張珊， 毛朝明， 董利陽， 劉佳夢， 鄭婷婷， 高學榮， 徐小衛(wèi)， 羅鑫凱， 汪雪峰

(江蘇大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)是一類以橋本甲狀腺炎為代表的內分泌系統(tǒng)常見病，是臨床上最常見的自身免疫性疾病(約占30%)[1-2]。全球AIT的患病率為1%～2%，我國AIT患病率超過10%，并呈現逐年上升態(tài)勢[3]。AIT的主要病理特征是甲狀腺組織內大量淋巴細胞浸潤(以Th1為主)、甲狀腺濾泡結構破壞和甲狀腺自身抗體如甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)產生[4-5]。AIT是導致甲狀腺功能減退的主要疾病，臨床目前仍無有效干預手段[6]。

大量研究證實，蠕蟲感染對自身免疫性疾病存在抑制作用，據此而衍生的蟲源產品成為當前治療自身免疫性疾病的候選藥庫[7]。本課題組前期研究發(fā)現，日本血吸蟲源多肽SJMHE1可顯著改善小鼠急慢性結腸炎和膠原誘導的關節(jié)炎[8-9]，展現出潛在的自身免疫性疾病的治療功效。本研究旨在探究SJMHE1對AIT小鼠的作用并初步揭示其作用機制，為AIT的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雌性C57BL/6小鼠25只，6～8周齡，體重(18±2)g，購自揚州大學比較醫(yī)學中心。所有動物在12/12 h光暗循環(huán)和40%～60%相對濕度環(huán)境下飼養(yǎng)，并在實驗前對環(huán)境條件進行3～4 d的適應。本研究依照江蘇大學動物保護和使用委員會指南協議進行。

1.2 主要試劑

豬甲狀腺球蛋白(porcine thyroglobulin,pTg)，弗氏完全佐劑(complete Freund′s adjuvant,CFA)以及弗氏不完全佐劑(incomplete Freund′s adjuvant,IFA)均購自美國Sigma公司；日本血吸蟲源多肽SJMHE1由Top-peptide(中國上海)合成和純化；逆轉錄試劑盒購自美國Genecopoeia公司；熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；流式細胞儀購自美國BD公司；ELISA試劑盒購自杭州聯科生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 建立小鼠AIT模型 將15只小鼠隨機分為對照組、AIT組、AIT+SJMHE1組，每組5只。為誘導小鼠AIT，將100 μg pTg乳化于等量的CFA中，并于第0天皮下注射于小鼠體內(對照組除外)。初次免疫2周后，給予該批小鼠相同劑量的pTg，并以1 ∶1的比例乳化于IFA中。為誘導AIT，小鼠全程用500 mg/L高碘水喂養(yǎng)。在造模前第7天，造模0、14 d給AIT-SJMHE1組小鼠皮下注射10 μg SJMHE1(與IFA制成100 μL乳化劑)。于第28天安樂死所有小鼠，采集血樣和甲狀腺組織樣本，用于后續(xù)檢測。

1.3.2 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察小鼠甲狀腺組織病理變化 每只小鼠使用5個不連續(xù)的冠狀切片來觀察甲狀腺組織病理改變。安樂死小鼠后，沿頸部正中剪開皮膚，將肌肉分離以顯露甲狀腺。用眼科剪刀摘除腺體，并用4%甲醛固定，石蠟包埋，制備4 μm厚的切片，隨后進行HE染色。甲狀腺炎癥評分基于甲狀腺浸潤的百分比，0分：沒有浸潤；1分：1個或2個卵泡周圍有炎性細胞的積聚；2分：存在達到卵泡大小的1個或2個炎性細胞灶；3分：10%～40%的炎性細胞浸潤；4分：>40%的炎性細胞浸潤。

