轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125 Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白的時(shí)空表達(dá)分析

李東陽 肖冰 王晨堯 楊現(xiàn)明 梁晉剛 吳孔明

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安陽 455000；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

玉米（Zea mays）是我國(guó)最重要的糧食作物之一，也是畜牧業(yè)和飼料工業(yè)的主要原料，玉米產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展是國(guó)家糧食安全和農(nóng)產(chǎn)品有效供給的重要保障［1-2］。在整個(gè)生育期內(nèi)，玉米會(huì)受到多種害蟲的為害，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)［3-5］。其中，亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）是玉米生產(chǎn)中的主要害蟲之一，在我國(guó)各玉米產(chǎn)區(qū)均有不同程度的發(fā)生，常年發(fā)生面積2 000 萬hm2以上［6-8］。室內(nèi)生測(cè)和田間抗性鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米對(duì)亞洲玉米螟具有很好的殺蟲效果和田間抗螟性［9-11］。轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米新品種不僅是防治農(nóng)業(yè)害蟲的有效途徑之一，而且有利于保護(hù)生態(tài)環(huán)境、提高農(nóng)民收入［3-4,12-13］。自1996年轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米首次商業(yè)化種植以來，全球已有超過200 個(gè)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米轉(zhuǎn)化事件被批準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)。根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications,ISAAA）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2019年，全球31%的玉米是轉(zhuǎn)基因玉米，其中抗蟲玉米和抗蟲耐除草劑玉米種植面積5 590 萬hm2［1-15］。我國(guó)是玉米的主要生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米的研究一直都是研究熱點(diǎn)［16］。

轉(zhuǎn)基因作物中外源Bt 殺蟲蛋白在特定器官和特定時(shí)間的表達(dá)具有明顯的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，且地域、環(huán)境等因素對(duì)外源殺蟲蛋白表達(dá)有一定的影響［9,17-21］。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米的抗蟲性強(qiáng)弱與植株體內(nèi)的外源殺蟲蛋白含量密切相關(guān)，因此，準(zhǔn)確定量出Bt 殺蟲蛋白在不同生育期和不同器官中的表達(dá)量，對(duì)于未來轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米產(chǎn)業(yè)化后的害蟲防治和農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理具有重要意義［11,22］。

轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj和g10evo-epsps基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125，是由杭州瑞豐生物科技有限公司/浙江大學(xué)共同研發(fā)的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件，2020年1月21 號(hào)獲得了在北方春玉米區(qū)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書（生產(chǎn)應(yīng)用），是國(guó)產(chǎn)轉(zhuǎn)基因玉米的重要代表。瑞豐125 及相關(guān)衍生品系如能順利產(chǎn)業(yè)化，將為亞洲玉米螟、黏蟲（Mythimna separata）等玉米主要鱗翅目害蟲的防治提供可供選擇的新途徑，降低玉米種植成本，提升我國(guó)玉米競(jìng)爭(zhēng)力。

為了明確瑞豐125 在不同地域、不同環(huán)境中的Bt 殺蟲蛋白的表達(dá)規(guī)律，本文以轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125 和對(duì)照非轉(zhuǎn)基因玉米宏碩899 為研究對(duì)象，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）全面分析了不同地區(qū)種植環(huán)境下，Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白的表達(dá)量及變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125 及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩缀甏T899 均由浙江大學(xué)/杭州瑞豐生物科技有限公司提供。瑞豐125 同時(shí)表達(dá)Cry1Ab/Cry2Aj和G10evo-EPSPS 蛋白，具有抗蟲和耐除草劑兩種特性。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 兩個(gè)玉米品種分別在我國(guó)玉米種植區(qū)的9 個(gè)地點(diǎn)按照結(jié)構(gòu)庇護(hù)所方式進(jìn)行種植，種植和栽培方式均采用當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)耕作管理的模式進(jìn)行，本試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行兩年。9 個(gè)地點(diǎn)分別為：黑龍江哈爾濱（45°44'N，126°42'E）、吉林長(zhǎng)春（43°48'N，125°24'E）、遼寧沈陽（41°49'N，123°33'E）、河北廊坊（39°51'N，116°60'E）、山東煙臺(tái)（37°29'N，121°16'E）、河南新鄉(xiāng)（35°10'N，113°41'E）、湖北武漢（30°44'N，114°46'E）、貴州貴陽（26°38'N，106°38'E）、新疆庫(kù)爾勒（41°45'N，86°12'E）。

