固相萃取-氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蟹肉中六種膽固醇氧化物

胡磊，謝慶超,2，劉海泉,2,3*，趙勇,2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，上海，201306) 3(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)

中華絨螯蟹俗稱大閘蟹，因其口感風(fēng)味良好，營養(yǎng)成分豐富而廣受消費者喜愛[1]。中華絨螯蟹中富含膽固醇，膽固醇作為一種重要的化合物，參與維持細胞膜的滲透性和流動性，并能夠作為前體合成膽汁酸和固醇激素[2-3]。新鮮的蟹肉中幾乎不存在膽固醇氧化物(cholesterol oxides，COPs)，外源性COPs在蟹肉中通過膽固醇的光氧化、熱氧化等反應(yīng)過程而形成。烹飪、輻射和儲藏方式都會促進COPs的產(chǎn)生[4-5]。氧化產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上與膽固醇相似，但對人體健康有危害。目前常見的COPs約有25種，包括5，6α-環(huán)氧化膽固醇、膽甾烷-3β，5α，6β-三醇、7α-膽固醇、7β-羥基膽固醇、7-酮基膽固醇和25-羥基膽固醇等。研究表明，部分膽固醇氧化物具有細胞毒性，誘導(dǎo)細胞異常凋亡，會對人體健康造成不良影響[6-7]。

利用現(xiàn)代儀器分析技術(shù)檢測膽固醇氧化物是目前主流的手段，液相色譜與氣相色譜技術(shù)在一定程度上能夠滿足部分肉制品中COPs分離的需要[8-10]，但液相色譜的分離效果取決于色譜柱的容量，COPs的分離要求較高，因此液相色譜法對COPs的分離效果有限。結(jié)合目前廣受歡迎的質(zhì)譜分離技術(shù)，更能準(zhǔn)確地分離并定量不同類型的的膽固醇氧化物[11-17]，但液相色譜-質(zhì)譜法由于儀器設(shè)備昂貴，用于定量COPs并不普遍。氣相色譜法可對COPs實現(xiàn)有效分離，而氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合了氣相色譜的高分離度和質(zhì)譜的高靈敏度，適合食品中COPs的分離和檢測。本工作通過優(yōu)化樣品的前處理條件及色譜-質(zhì)譜條件，建立了固相萃取-氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蟹肉中6種COPs含量的方法，并對經(jīng)加熱處理后中華絨螯蟹蟹肉中膽固醇氧化物進行分析，為評價加熱處理的中華絨螯蟹安全性提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華絨螯蟹，上海海洋大學(xué)崇明養(yǎng)殖基地；雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺，上海聯(lián)碩科技有限公司；甲醇、正己烷、丙酮、乙腈、三氯甲烷、無水乙醚、乙酸乙酯(均為色譜純)，麥克林公司；無水吡啶，上海試一化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鈉(分析純)，嘉興艾森化工有限公司。

6種COPs標(biāo)準(zhǔn)品：膽甾烷-3β，5α，6β-三醇(97%)，凱試(上海)科技有限公司；7β-羥基膽固醇(99%)，上海撫生實業(yè)有限公司；5α，6α-環(huán)氧化膽固醇(95%)，麥克林公司；7α-羥基膽固醇(98%)、7-酮基膽固醇(98%)，吳?；瘜W(xué)有限公司；25-羥基膽固醇(99%)，TRC公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ 800型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher公司；HP-5 ms型毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent公司；MTN-2800D型氮吹儀，上海申生科技有限公司；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SH2-3型循環(huán)水多用真空泵、VORTEX-3型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；BSAP243-CW型萬分之一天平，德國Sartorius公司；SBEQ-CG1824型固相萃取裝置、HLB固相萃取柱(200 mg, 6 mL)，德國CNW公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

(1)COPs單標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取6種COPs標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg，用正己烷溶解并定容至10 mL。

(2)COPs混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別移取6種COPs單標(biāo)準(zhǔn)儲備液5 mL，用正己烷溶解并定容至50 mL，配制50 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃條件下保存。

(3)COPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列：分別移取COPs混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液40、100、200、1 000、2 000 μL，用正己烷稀釋，得到0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理

