黃海辰 李曉敏，2 薛帆正 吳小平，2 張君麗 傅俊生，2

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福州 350002；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所，拉薩850000）

天然黑色素（melanin）是由吲哚與酚類化合物氧化聚合而成，在自然界中分布廣泛［1］。黑色素主要分為真黑素（eumelanin）、棕黑素（pheomelanin）、異黑色素（allomelanin）三大類，真菌黑色素主要存在真黑素［2］。研究表明，黑色素具有化學(xué)抗氧化［3］、保肝［4］、抗炎［5］、抑菌［6］、抗病毒［6］、抗輻射［7］等生物活性。黑色素來源廣泛，微生物來源的黑色素主要有鏈霉菌、假單胞菌、粒毛盤菌、黑木耳、平菇等，但產(chǎn)量不足以滿足大規(guī)模應(yīng)用［8-9］。香灰菌是銀耳的伴生菌，在銀耳菌棒中廣泛存在，銀耳菌棒中的黑色素也鮮少報道。

香灰菌來源的黑色素具有生長周期快、成本低等優(yōu)勢。彭衛(wèi)紅［10］和羅青等［11］研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的香灰菌對碳源和氮源的利用能力存在顯著差異，且在不同培養(yǎng)基、pH 以及光照等條件下香灰菌菌絲生長速度及菌落形態(tài)明顯不同，黑色素產(chǎn)量也不盡相同，但尚未對其營養(yǎng)配方進行系統(tǒng)的優(yōu)化。本研究對11 個不同來源的供試菌株進行鑒定，以菌絲生長速度、平板L 值、發(fā)酵液黑色素含量等指標(biāo)篩選一株產(chǎn)黑色素能力強的香灰菌，并探究不同培養(yǎng)條件對香灰菌菌絲生長及黑色素產(chǎn)生的影響，使優(yōu)化后的培養(yǎng)基更有利于黑色素的合成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 菌株編號為Hp.sp0001、Hp.sp0002、Hp.sp0003、Hp.sp0006、古田AS 及古田AS（新）的菌種來自福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心；菌株編號為川灰、河南、香灰3、白灰的菌種由古田縣食用菌種植戶提供；菌株編號為黃耳香灰的菌種為本實驗室研究用菌株。

1.1.2 主要試劑 真菌DNA 提取試劑盒、Bioteke 2×power Taq PCR Master Mix 試劑盒，購自O(shè)MEGA公司；葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA 加富固體培養(yǎng)基（g/L）：瓊脂 20，土豆 200，蛋白胨 5，KH2PO42，MgSO4·7H2O 1.5，VB10.01；PDB 加富液體培養(yǎng)基（g/L）：土豆 200，蛋白胨 5，KH2PO42，MgSO4· 7H2O 1.5，VB10.01。

1.2 方法

1.2.1 黑色素含量測定 參照張玉彬［12］和曾昌巧等［13］的方法，用Lab 色度系統(tǒng)來反應(yīng)香灰菌黑色素含量，其L 值表示亮度，值越大，顏色越偏向白色；反之，L 值越小，則說明顏色越偏向黑色，此方法可直觀測定菌株黑色素的產(chǎn)生情況。

1.2.2 菌絲生長速度測定及黑色素提取 將同期活化的11 種供試菌株，接種菌齡及大小相同的菌塊于PDA 培養(yǎng)基中，置于24℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，每天記錄菌絲生長情況，利用十字劃線法測量菌絲生長速度，并觀察菌落的形態(tài)及黑色素產(chǎn)生情況。

參照吳堯等［14］的方法，分別接種7 片直徑為0.7 cm 的11 種供試香灰菌于裝有100 mL 的PDB 加富培養(yǎng)基中，每個菌株設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)，置于24℃，160 r/min 搖床黑暗培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)結(jié)束后，過濾收集濾液，加入等量的1 mol/L NaOH，100℃水浴提取3 h。待水浴結(jié)束后，10 000 r/min 離心3 min，取上清液，使用1 mol/L HCl 將上清液pH 調(diào)到2.0，10 000 r/min 離心5 min 收集沉淀，即得黑色素粗品。

1.2.3 產(chǎn)黑色素香灰菌菌株的分子鑒定 分別接種11 個供試菌株，24℃培養(yǎng)10 d 后，收集菌絲備用。采用OMEGA 真菌DNA 提取試劑盒提取香灰菌的DNA。