瑞豐125 和宏碩899 兩種玉米材料各設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)小區(qū)面積為200 m2（20 m×10 m），行距60 cm，株距25 cm，小區(qū)之間的間隔為1-1.5 m。

1.2.2 田間取樣 在玉米生長(zhǎng)的不同時(shí)期，即拔節(jié)期（V6-V8）、抽雄期（VT）、吐絲期（R1）、成熟期（R4）等時(shí)期取樣，小區(qū)內(nèi)50%以上的植株進(jìn)入相應(yīng)生育期時(shí)，判斷為該小區(qū)到達(dá)相應(yīng)采樣時(shí)間。每小區(qū)3點(diǎn)取樣，每點(diǎn)選取1 株進(jìn)入相應(yīng)時(shí)期的玉米植株，按不同部位分類采集樣品，同一小區(qū)同一部位樣品剪碎混合。

采集的玉米組織樣品放入自封袋中，然后立即放入盛有干冰的泡沫盒內(nèi)，帶回室內(nèi)轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。玉米各組織具體采樣方法如下：（1）葉片：選取幼嫩葉片，從葉片頂端開始截取20 cm 葉片，隨后剪成2.5 cm 小段；（2）雄穗：1 株玉米選取1個(gè)雄穗，隨后剪成2.5 cm 小段；（3）花絲：雌穗套袋，將雌穗連同套袋一起拿到無花粉的環(huán)境中，將花絲從雌穗上剪下，剪成2.5 cm 小段；（4）籽粒：在同一植株上隨機(jī)采集15 粒大小一致的幼嫩籽粒。

1.2.3 Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量測(cè)定 采用Cry1Ab/Cry1Ac 酶聯(lián)免疫（ELISA）定量檢測(cè)試劑盒（Envirologix，Portland，USA，貨號(hào)10433）測(cè)定Cry1Ab/Cry2Aj 融合殺蟲蛋白的含量，按照說明書操作，具體方法參考Zhang 等［23］的研究，本研究中瑞豐125 中外源殺蟲蛋白Cry1Ab/Cry2Aj 含量以Cry1Ab 殺蟲蛋白含量為代表計(jì)為μg/g 鮮重。

首先使用Retsch MM400 組織破碎儀（Retsch GmbH,Haan,Germany）將所有樣本在低溫下粉碎為粉末，然后保存在-80℃冰箱中。稱取0.4 g 組織粉末加入4 mL 提取液PBST（pH 為7.4、濃度為0.01 mol/L 的PBS+0.55% Tween 20），置于搖床上4℃過夜；12 000 r/min 離心15 min，取上清液，用提取液適量稀釋；將Cry1Ab 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋，在96 孔酶標(biāo)板每孔加入50 μL enzyme-conjugate Cry1Ab 后，分別加入50 μL 樣品、陰性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品，用封口膜將酶標(biāo)板封閉，輕搖混勻20-30 s，置于搖床上（200 r/min）1-2 h；用力棄去液體后，每孔加入200 μL 洗滌液，反復(fù)洗滌3 次后用吸水紙吸干；每孔加入100 μL 顯色底物，用封口膜將酶標(biāo)板密封，外覆錫箔紙避光，輕搖混勻20-30 s，室溫放置15-30 min；每孔加入100 μL 終止液終止反應(yīng)，用Infinite M200 Pro 酶標(biāo)儀（Tecan,M?nnedorf,Switzerland）在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定OD 值。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS Inc.,Chicago,USA）進(jìn)行方差分析，分析方法采用One-way ANOVA，多重比較方法采用LSD 法。