樣品提?。簻?zhǔn)確稱取4.0 g均質(zhì)的樣品于離心管中，加入30 mLV(甲醇)∶V(氯仿)=1∶2混合溶液，充分振蕩，于4 ℃條件下避光靜置12 h，然后經(jīng)過盛有5.0 g無水硫酸鈉的漏斗過濾后轉(zhuǎn)移到100 mL的平底燒瓶中，于40 ℃真空條件下，蒸發(fā)至無水后，溶解于5 mL的正己烷，過0.22 μm有機濾膜，得到提取液。

樣品凈化：向已提前活化的固相萃取柱中平緩注入已得到的提取液，過柱后棄去，依次用10 mL含10%乙醚和20 mL 20%乙醚的正己烷溶液進行淋洗，除去雜質(zhì)后用6 mL丙酮對保留的目標(biāo)物進行洗脫，收集含有待測組分的濾液，在氮吹儀中進行吹干。

樣品衍生化：加入500 μL無水吡啶和100 μL的雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺，V(無水吡啶)∶V[雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺]=5∶1，于25 ℃的條件下避光衍生化1 h，衍生化結(jié)束后用氮氣吹干，1 mL正己烷定容，待上機檢測。

1.3.3 儀器工作條件

1.3.3.1 色譜條件

采用HP-5 ms型毛細管色譜柱對COPs進行分離，1 mL/min的載氣(He)流速；升溫程序：初始溫度為200 ℃(保持5 min)，再升至270 ℃(10 ℃/min，保持1 min)，繼續(xù)升至280 ℃(2 ℃/min，保持1 min),最后升至300 ℃(5 ℃/min，保持10 min)；采用不分流進樣模式，進樣體積為1 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

采用電子轟擊(EI)離子源；離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度260 ℃，四極桿溫度為150 ℃，設(shè)定70 eV的電離能量和選擇離子掃描(SIM)模式，溶劑延遲為5 min，對6種COPs的質(zhì)譜離子進行掃描監(jiān)測。

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 方法的線性和檢出限

取COPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列按1.3.2方法進行衍生化反應(yīng)并上機，6種COPs不同梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的定量離子峰面積作為縱坐標(biāo)，得到線性方程，并以產(chǎn)生3倍信噪比(S/N)時化合物的質(zhì)量濃度為檢出限。

1.3.4.2 精密度與回收試驗

選取新鮮的中華絨螯蟹蟹肉進行均質(zhì)，作為空白樣品，分別加入低、中、高3種濃度的COPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并根據(jù)1.3.2方法分別進行3次水平平行實驗，進行相應(yīng)加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviations,RSD)的計算。

1.3.5 基質(zhì)效應(yīng)

本實驗取空白蟹肉樣品，配制與標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度水平相同的空白基質(zhì)溶液，將兩種溶液上機，分別記錄各自對應(yīng)的響應(yīng)值，對應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)ME的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A為添加樣品基質(zhì)溶液響應(yīng)值；B為純標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器工作條件的確定

2.1.1 色譜條件的選擇

本實驗采用HP-5 ms毛細管色譜柱。文獻中提到，當(dāng)色譜柱溫度低于200 ℃時，COPs均不能被檢出；溫度超過300 ℃，COPs對應(yīng)的信號響應(yīng)值不會改變[18]?？紤]到衍生化后的COPs結(jié)構(gòu)差別不大，為更好地區(qū)分不同COPs的色譜峰，提高檢測靈敏度，通過不斷優(yōu)化，確定了合適的柱溫升溫程序(見1.3.3.1)。采用單標(biāo)溶液進樣，確定了6種COPs的保留時間分別為11.36、12.95、15.14、17.57、19.80、20.46 min；再通過混標(biāo)進樣，分析得到6種COPs標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖，如圖1所示，所有的COPs在21 min內(nèi)實現(xiàn)了完全分離，分離效果良好。

1-7α-羥基膽固醇；2-7β-羥基膽固醇；3-5α，6α-環(huán)氧化膽固醇； 4-膽甾烷-3β，5α，6β-三醇；5-25-羥基膽固醇；6-7-酮基膽固醇圖1 六種COPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(5.0 μg/mL)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of six COPs mixed standards (5.0 μg/mL)