采用Bioteke 2×power Taq PCR Master Mix 試劑盒擴增12 株供試菌株ITS 區(qū)序列，以真菌核糖體基因間隔區(qū)通用的ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTGATATGC-3'）為引物［15］。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）為：2×Taq 酶12.5 μL；ddH2O 9.5 μL；ITS1 和ITS4 引物各1 μL；模板1 μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共32 個循環(huán)；72℃終延伸10 min，4℃ 保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 擴增產(chǎn)物進行質(zhì)檢，將產(chǎn)物送至廈門擎科生物技術(shù)有限公司測序。

將測序得到的DNA 序列在GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中進行同源比對分析，下載同源性較高的Annulohypoxylon stygiumKP995421.1、Annulohypoxylon stygiumFJ848865.1 和Annulohypoxylonsp.MW862791.1 的序列作為比對時的參考菌序列，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展法（Bootstrap）檢驗重復(fù)1 000 次，以檢驗分子進化樹的可靠性，剖析各菌株之間的遺傳關(guān)系。

1.2.4 高產(chǎn)黑色素的平板培養(yǎng)配方優(yōu)化 以香灰菌平板產(chǎn)黑色素的情況（L 值）和菌絲生長速度為指標(biāo)，探究培養(yǎng)基碳源（無碳、果糖、甘露醇、淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、木糖、玉米粉），氮源（無氮、酵母提取物、胰蛋白胨、牛肉浸膏、硝酸鉀、硝酸銨、酒石酸銨、脲），碳氮比（5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1，50∶1、60∶1 和70∶1），維生素（無維生素、硫胺素VB1、核黃素VB2、VB6、葉酸VB9、抗壞血酸VC、生物素VH、尼克酸VPP），pH（5、5.5、6、6.5、7、7.5、8）5 個單因素對香灰菌產(chǎn)黑色素的影響。

1.2.5 正交試驗 為了探究香灰菌產(chǎn)黑色素的最優(yōu)培養(yǎng)條件，進一步對上述單因素試驗結(jié)果進行正交優(yōu)化。以L 值為指標(biāo)，從中選擇碳源、氮源、碳氮比和pH 單因素進行3 水平4 因素的正交試驗，如表1所示，每個分組設(shè)定3 個重復(fù)。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 統(tǒng)計分析 用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)顯著性方差分析。采用t檢驗分析兩組顯著性，P<0.05表示差異顯著，P<0.01 差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 供試菌株的分子鑒定

通過ITS 分子鑒定對11 株供試菌株進行檢測，測序后在NCBI 上進行比對，選取相似度較高的序列作為參考菌序列。結(jié)果表明11 株菌株均為屬于暗色環(huán)紋炭團菌（Annulohypoxylon stygium）。如圖1所示，Hp.sp0001、Hp.sp0002 和古田AS、河南香灰的親緣關(guān)系較近，Hp.sp0006 和白灰、川灰的親緣關(guān)系較近，Hp.sp0003 和古田AS 新的菌株處在同一分支，表明親緣關(guān)系較近。

圖1 11 株供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 11 tested strains

2.2 產(chǎn)黑色素菌株的篩選

2.2.1 香灰菌菌絲體形態(tài)比較 基于菌株形態(tài)水平，實驗首先對11 株供試菌株的菌絲生長速度、菌球形態(tài)和平板L 值進行比較。Lab 系統(tǒng)可分為L（亮度）、a 和b，a 表示紅綠軸，b 表示黃藍軸。我們通過色差儀對平板進行測量，色差儀測量后會顯示出L、a、b、ΔL、Δa、Δb、ΔC、Δh、ΔE 等數(shù)值，我們可以根據(jù)測出的L 值進行比較，L 值為0 時代表黑，L 值為100 時代表白。由圖2可知，在相同條件下，不同香灰菌菌株的菌絲生長速度和產(chǎn)黑色素情況差異較大，菌絲體形態(tài)和菌球形態(tài)各異。其中，Hp.sp0006、白灰、黃耳香灰、古田AS、Hp.sp0002平板L 值較低。Hp.sp0006 菌絲健壯、生長速度較快且平板L 值最低。白灰菌絲和古田AS 菌絲致密健壯，平板L 值較低且菌絲生長速度較慢。黃耳香灰菌絲稀疏，菌絲生長速度較慢，平板L 值也不高。Hp.sp0002 菌絲潔白纖細，平板L 值較低，菌絲生長速度較快。另外，香灰3 菌絲稀疏纖細、潔白，平板L 值高。初步綜合分析，Hp.sp0006 生長及產(chǎn)黑色素潛能優(yōu)良。

圖2 11 株香灰菌菌絲形態(tài)及其菌絲生長速度、色度分析Fig.2 Analysis of mycelial morphology and mycelial growth rate and chromaticity of 11 strains of Hypoxylon sp.