1.3.3 化學發(fā)光法檢測小鼠血清TgAb 將收集的小鼠血樣室溫放置30 min，待血樣凝集后以1 000×g離心10 min以去除沉淀物，即刻檢測，或者分裝于-20 ℃以下凍存。采用全自動化學發(fā)光測定儀(Maglumi 4000 Plus)檢測小鼠血清中TgAb的含量。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測小鼠甲狀腺和脾臟中IFN-γ和IL-10mRNA表達 用RNAiso Plus(TaKaRa公司)提取甲狀腺組織和脾臟RNA，用逆轉錄試劑盒逆轉錄1 μg的總RNA得到cDNA。按照制造商的說明，以β-肌動蛋白為內參，進行實時定量PCR分析。引物由美國Genecopoeia公司設計合成。引物序列分別如下：β-肌動蛋白上游引物為5′-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物為5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′；IFN-γ上游引物為5′-CGGGACACAATGAAGCCTA-3′，下游引物為5′-CTTGCTGATTATGCCATT-3′；IL-10上游引物為5′-GACCAG-CTGAAGTGACTA-3′，下游引物為5′-GATAAGGCTCAACCGTTA-3′。PCR反應體系組成如下：TB Green Premix ExTaqⅡ 10 μL、上下游引物各0.8 μL、DNA模板2 μL、滅菌水6.4 μL；兩步法PCR擴增程序如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃退火5 s，60 ℃延伸20 s，40個循環(huán)；熔解曲線分析。

1.3.5 ELISA檢測小鼠血清中IFN-γ和IL-10的含量 根據試劑盒說明書，采用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中細胞因子IFN-γ和IL-10的含量。檢測樣本避免反復凍融，在檢測前將樣本緩慢地恢復至室溫，輕柔地混勻。

1.3.6 流式細胞術檢測FITC-SJMHE1在小鼠甲狀腺組織及脾臟的定位情況 另外選取10只未經過任何處理的雌性C57BL/6小鼠，隨機分為實驗組和對照組，每組5只。將熒光標記的多肽FITC-SJMHE1于皮下注射入實驗組小鼠體內，對照組小鼠注射等量PBS。3 d后安樂死小鼠，并收集小鼠甲狀腺和脾臟于冰上研磨；吸取研磨液至離心管，1 500 r/min離心5 min；棄上清液，加紅細胞裂解液2 mL，混勻，靜置2 min；離心去上清液，并用1 mL緩沖液重懸；用牛鮑計數板于鏡下計數，吸取105個細胞至含300 μL緩沖液的流式管中，用100 μL多聚甲醛固定后，用流式細胞分析儀檢測FITC-SJMHE1在甲狀腺和脾臟中的表達。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 SJMHE1對AIT小鼠甲狀腺組織學及血清TgAb水平的影響

與對照組相比，AIT小鼠甲狀腺濾泡大小不均、結構破壞明顯且周邊有大量炎癥細胞浸潤；與AIT組相比，SJMHE1減輕了AIT小鼠甲狀腺濾泡的破壞及濾泡間淋巴細胞的浸潤。甲狀腺組織炎癥評分顯示3組小鼠間差異有統(tǒng)計學意義(F=30.73，P<0.01)，AIT組小鼠甲狀腺組織炎癥評分較對照組顯著上升(P<0.01)，而SJMHE1的處理則顯著下調了AIT組小鼠的炎癥評分(P<0.01)?；瘜W發(fā)光結果顯示，AIT組小鼠血清TgAb水平明顯高于對照組，SJMHE1則顯著降低了AIT小鼠血清TgAb水平(P<0.01)。見圖1。

A：甲狀腺組織病理變化(HE染色,×400)；B：甲狀腺組織病理炎癥評分；C：血清TgAb水平

2.2 SJMHE1對AIT小鼠甲狀腺組織中IFN-γ和IL-10 mRNA表達的調節(jié)

與對照組相比，AIT組小鼠甲狀腺組織IFN-γ和IL-10mRNA的表達明顯升高(P均<0.01)；與AIT組相比，AIT+SJMHE1組IFN-γmRNA的表達明顯降低(P<0.05)，而IL-10mRNA的表達明顯升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 SJMHE1降低AIT小鼠甲狀腺組織中

2.3 SJMHE1對AIT小鼠脾臟組織中IFN-γ和IL-10 mRNA表達量的調節(jié)

與對照組相比，AIT組小鼠脾臟中IFN-γmRNA表達明顯升高(P<0.01)，而IL-10mRNA表達無顯著差異(P>0.05)；與AIT組相比，SJMHE1處理顯著降低AIT小鼠脾臟中IFN-γmRNA表達，而上調IL-10mRNA表達，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖3。