2 結(jié)果

2.1 瑞豐125不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達(dá)量

ELISA 測(cè)定結(jié)果表明，對(duì)照玉米宏碩899 中未檢出Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白；瑞豐125 在2019年各處理試驗(yàn)中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量為0.590-6.716 μg/g 鮮重（表1），在2020年各處理試驗(yàn)中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量為0.326-11.133 μg/g 鮮重（表2）。

表1 瑞豐125 各生育期不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量Table 1 Cry1Ab/Cry2Aj insecticidal protein expressions of Ruifeng 125 in different tissues at different growth stages（2019）

表2 瑞豐125 各生育期不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量Table 2 Cry1Ab/Cry2Aj insecticidal protein expressions of Ruifeng 125 in different tissues at different growth stages（2020）

在兩年的試驗(yàn)中，2019年的廊坊、煙臺(tái)、新鄉(xiāng)和2020年的哈爾濱、長(zhǎng)春、沈陽、廊坊、煙臺(tái)、新鄉(xiāng)的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量均呈現(xiàn)葉片>花絲>雄穗>籽粒的趨勢(shì)；2019年的武漢、貴陽、庫(kù)爾勒和2020年的庫(kù)爾勒的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量均呈現(xiàn)花絲>葉片>雄穗>籽粒的趨勢(shì)；2019年的長(zhǎng)春和2020年的武漢的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量均呈現(xiàn)葉片>雄穗>花絲>籽粒的趨勢(shì)；2019年的沈陽和2020年的貴陽的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量均呈現(xiàn)葉片>雄穗>籽粒>花絲的趨勢(shì)；2019年的哈爾濱的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量呈現(xiàn)籽粒>葉片>花絲>雄穗的趨勢(shì)。整體上看，各地點(diǎn)種植的瑞豐125 呈現(xiàn)出葉片中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，而籽粒中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較低的規(guī)律。

對(duì)于瑞豐125 在不同地點(diǎn)的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量表達(dá)情況，2019年的結(jié)果顯示，V6-V8葉片中貴陽、哈爾濱的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，VT 雄穗中廊坊、武漢、沈陽的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R1 葉片中長(zhǎng)春、廊坊、沈陽的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R1 花絲中貴陽、武漢的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R4 葉片中廊坊、新鄉(xiāng)的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R4 籽粒中哈爾濱的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高。2020年的結(jié)果顯示，V6-V8 葉片中沈陽、新鄉(xiāng)的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，VT雄穗中貴陽、武漢的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R1 葉片中沈陽、煙臺(tái)的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R1 花絲中庫(kù)爾勒、新鄉(xiāng)的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R4 葉片中新鄉(xiāng)、廊坊的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R4 籽粒中沈陽的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高。整體上看沒有明顯的空間變化規(guī)律。

為了從整體上明確瑞豐125 不同器官之間Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量的規(guī)律，將9 個(gè)地點(diǎn)的數(shù)據(jù)平均后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖1所示。2019年和2020年的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量數(shù)據(jù)均表現(xiàn)出R4 葉片>V6-V8 葉片>R1 葉片>R1 花絲>VT 雄穗>R4 籽粒的趨勢(shì)，R4 葉片Cry1Ab/Cry-2Aj 殺蟲蛋白含量為4.299 μg/g 鮮重（2019年）/4.734 μg/g 鮮重（2020年），R4 籽粒Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量為1.430 μg/g 鮮重（2019年）/1.210 μg/g 鮮重（2020年）。對(duì)于V6-V8、R1、R4 三個(gè)時(shí)期的葉片，Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量隨著生育期的延長(zhǎng)，有略微的增長(zhǎng)，但3 個(gè)時(shí)期之間的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量均沒有顯著性差異（P>0.05）。