2.2.2 香灰菌發(fā)酵液黑色素含量比較 實驗繼續(xù)探究11 株香灰菌發(fā)酵液黑色素含量，如圖3-A 所示，在相同條件液體發(fā)酵下，11 株香灰菌菌株發(fā)酵液黑色素含量差別較大。如圖3-B 所示，Hp.sp0006 菌球大且均勻，呈棕黃色，發(fā)酵液含量最高可達0.77 g/L。白灰菌球較小。黃耳香灰菌菌球較小，發(fā)酵液黑色素含量較高。古田AS 菌球較大。Hp.sp0002 菌球大小不均勻，黑色素含量也不高。河南香灰菌球淺棕色，發(fā)酵液黑色素含量最低。綜上，初步篩選獲得一株高產(chǎn)黑色素香灰菌菌株Hp.sp0006。

圖3 11 株香灰菌發(fā)酵液黑色素含量及菌球形態(tài)Fig.3 Melanin content and spheroid morphology in fermentation broth of 11 Hypoxylon sp.

2.3 高產(chǎn)黑色素香灰菌菌株Hp.sp0006的平板培養(yǎng)優(yōu)化

2.3.1 不同碳源對菌絲生長及產(chǎn)黑情況的影響 以PDA 加富固體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以不添加碳源為對照，探究碳源對Hp.sp0006 香灰菌菌絲生長速度和菌絲體產(chǎn)黑色素的影響。如圖4-A 所示，與對照組相比，用淀粉作為培養(yǎng)基碳源顯著（P<0.05）地提高了菌絲生長速度，用果糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、木糖、玉米粉作為培養(yǎng)基碳源極顯著（P<0.01）地提高了菌絲生長速度，其中以甘露醇作為碳源菌絲生長速度最快。如圖4-B 所示，與對照組相比，Hp.sp0006 香灰菌在不同碳源上產(chǎn)黑色素均極顯著（P<0.01），其中以果糖作為培養(yǎng)基碳源，平板L 值最低。如圖4-C 所示，考慮到以甘露醇為碳源時，菌絲徒長，平板轉(zhuǎn)黑不明顯；以果糖作為碳源時，菌絲體產(chǎn)黑色素不均勻、不穩(wěn)定，因此選擇葡萄糖作為培養(yǎng)基碳源。

圖4 不同碳源對香灰菌 Hp.sp0006 菌絲體產(chǎn)黑色素的影響Fig.4 Effects of different carbon sources on the produced melanin by mycelium of Hp.sp0006

2.3.2 不同氮源對菌絲生長及產(chǎn)黑情況的影響 以PDA 加富固體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，碳源為葡萄糖的條件下，以不添加氮源為對照，探究培養(yǎng)基氮源對Hp.sp0006 香灰菌菌絲生長速度和菌絲體產(chǎn)黑色素的影響。如圖5-A 所示，與對照組相比，用牛肉浸膏、硝酸鉀、硝酸銨作為培養(yǎng)基氮源顯著提高了菌絲生長速度，用胰蛋白胨、脲作為培養(yǎng)基氮源極顯著提高了菌絲生長速度，其中以胰蛋白胨作為氮源菌絲生長速度最快。如圖5-B 所示，與對照組相比，Hp.sp0006 香灰菌在以酵母提取物、胰蛋白胨、牛肉浸膏、硝酸鉀、硝酸銨、酒石酸銨作為氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)黑色素極顯著，其中以牛肉浸膏為培養(yǎng)基氮源，平板L 值最低。因此，選擇牛肉浸膏作為培養(yǎng)基氮源較為合適。

圖5 不同氮源對香灰菌Hp.sp0006 菌絲體產(chǎn)黑色素的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on the produced melanin by mycelium of Hp.sp0006

2.3.3 不同碳氮比對菌絲生長及產(chǎn)黑情況的影響 以PDA 加富固體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，碳源為葡萄糖、氮源為牛肉浸膏的條件下，以碳氮比5∶1為對照，探究培養(yǎng)基碳氮比對Hp.sp0006 香灰菌菌絲生長速度和菌絲體產(chǎn)黑色素的影響。如圖6-A 所示，與對照組相比，培養(yǎng)基碳氮比10∶1 顯著提高了菌絲生長速度，碳氮比30∶1 極顯著提高了菌絲生長速度，其中碳氮比10∶1 時菌絲生長速度最快。如圖6-B 所示，與對照組相比，Hp.sp0006 香灰菌在碳氮比60∶1 的培養(yǎng)基上產(chǎn)黑色素顯著，碳氮比30∶1、50∶1 的培養(yǎng)基上產(chǎn)黑色素極顯著，其中碳氮比10∶1 時平板L 值最低。因此，選擇培養(yǎng)基碳氮比10∶1 繼續(xù)進行優(yōu)化較為合適。