2.1.2 質(zhì)譜條件的選擇

膽固醇的衍生化有利于提高儀器分析時樣品的分離度與檢測的靈敏度，但經(jīng)衍生化后，部分COPs的主要子離子相近。為了更加準(zhǔn)確地定量樣品中的COPs，并排除樣品基質(zhì)的干擾，采用SIM模式，根據(jù)6種COPs不同的保留時間，進行分段掃描。設(shè)定不同的采集時間段：0～12 min，采集7α-羥基膽固醇，12～13 min，采集7β-羥基膽固醇，13～16 min，采集5α，6α-環(huán)氧化膽固醇，16～18 min，采集膽甾烷-3β，5α，6β-三醇，18～20 min，采集25-羥基膽固醇，20～21 min，采集7-酮基膽固醇，根據(jù)SIM模式得到的豐度離子，分別選擇m/z為457、457、384、403、271、367離子作為相對應(yīng)的定量離子，具體采集參數(shù)見表1。

表1 六種COPs的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of the six COPs

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取方法的選擇

索氏抽提法作為最經(jīng)典的粗脂肪提取方法，操作簡便，穩(wěn)定有效，但由于7-酮基膽固醇等部分膽固醇氧化物的不穩(wěn)定性，在高溫條件下發(fā)生分解或轉(zhuǎn)化，會導(dǎo)致測定結(jié)果出現(xiàn)偏差。錢燁等[15]研究報道，溶劑萃取法能克服樣品基質(zhì)的干擾，有效地提取出不同極性的脂質(zhì)。皂化法也通常作為提取膽固醇氧化物的方法并能有效地除去樣品中的甘油酯類物質(zhì)[19]。為此本實驗對比了V(甲醇)∶V(氯仿)=1∶2溶劑萃取法和皂化法對膽固醇氧化物的提取效果。圖2結(jié)果表明，采用V(甲醇)∶V(氯仿)=1∶2試劑進行萃取時，回收率為79.36%～86.35%，明顯高于皂化法，這是由于皂化法的外部堿性條件，將使部分COPs發(fā)生分解或轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致其回收率降低。因此選用V(甲醇)∶V(氯仿)=1∶2溶劑萃取法對樣品中的脂質(zhì)進行提取。

圖2 不同提取方法對6種COPs回收率的影響(n=3)Fig.2 Effect of different extraction methods on the recovery of six COPs (n=3)

2.2.2 固相萃取柱的選擇

蟹肉中含有大量的脂溶性物質(zhì)，若不能有效去除，會影響到COPs的含量分析，因此需對樣品進行凈化與富集，通過選擇性吸附與脫除[20]，從脂溶性混合物中提取COPs。本實驗考察了Poly-Sery HLB、Oasia HLB和Sep-Pak Vac C18三種固相萃取柱對COPs回收率的影響。由圖3可知，6種COPs在Oasia HLB和Sep-Pak Vac C18固相萃取柱的回收率偏低。采用Poly-Sery HLB固相萃取柱，6種COPs的回收率均高于另外2種固相萃取柱，平均回收率為85.58%。故Poly-Sery HLB固相萃取柱能有效滿足樣品中COPs的凈化和富集要求。

圖3 不同固相萃取柱對6種COPs回收率的影響(n=3)Fig.3 Effect of different solid phase extraction columns on the recovery of six COPs (n=3)

2.2.3 凈化試劑的選擇

固相萃取過程分為2個步驟。首先通過凈化試劑將固相萃取柱中的雜質(zhì)淋洗出來，使目標(biāo)物得以凈化。本實驗考察了正己烷-乙醚、正己烷-乙酸乙酯和正己烷3種凈化試劑對回收率的影響。由圖4可知，純正己烷的淋洗效果并不好，回收率較低。2種混合溶液相比較而言，正己烷-乙醚淋洗的效果更好，6種COPs回收率明顯較高。故選擇正己烷-乙醚混合溶液作為凈化試劑。并參考錢燁[21]的凈化方法，通過反復(fù)實驗，最終確定采用10 mLV(正己烷)∶V(乙醚)=9∶1和20 mLV(正己烷)∶V(乙醚)=8∶2進行梯度淋洗。

圖4 不同凈化試劑對6種COPs回收率的影響(n=3)Fig.4 Effect of different purification reagents on the recovery of six COPs (n=3)