圖1 瑞豐125 不同生育期的不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達(dá)量Fig.1 Cry1Ab/Cry2Aj insecticidal protein expressions of Ruifeng 125 in different tissues at different growth stages

2.2 不同地點(diǎn)種植的瑞豐125Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達(dá)量

為了從整體上明確在不同地點(diǎn)種植的瑞豐125Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量的變化規(guī)律，將9 個(gè)地點(diǎn)各器官樣品Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量平均后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖2所示。在不同地點(diǎn)種植的瑞豐125Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量有差異，但整體差異較小。2019年各個(gè)地點(diǎn)Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達(dá)量范圍為1.664-3.771 μg/g鮮重，貴陽高于其他地區(qū)，但與長(zhǎng)春、沈陽、廊坊、煙臺(tái)、武漢沒有顯著性差異，庫(kù)爾勒顯著低于其他地區(qū)。2020年各個(gè)地點(diǎn)Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量范圍為2.423-4.605 μg/g 鮮重，沈陽顯著高于其他地區(qū)，長(zhǎng)春、武漢低于其他地區(qū)，但與廊坊、煙臺(tái)、貴陽、庫(kù)爾勒沒有顯著性差異。

圖2 瑞豐125 在不同地點(diǎn)的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量Fig.2 Cry1Ab/Cry2Aj insecticidal protein expressions of Ruifeng 125 in different locations

3 討論

在轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米中，Bt 殺蟲蛋白的表達(dá)量可能因組織類型、發(fā)育時(shí)期和環(huán)境狀況而異［24］，了解Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化規(guī)律對(duì)害蟲的綜合防治和農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理具有重要意義。本研究通過測(cè)定在9 個(gè)地點(diǎn)種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米瑞豐125 在各生育期不同器官Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達(dá)量，明確了瑞豐125Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量的時(shí)空變化規(guī)律，有利于為其未來的商業(yè)化推廣和安全管理提供數(shù)據(jù)參考。

2019-2020 兩年的試驗(yàn)結(jié)果表明，瑞豐125Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量在不同的玉米器官中差異較大，整體上看，葉片中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量較高而籽粒中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量較低，隨著作物生長(zhǎng)，葉片中Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達(dá)量略有上升，結(jié)果與前人研究結(jié)果一致［11,25-28］。孫紅煒等［11］研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)cry1Ab /cry2Aj和g10evo-epsps基因玉米雙抗505-12-5 在玉米大喇叭口期、吐絲期、乳熟期，心葉中的Bt 殺蟲蛋白含量均高于根、莖。Liang 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，不同地點(diǎn)種植的轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因抗蟲耐除草劑玉米DBN9936，葉片Bt 殺蟲蛋白含量高于花絲、雄穗、籽粒，籽粒中Bt 殺蟲蛋白含量較低。Trtikova 等［26］研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米MON810 葉片、根部、莖稈、籽粒之間的Bt 殺蟲蛋白含量差異較大，組織之間Bt 殺蟲蛋白含量水平為葉片>根>莖>籽粒>花粉，且Bt 殺蟲蛋白含量隨生長(zhǎng)時(shí)期延長(zhǎng)而逐漸增加。劉允軍和王國(guó)英對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米97Y6 Cry1A殺蟲蛋白的含量進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)，葉片Bt 殺蟲蛋白含量顯著大于其他組織，且隨生育期呈增加趨勢(shì)［27］。Bilbo 等［24］測(cè)定了DKC64-24 等6 個(gè)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品種的不同組織Bt 殺蟲蛋白含量，發(fā)現(xiàn)Cry1F、Cry2Ab2 殺蟲蛋白含量在玉米葉尖大于花絲、籽粒，且不同年份之間有一定差異。Darvas 等［28］對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米MON810 進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，花絲中Cry1Ab含量低于葉片、莖稈。

