促進胃癌進展，胃癌術(shù)后sEV內(nèi)circSHKBP1低表達，故可用于胃癌診斷和預后評價的生物標志物[24]。

目前已有學者在開發(fā)系統(tǒng)而全面的生物標志物液體活檢方法用于腫瘤早期檢測，Roy等[38]構(gòu)建了血清8種circRNA生物標志物組合，其特異性和敏感性均優(yōu)于經(jīng)典的胃癌診斷標志物，不僅能夠早期檢測胃癌患者，而且可以與其他胃腸道腫瘤進行鑒別。

2.5 tsRNA分子標志物

隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學的應(yīng)用，轉(zhuǎn)移RNA(transfer RNA,tRNA)衍生的小RNA(tsRNAs)被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控基因沉默、RNA穩(wěn)定性、逆轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯等過程，與細胞增殖、凋亡等相關(guān)。食管癌患者唾液sEV中特異性富集tRNA-GlyGCC-5，不僅具備診斷和預后標志物的潛力，而且能用于評估患者從輔助治療中獲益的可能性[21]。肝癌患者血漿sEV中4種tsRNA(tRNA-ValTAC-3、tRNA-GlyTCC-5、tRNA-ValAAC-5和tRNA-GluCTC-5)水平顯著升高，可作為肝癌診斷標志物[39]。

3 sEV在消化道腫瘤治療中的應(yīng)用

目前，天然或者工程化修飾的sEV正被廣泛用于治療難治性腫瘤，這是因為sEV可能富集與免疫治療、靶向治療、放化療等耐藥相關(guān)的特異性分子，將其作為靶點則可能會增強療效。另一方面，sEV具有作為納米載體可介導細胞間信息傳遞的特性[40]，故而對其工程化攜載特異性分子以期優(yōu)化靶向性，從而改善預后(圖1)。

圖1 sEV應(yīng)用于臨床治療常見策略

3.1 sEV與靶向治療策略

迄今，靶向治療策略主要有3類設(shè)計：① 采用siRNA或過表達直接靶向作用于sEV中特異性分子，阻斷腫瘤生長；② 利用間充質(zhì)干細胞作為藥物遞送系統(tǒng)的生物材料，攜載特異性分子或藥物，提高靶向性，增加腫瘤內(nèi)藥物有效濃度；③ 利用腫瘤組織來源的sEV對其親本細胞具有內(nèi)在的趨向性，改變腫瘤細胞生長環(huán)境刺激sEV分泌，提高親緣細胞對sEV的攝取率，并對重編程sEV進行工程化，從而改善療效。

circRNA-SORE通過sEV轉(zhuǎn)運在肝癌細胞中傳播索拉非尼耐藥性，Xu等[41]對不同的肝癌小鼠模型注射siRNA沉默circRNA-SORE，發(fā)現(xiàn)可以顯著抑制索拉非尼的耐藥性，為緩解晚期肝癌患者索拉非尼耐藥提供了潛在策略。

Zhou等[42]認為胰導管腺癌免疫治療的關(guān)鍵在于誘導更多的瘤內(nèi)效應(yīng)免疫細胞及逆轉(zhuǎn)免疫抑制，故設(shè)計了一種基于外泌體的雙傳遞生物系統(tǒng)，使用骨髓間充質(zhì)干細胞sEV負載半乳糖凝集素-9siRNA并在表面飾以奧沙利鉑前藥，構(gòu)建成一個免疫原性細胞死亡觸發(fā)器。在該傳遞系統(tǒng)作用下，破壞半乳糖凝集素-9/dectin1軸，逆轉(zhuǎn)M2樣腫瘤相關(guān)巨噬細胞的腫瘤免疫抑制作用，募集細胞毒性T淋巴細胞和下調(diào)Treg細胞，誘導抗腫瘤免疫，從而增強PDAC免疫治療的效果。

Xu等[43]基于無銅的點擊化學方法對分離的外泌體進行熒光標記，這不僅為點擊化學和sEV攝取研究提供了一種簡單可靠的表面修飾方法，并可作為臨床前sEV腫瘤治療合理化設(shè)計方法的基礎(chǔ)。Gong等[44]將親水光敏劑與胃癌細胞在低pH環(huán)境下共培養(yǎng)，將所獲sEV裝載多柔比星，這種智能藥物遞送平臺不僅能提高靶向性，還能在近紅外輻射下解構(gòu)sEV，釋放化療藥物，為聯(lián)合光動力學治療提供思路。

3.2 sEV與放化療策略

放化療作為傳統(tǒng)治療方案最大的挑戰(zhàn)是隨著腫瘤的進展而產(chǎn)生耐藥性。近年來，在高通量測序技術(shù)和生物信息學技術(shù)的應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)sEV中富集與放化療敏感性相關(guān)的特異性分子，這為臨床增強放化療效果提供了新的思路。例如，食管癌患者組織和血清sEV中miR-339-5p低表達，且在食管癌細胞的放射耐藥亞群中下調(diào)，miR-339-5p通過靶向Cdc25A來介導放射敏感性，故可通過干預sEV中miR-339-5p水平提高放療效果[19]。結(jié)腸癌患者奧沙利鉑耐藥可能的作用機制在于sEV介導的DNAJB8抑制TP53的泛素化降解，導致MDR1上調(diào)，因此DNAJB8可作為干預奧沙利鉑耐藥的治療靶點[34]。

3.3 sEV與其他治療策略

除了靶向治療和放化療以外，腫瘤疫苗的研究也有進展。研究發(fā)現(xiàn)樹突細胞來源的外泌體(dendritic cell-derived exosomes,DEXs)形成了一種新的腫瘤免疫治療疫苗，富含甲胎蛋白的DEXs可以觸發(fā)強大的抗原特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，重塑肝癌小鼠的腫瘤微環(huán)境，從而為肝癌免疫治療提供了一種無細胞疫苗選擇[45]。

4 展望

盡管sEV的分離和檢測技術(shù)尚存在差異化，但基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學、代謝組學與生物信息學技術(shù)的應(yīng)用使得sEV中標志物具備了早期診斷標志物的潛力，更多研究則為臨床建立特異性檢測Panel提供了依據(jù)。此外，新的檢測技術(shù)也在不斷開發(fā)，如ExoSD芯片技術(shù)對胃癌早期患者血清樣本的檢出率可達70%[46]。

腫瘤異質(zhì)性是臨床腫瘤診療中的挑戰(zhàn)，sEV也可能通過信號傳導促進腫瘤異質(zhì)性的發(fā)生[40]。因此，在選擇外泌體作為腫瘤診斷與預后監(jiān)測的分子標志物時應(yīng)考慮到腫瘤異質(zhì)性的發(fā)生機制。

天然或者工程化修飾的sEV被視為一種新的腫瘤靶向治療理想的工具，體外實驗和動物實驗結(jié)果在藥物遞送系統(tǒng)設(shè)計和優(yōu)化放化療方案方面均展示了良好的應(yīng)用前景，但在治療時應(yīng)考慮sEV的給藥劑量，因為不同的劑量可能會引起不同的生物效應(yīng)，此外，機體對sEV的清除作用及其異質(zhì)性增加了確定精確應(yīng)用劑量的難度[17]。

總之，sEV作為機體自然分泌的穩(wěn)定存在的成分，富含特異性遺傳信息，可用于消化道腫瘤的篩查、診斷、預后和療效評估，在經(jīng)過特定修飾后可提高治療的靶向性，增強藥物的有效性，在深入研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)盡快推動其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究。