2.2.4 洗脫劑的選擇

在固相萃取最后的洗脫步驟中，洗脫劑的選擇會直接影響到樣品洗脫的效果。本實驗比較乙酸乙酯、乙腈和丙酮3種洗脫劑的洗脫效果。由圖5可知，乙酸乙酯回收率最低，洗脫效果最差。丙酮和乙腈洗脫效果相近，考慮到乙腈毒性更強，故選擇丙酮作為洗脫劑對樣品中的COPs進行提取。

在此基礎(chǔ)上進一步考察了不同體積的丙酮對6種COPs回收率的影響，計算6種COPs的平均回收率，結(jié)果如圖6所示，當(dāng)丙酮體積為2 mL和4 mL時，6種COPs的平均回收率均低于80%，丙酮體積為6 mL時，6種COPs的平均回收率為87.03%，當(dāng)丙酮體積大于6 mL時，對回收率影響不大，而更多的洗脫劑體積意味著試劑的消耗量增大和氮吹時間的增長。因此最終采用6 mL體積的丙酮對目標(biāo)物進行洗脫。

圖5 不同洗脫劑對6種COPs回收率的影響(n=3)Fig.5 Effect of different elution reagents on the recovery of six COPs (n=3)

圖6 不同洗脫體積對6種COPs回收率的影響(n=3)Fig.6 Effect of different elution volumes on the recovery of six COPs (n=3)

2.3 方法學(xué)驗證結(jié)果

2.3.1 方法的線性和檢出限

由表2可知，這6種COPs在0.2～10.0 μg/mL之間有較好的線性關(guān)系，回歸系數(shù)均大于0.999 0，檢出限為0.08～3.60 ng/g。

2.3.2 精密度與回收試驗

由表3可知，6種COPs的加標(biāo)回收率為77.64%～93.54%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.34%～8.25%，表明該方法能夠滿足蟹肉中COPs含量分析的要求。

表2 六種COPs的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients and detection limits for the six COPs

表3 空白蟹肉中6種COPs加標(biāo)回收率和精密度(n=3)Table 3 Spiked recoveries and precision of the six COPs in blank crab meat (n=3)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

在采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行檢測的過程中，由于不能達到完全的除雜，因此檢測分析的結(jié)果一般會受到樣品中被分析物以外組分的影響，導(dǎo)致分析結(jié)果出現(xiàn)偏差，故常采用基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)中相對響應(yīng)值法對方法的靈敏度與選擇性進行評價。

計算得出6種COPs的基質(zhì)效應(yīng)見圖7，6種COPs的ME絕對值均低于8%。表明經(jīng)過前處理條件的優(yōu)化，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，故可直接采用標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性方程進行定量。

2.5 實際樣品測定

按本實驗建立的方法對前后3批采集新鮮的中華絨螯蟹蟹肉進行測定，均未檢出COPs。由表4可知，對不同加熱時間的中華絨螯蟹中COPs的含量進行檢測時發(fā)現(xiàn)，COPs的含量隨著時間的增加而升高，在20 min之后，幾種COPs的含量均趨于穩(wěn)定，說明在一定時間內(nèi)的熱氧化過程中，膽固醇會發(fā)生氧化，形成膽固醇氧化物，具體的氧化機制還需進一步探究。

圖7 蟹肉中6種COPs基質(zhì)效應(yīng)評價圖Fig.7 Evaluation of matrix effects of six COPs in crab meat

表4 不同加熱時間下6種COPs的含量 單位：ng/g

3 結(jié)論

本研究采用固相萃取-氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法對蟹肉中7α-羥基膽固醇，7β-羥基膽固醇，5α，6α-環(huán)氧化膽固醇，膽甾烷-3β，5α，6β-三醇，25-羥基膽固醇，7-酮基膽固醇等6種COPs含量進行檢測分析。該方法以V(甲醇)∶V(氯仿)=1∶2為提取溶劑，Poly-Sery HLB固相萃取柱對目標(biāo)物進行凈化，選用正己烷-乙醚混合梯度溶液為凈化試劑，6 mL體積的丙酮為洗脫劑，設(shè)置合理的色譜-質(zhì)譜條件，6種COPs能在21 min內(nèi)實現(xiàn)良好分離。該方法提取效率高，選擇性好，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，方法學(xué)評價能滿足實際樣品檢測的需要，為蟹肉中COPs的定量分析與控制提供了技術(shù)參考。