本研究發(fā)現(xiàn)在9 個(gè)地點(diǎn)種植的瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量有差異，但整體差異較小。2019年有6 個(gè)地點(diǎn)的瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量沒有顯著性差異，2020年有7 個(gè)地點(diǎn)的瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量沒有顯著性差異，兩年中僅有個(gè)別地點(diǎn)出現(xiàn)偏高或偏低的情況。不同地點(diǎn)Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量之間存在的差異可能與當(dāng)?shù)貧夂驐l件、土壤狀況、耕作措施等有關(guān)。如Trtikova 等［26］研究表明轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系PAN 6Q-321B 和 PAN 6Q-308B（均為MON810 衍生品系）在冷/濕應(yīng)激下的Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量增加了4 倍，表明Cry1Ab 殺蟲蛋白表達(dá)水平與水分和溫度條件有關(guān)。王家寶等［29］以3 個(gè)轉(zhuǎn)Bt基因棉花品種魯棉研15 號(hào)、魯S6177 和新棉33B為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)品種轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花的主莖老葉的Bt 殺蟲蛋白含量在追肥處理后增加29.7%，3 個(gè)品種轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花的功能主莖葉、幼蕾、主莖老葉的Bt 殺蟲蛋白含量在積水處理后分別下降27.7%、29.9%、6.6%，新棉33B 的功能主莖葉、幼蕾、主莖老葉的Bt 殺蟲蛋白含量在干旱處理之后分別下降30.0%、37.0%、52.9%。Marquardt 等［30］發(fā)現(xiàn)土壤中氮含量與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米DeKalb 61-19的Cry3Bb1 殺蟲蛋白表達(dá)量有一定的正相關(guān)性。Griffiths 等［31］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米MEB307Bt（MON810 衍生品系）中的Cry1Ab 殺蟲蛋白表達(dá)量在不同類型土壤中具有顯著性差異，且不同時(shí)期的葉片中Cry1Ab 殺蟲蛋白表達(dá)量在施用溴氰菊酯后均顯著增加。由于本研究的9 個(gè)地點(diǎn)之間氣候條件、土壤狀況等相差較大，而且測(cè)定環(huán)境、取材方法、人員操作習(xí)慣、樣品儲(chǔ)存環(huán)境等均會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生一定影響，導(dǎo)致不同地點(diǎn)的Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量之間存在微小差異，個(gè)別地點(diǎn)如貴陽、庫(kù)爾勒、沈陽在試驗(yàn)中出現(xiàn)Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量偏高或偏低的情況。

亞洲玉米螟、黏蟲等鱗翅目害蟲是我國(guó)玉米生產(chǎn)上最嚴(yán)重的生物脅迫問題，玉米螟在東北春玉米區(qū)和新疆南疆等地主要為1、2 代危害，在黃淮海夏玉米區(qū)主要為3 代危害，黏蟲主要以2、3 代連續(xù)危害［8］，瑞豐125 在拔節(jié)期（V6-V8）、吐絲期（R1）、成熟期（R4）的葉片中Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量相對(duì)較高，有利于對(duì)1、2 代玉米螟和黏蟲的防治。本研究中測(cè)定的籽粒、花絲、雄穗等玉米繁殖器官的Bt 殺蟲蛋白含量略低于葉片，與前人研究結(jié)果一致，但相關(guān)的抗蟲試驗(yàn)表明瑞豐125 無論是在心葉期還是穗期，對(duì)玉米螟、黏蟲均具有高抗水平［11,32］。翁綠水等［20］在對(duì)抗蟲水稻Bt 殺蟲蛋白的研究中指出，雖然Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量在不同時(shí)期、不同組織中存在差異，但目前研發(fā)的抗蟲植物品種足以有效控制目標(biāo)害蟲的危害。但由于植物中Bt 殺蟲蛋白表達(dá)規(guī)律的復(fù)雜性，未來的研究中抗蟲性生物測(cè)定也是不可或缺的。除此之外，9 個(gè)不同地點(diǎn)種植的瑞豐125的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量整體差異較小，表示瑞豐125 可能在不同的玉米生產(chǎn)區(qū)具有相對(duì)一致的害蟲防治效果，對(duì)其產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。

轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米中的Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量受各種因素影響，導(dǎo)致Bt 殺蟲蛋白在時(shí)間上和空間上的分布不均勻，而低劑量的Bt 殺蟲蛋白可能會(huì)增加靶標(biāo)害蟲的生存幾率，引起靶標(biāo)害蟲的抗性風(fēng)險(xiǎn)增加［24］。靶標(biāo)害蟲對(duì)Bt 殺蟲蛋白的抗性問題是對(duì)影響B(tài)t 作物可持續(xù)推廣的最大因素，靶標(biāo)害蟲的抗性治理是轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)應(yīng)用的重要環(huán)境問題［33］。為了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因作物的可持續(xù)應(yīng)用，有效阻止或延緩靶標(biāo)害蟲抗性種群的發(fā)生，各國(guó)科學(xué)家提出了抗性治理策略IRM（insect resistance management），目前應(yīng)用最廣泛的主要有“高劑量/庇護(hù)所”（high dose/refuge）策略和“多基因”（pyramid）策略［34］。在“高劑量/庇護(hù)所”策略中，在Bt 作物周邊種植一定面積的非Bt 作物，提供足夠數(shù)量的敏感個(gè)體，與來自Bt 作物區(qū)存活的少量抗性純合子個(gè)體進(jìn)行自由交配，產(chǎn)生的雜合子個(gè)體后代能被高劑量表達(dá)Bt殺蟲蛋白的抗蟲作物殺死，達(dá)到稀釋抗性基因的目的［35］。轉(zhuǎn)Bt基因玉米表達(dá)高劑量Bt 殺蟲蛋白是策略成功實(shí)施的關(guān)鍵。高劑量Bt 殺蟲蛋白能夠殺死靶標(biāo)害蟲中的100%隱性敏感純合（ss）個(gè)體和99%抗性雜合（sr）個(gè)體，僅有抗性純合（rr）個(gè)體可能存活［32,36-39］。“高劑量/庇護(hù)所”策略主要分為3 種形式：結(jié)構(gòu)庇護(hù)所（structured refuges）、種子混合庇護(hù)所（seed blends）、自然庇護(hù)所（natural refuge）。結(jié)構(gòu)庇護(hù)所為Bt 作物和非Bt 作物分別以塊狀模式種植來降低害蟲的抗性進(jìn)化速度，種子混合庇護(hù)所為種植之前均勻混合Bt 作物種子和非Bt 作物種子，自然庇護(hù)所是指可以提供敏感害蟲的雜草或其他栽培植物［40］。在“多基因”策略中，在同一株植物中同時(shí)導(dǎo)入兩個(gè)或多個(gè)沒有交互抗性的針對(duì)同一靶標(biāo)害蟲的抗蟲基因，使得轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)減小，可有效延緩抗性的產(chǎn)生和發(fā)展［36-37,40］。瑞豐125 可以同時(shí)表達(dá)Cry1Ab 和Cry2Aj 兩種不同類型的殺蟲蛋白，與僅含單一Bt 殺蟲蛋白的植株相比，這種“多基因”作物對(duì)害蟲的抗性治理起到積極的作用。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj和g10evo-epsps基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白呈現(xiàn)出葉片中表達(dá)量較高，而籽粒中表達(dá)量較低的規(guī)律，不同地點(diǎn)種植的瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量有所差異，但差異整體較小，表明瑞豐125 具有良好的應(yīng)用前景。本研究可為未來瑞豐125 的商業(yè)化推廣、構(gòu)建Bt 玉米防控技術(shù)體系、庇護(hù)所策略實(shí)施、安全管理等提供數(shù)據(jù)支撐和參考。