圖6 不同碳氮比對香灰菌Hp.sp0006 菌絲體產(chǎn)黑色素的影響Fig.6 Effects of different carbon nitrogen ratio on the produced melanin by mycelium of Hp.sp0006

2.3.4 不同維生素對菌絲生長及產(chǎn)黑情況的影響 以PDA 加富固體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，碳源為葡萄糖、氮源為牛肉浸膏，碳氮比為10∶1 的條件下，以不添加維生素為對照，探究維生素對Hp.sp0006 香灰菌菌絲生長速度和菌絲體產(chǎn)黑色素的影響。如圖7-A 所示，與對照組相比，維生素對菌絲生長速度的影響不顯著。如圖7-B 所示，與對照組相比，Hp.sp0006 香灰菌在核黃素VB6作為生長因子的培養(yǎng)基上產(chǎn)黑色素顯著，在硫胺素VB1、葉酸VB9、抗壞血酸VC、生物素VH、尼克酸VPP 作為生長因子的培養(yǎng)基上產(chǎn)黑色素極顯著，其中用硫胺素VB1作為生長因子時平板L 值最低。因此，選擇硫胺素VB1為生長因子繼續(xù)進行優(yōu)化較為合適。

圖7 不同維生素對香灰菌Hp.sp0006 菌絲體產(chǎn)黑色素的影響Fig.7 Effects of different vitamin on the produced melanin by mycelium of Hp.sp0006

2.3.5 不同pH 對菌絲生長及產(chǎn)黑情況的影響 以PDA 加富固體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以葡萄糖為碳源、牛肉浸膏為氮源，碳氮比10∶1，維生素為硫胺素VB1條件下，以自然情況下的培養(yǎng)基pH 為對照，經(jīng)測定自然情況下培養(yǎng)基pH 為6.4，探究pH 對Hp.sp0006 香灰菌菌絲生長速度和菌絲體產(chǎn)黑色素的影響。如圖8-A 所示，與對照組相比，培養(yǎng)基pH 為7.5 時顯著降低了菌絲生長速度，表明香灰菌可能不宜在中性偏堿條件下生長。如圖8-B 所示，與對照組相比，Hp.sp0006 香灰菌在pH 為5.0 的培養(yǎng)基上產(chǎn)黑色素顯著。因此，選擇培養(yǎng)基pH 為5繼續(xù)進行優(yōu)化較為合適。

圖8 不同pH 對香灰菌Hp.sp0006 菌絲體產(chǎn)黑色素的影響Fig.8 Effects of different pH on the produced melanin by mycelium of Hp.sp0006

2.3.6 正交優(yōu)化 基于以上單因素試驗結(jié)果，選擇碳源、氮源、碳氮比、pH 這4 個單因素進行4 因素3 水平正交試驗，進一步對Hp.sp0006 香灰菌菌株培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。

通過極差分析法（表2）可知，影響香灰菌產(chǎn)黑色素的主次關(guān)系為氮源>pH>碳氮比>碳源，表明氮源是影響香灰菌產(chǎn)黑色素的主要因素（圖9）。方差結(jié)果分析（表3）顯示，氮源有極顯著影響（P<0.01），碳氮比有顯著影響（P<0.05），碳源和pH 沒有顯著影響。從表中可知，當(dāng)?shù)礊榕Ｈ饨?、碳源為葡萄糖時，平板L 值會較碳源為果糖和蔗糖時低，故碳源選為葡萄糖。由k 值大小確定香灰菌產(chǎn)黑色素的最優(yōu)配方為A1B1C3D3，即碳源為葡萄糖、氮源為牛肉浸膏、碳氮比為20∶1、pH 為6 時，香灰菌產(chǎn)黑色素的含量最高。

圖9 正交試驗中平板菌絲體生長狀況Fig.9 Growth status of the mycelium of Hp.sp0006 in orthogonal test

表2 香灰菌平板L 值正交試驗結(jié)果直觀分析Table 2 Analysis of the orthogonal test result of the L value of Hp.sp0006

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.3.7 驗證實驗 根據(jù)優(yōu)化后的配方進行驗證實驗，進一步探究最優(yōu)配方的可靠性。碳源為葡萄糖、氮源為牛肉浸膏、碳氮比為20∶1、pH 為6、轉(zhuǎn)速為160 r/min 時，進行液體發(fā)酵10 d，抽濾收集濾液進行提取黑色素。經(jīng)干燥后稱重計算得率，黑色素含量可達（1.21±0.17）g/L，與未優(yōu)化相比具有顯著差異，與優(yōu)化前相比提升了1.61 倍，具有顯著差異，表明優(yōu)化后的配方可行（圖10）。