圖3 SJMHE1降低AIT小鼠脾臟中

2.4 SJMHE1對AIT小鼠血清中IFN-γ和IL-10含量的調節(jié)

與對照組相比，AIT組小鼠血清中IFN-γ和IL-10含量均顯著升高(P均<0.01)。與AIT組相比，SJMHE1干預后小鼠血清中IFN-γ含量顯著下降(P<0.01)，而IL-10含量顯著升高(P<0.05)。見圖4。

圖4 SJMHE1降低AIT小鼠血清中IFN-γ并上調IL-10含量

2.5 SJMHE1在小鼠甲狀腺及脾臟中的分布

給予小鼠FITC-SJMHE1注射后，流式細胞術檢測結果顯示，FITC熒光標記的SJMHE1存在于小鼠脾臟組織，而甲狀腺組織未檢測到相應熒光標記蛋白。見圖5。

圖5 FITC-SJMHE1在小鼠甲狀腺及脾臟中的分布

3 討論

逐年上升的患病率以及由此導致的甲狀腺功能破壞使得探尋AIT的新型防治策略成為研究熱點?！靶l(wèi)生假說”指出，一些感染性病原體，特別是蠕蟲，有能力影響宿主的免疫系統(tǒng)，它們在感染宿主的同時亦可預防宿主自身免疫性疾病的發(fā)生，從而改善對炎癥反應的調節(jié)。這種抑制炎癥的能力既符合宿主的利益，也符合寄生蟲的利益，是數百萬年共同進化的結果[10]?；诖擞^點，“蠕蟲療法”被廣泛用于一些自身免疫性疾病的防治，例如口服豬鞭蟲可緩解炎性腸病患者的病情[11]。本研究發(fā)現，日本血吸蟲源多肽SJMHE1在AIT小鼠發(fā)病中發(fā)揮干預作用，SJMHE1可顯著減輕AIT小鼠甲狀腺炎癥反應并降低血清中自身抗體TgAb的水平，這在進一步補充“蠕蟲產品”的同時亦為AIT的防治提供了新策略。

AIT是由免疫紊亂而引發(fā)的器官特異性自身免疫性疾病，也是甲狀腺最常見的病理狀態(tài)，多種細胞因子在其發(fā)病中扮演重要角色[12-13]。Th1細胞釋放的促炎因子如IFN-γ會促進甲狀腺細胞的凋亡、抑制甲狀腺激素的合成進而引發(fā)甲狀腺功能障礙[14-15]。IL-10是一種經典的具有抗炎特性的細胞因子，可抑制宿主針對病原體產生過度的免疫反應，減輕炎癥引發(fā)的組織破壞，從而在包括AIT在內的自身免疫性疾病中發(fā)揮抑制自身免疫反應的重要作用[16-18]。本研究結果表明，SJMHE1可顯著降低AIT小鼠甲狀腺組織中IFN-γmRNA的表達，而上調IL-10mRNA的表達，這從分子層面提示SJMHE1可通過調節(jié)IFN-γ和IL-10來抑制免疫炎癥反應，從而對AIT發(fā)揮一定的預防和治療作用。

本課題組前期研究發(fā)現，SJMHE1不僅可調節(jié)過敏性哮喘小鼠肺組織中促炎和抗炎細胞因子的表達，亦對脾臟中促炎及抗炎細胞因子有平衡作用[19-20]。本研究發(fā)現SJMHE1可下調AIT小鼠甲狀腺和脾臟組織中IFN-γmRNA的表達，且上調IL-10mRNA的表達，提示SJMHE1對局部或(和)全身免疫應答有著調節(jié)作用。在此基礎上，本研究進一步通過流式技術分析了FITC-SJMHE1在小鼠體內的分布，發(fā)現SJMHE1并不能到達小鼠甲狀腺組織，然而可以到達脾臟組織，這一結果推測SJMHE1對AIT的干預并非通過對甲狀腺組織的直接作用，而是借由固有免疫器官脾臟的免疫調節(jié)來發(fā)揮功能。此外，ELISA檢測結果表明SJMHE1可下調AIT小鼠血清中IFN-γ而上調IL-10的含量。綜上結果提示，SJMHE1可能通過對脾臟IFN-γ及IL-10的調節(jié)來緩解AIT小鼠甲狀腺病理損傷。然而，SJMHE1調節(jié)IFN-γ及IL-10的具體作用機制仍需在今后的研究中進一步闡明。