圖10 正交實驗最優(yōu)組合液體發(fā)酵的黑色素含量Fig.10 Orthogonal experiment for optimal combination of liquid fermentation for melanin content

3 討論

近年來，研究表明真菌黑色素具有良好的抗氧化、清除自由基、抗炎、抑菌抗腫瘤等生物活性，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、化妝領(lǐng)域、醫(yī)藥等方面得到廣泛的應(yīng)用。已有研究表明黑色素在生物農(nóng)藥光保護劑、天然色素、防曬霜、染發(fā)劑等方面已有開發(fā)應(yīng)用［16-18］。但目前由于黑色素的產(chǎn)量較低，限制了它的應(yīng)用。微生物具有易培養(yǎng)、生產(chǎn)快等優(yōu)勢。香灰菌是銀耳的伴生菌，會分泌黑色素，且香灰菌黑色素有非常明顯的氧化還原能力［19］。利用真菌發(fā)酵產(chǎn)黑色素，可以較快速獲得黑色素。大量研究發(fā)現(xiàn)，真菌菌株生長和次生代謝產(chǎn)物的合成會受到外界溫度、光照的影響，培養(yǎng)基提供真菌生長所需的營養(yǎng)條件，對其生長代謝影響較大。適宜的外部環(huán)境不僅有利于菌體的生長，還能提高菌株對底物的利用能力，使代謝向著有利于目的產(chǎn)物合成的方向進行［14］。本研究結(jié)果表明，同一種屬的不同菌株在相同培養(yǎng)條件下，菌絲生長，菌球形態(tài)及產(chǎn)黑色素情況并不相同。ITS 測序可用于真菌屬種水平上的條形碼鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，具有操作簡單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)勢［20-22］。本研究采用ITS 測序?qū)┰嚲赀M行鑒定，結(jié)果表明11 株供試菌株均為香灰菌Annulohypoxylon stygium。其中Hp.sp0006 在PDA 加富培養(yǎng)基上菌絲生長迅速，平板L 值低且產(chǎn)黑色素較好，表明Hp.sp0006 可能是受遺傳物質(zhì)影響，具有生物特性較佳的菌株。

不同的香灰菌分泌黑色素的情況也不盡相同，篩選出一株穩(wěn)定的高產(chǎn)黑色素的香灰菌菌株，并獲得其最優(yōu)培養(yǎng)配方十分有意義。本實驗通過平板培養(yǎng)，以菌絲生長速度、菌球形態(tài)、平板L 值、黑色素含量為指標(biāo)，從碳源、氮源、碳氮比、維生素、pH 等5 個因素探究香灰菌高產(chǎn)黑色素的最佳配方。篩選出一株香灰菌菌株Hp.sp0006，并在此基礎(chǔ)上對Hp.sp0006 的最優(yōu)培養(yǎng)配方進行探究，篩選適合香灰菌Hp.sp0006 產(chǎn)黑色素的碳源、氮源、碳氮比、維生素等，在進行單因素優(yōu)化實驗時，單因素篩選時發(fā)現(xiàn)在碳源為葡萄糖，氮源為牛肉浸膏，維生素為VB1，碳氮比為10∶1，pH 為5 時，Hp.sp0006 菌絲健壯，平板L 值低，黑色素產(chǎn)量高。正交實驗結(jié)果表明Hp.sp0006 香灰菌菌株菌絲生長和高產(chǎn)黑色素的平板培養(yǎng)最適培養(yǎng)條件為：碳源為葡萄糖，氮源為牛肉浸膏，碳氮比為20∶1,pH 為6。Zhao 等［23］的研究表明，添加外源的硝普納（SNP）可以促進真菌Stemphyliumeturmiunum 黑色素的生物合成，NO可能通過NO-sGC-GMP 信號通路調(diào)節(jié)S.eturmiunum的生長和黑色素合成。在香灰菌培養(yǎng)基中添加外源的SNP 可能也是我們今后的研究方向。

4 結(jié)論

從11 株香灰菌Annulohypoxylon stygium中篩選出一株高產(chǎn)黑色素香灰菌菌株Hp.sp0006。確定Hp.sp0006 香灰菌菌株高產(chǎn)黑色素平板培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)配方：碳源為葡萄糖、氮源為牛肉浸膏、碳氮比20∶1、維生素為VB1，pH 為6，在此條件下，液體發(fā)酵液中黑色素含量為（1.21±0.17）g/L,為香灰菌黑色素的開發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ)。