張巖峰 丁燕玲 馬應(yīng) 周小南 楊朝云 史遠(yuǎn)剛 康曉龍

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

在哺乳動(dòng)物消化道中，存在大量微生物，人類體內(nèi)微生物是其體細(xì)胞數(shù)量的10 倍，預(yù)示它們編碼的獨(dú)特基因比人類自身的基因組多100 倍［1］。這一比例在牛上更加顯著，牛腸道菌群數(shù)目約是其體細(xì)胞的120 倍［2］，這反映了微生物在將飼料轉(zhuǎn)化為肉和奶等畜產(chǎn)品過程中的重要作用。當(dāng)微生物組中某些特定的菌群失調(diào)時(shí)，則會(huì)引起宿主發(fā)生疾病、影響發(fā)育生長［3-4］。因此，把微生物組作為一個(gè)特殊表型去預(yù)測(cè)復(fù)雜性狀是可行的，例如家畜的飼料利用效率［2,5］。此外，研究發(fā)現(xiàn)消化道的微生物組成與宿主基因型存在關(guān)系［5-6］，證明微生物群落的構(gòu)成不僅依賴于環(huán)境和飲食，而且還依賴于其宿主基因型。反芻動(dòng)物的生產(chǎn)中，腸道微生物菌群與飼料的消化利用率的關(guān)系已經(jīng)得到了證實(shí)［7-8］。在養(yǎng)殖過程中，飼料成本約占總成本的70%-80%［9］。提高飼料效率有助于提高飼養(yǎng)效益并減少環(huán)境污染［10］，選育高飼料效率的肉牛能夠增加肉牛養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。

剩余采食量（residual feed intak,RFI）是指動(dòng)物的實(shí)際飼料采食量與基于增重率和體型的預(yù)測(cè)采食量之間的差值。自Koch 等［11］提出后，經(jīng)過多年的研究和實(shí)踐，RFI 已經(jīng)成為了衡量家畜能量效率的主要指標(biāo)［12］，這主要是因?yàn)镽FI 具有中等遺傳力，且在遺傳上與生長和體型無關(guān)［13］。LRFI 的動(dòng)物在飼料利用方面是高效的，這表現(xiàn)在盡管采食量較低，但在生長方面沒有損失，具有良好的生產(chǎn)潛力［14］。雖然對(duì)造成RFI 的特定生物學(xué)機(jī)制尚未完全了解，但目前的文獻(xiàn)已經(jīng)確定了與飼喂方式、甲烷排放、蛋白周轉(zhuǎn)率、消化時(shí)間、活動(dòng)方式等的關(guān)系［15-18］。據(jù)估計(jì)，RFI 中大約14%的生物學(xué)變異與消化過程差異有關(guān)［19］，瘤胃微生物在營養(yǎng)物質(zhì)消化過程中承擔(dān)著重要作用，已有證據(jù)表明瘤胃菌落特征與RFI之間存在聯(lián)系［20］。

以往的研究表明，通過改變瘤胃微生物組來提高飼料利用效率存在可行性。為了探究肉牛RFI 與其胃腸道微生物的相關(guān)性，本研究選取極端RFI 個(gè)體，屠宰后收集個(gè)體瘤胃內(nèi)容物和糞便樣本進(jìn)行宏基因組測(cè)序。之后對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，物種注釋，功能注釋等分析，以此來明確不同RFI 個(gè)體中微生物的特征與差異，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行功能注釋分析，以期探究胃腸道微生物與肉牛RFI 表型之間的關(guān)系，為篩選與RFI 表型相關(guān)標(biāo)志微生物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取30 頭健康狀況良好，月齡（12±1 months）相近的安格斯去勢(shì)公牛，試驗(yàn)牛只均來自寧夏石嘴山市某養(yǎng)殖場，其初始體質(zhì)量為（266.7±35.7）kg。試驗(yàn)牛按照標(biāo)準(zhǔn)程序飼養(yǎng)，按照專利號(hào)CN201610301797.6 的飼料配方進(jìn)行飼喂，飼喂周期為81 d。試驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)RFI 表型值選擇RFI最高和最低的極端個(gè)體各5 頭，HRFI 組的RFI 值為1.12，0.69，0.53，0.47，0.47；LRFI 組的RFI 值為-0.97，-0.82，-0.77，-0.76，-0.73。采用頸動(dòng)脈放血進(jìn)行屠宰，分離出消化道，取出瘤胃內(nèi)容物固、液相混勻采集2 份，在腸道末端采集糞便2 份，分裝于50 mL 凍存管，于-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。本研究的?dòng)物處理程序均通過寧夏大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的倫理審查和批準(zhǔn)(NXUC20200618)。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 按照CTAB 法標(biāo)準(zhǔn)化操作流程提取糞便和瘤胃液中的DNA，將提取的DNA 至于-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 測(cè)序文庫的構(gòu)建 將檢測(cè)合格的DNA 樣品通過超聲處理成350 bp 大小的片段，再對(duì)DNA 片段進(jìn)行末端拋光，A 尾處理，添加測(cè)序接頭，PCR 擴(kuò)增，純化PCR 產(chǎn)物等操作構(gòu)建文庫，并通過Agilent2100 Bioanalyzer、Q-PCR 檢測(cè)文庫質(zhì)量。將檢測(cè)合格的文庫在Illumina PE150 平臺(tái)上完成測(cè)序，得到原始數(shù)據(jù)。相關(guān)數(shù)據(jù)存放在NCBI 數(shù)據(jù)庫中，登錄號(hào)為PRJNA752224。

1.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理 使用Readfq（V8,https://github.com/cjfields/readfq）測(cè)序后的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理并采用Bowtie2 軟件（version2.2.4,http://bowtiebio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）去除牛源的污染，得到用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)。

1.2.4 Metagenome 組裝和基因預(yù)測(cè)分析 對(duì)上一步得到的糞便和瘤胃液的有效數(shù)據(jù)使用SOAPdenovo軟 件（V2.04,http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html）進(jìn)行組裝，組裝后采用MetaGeneMark（V2.10,http://topaz.gatech.edu/GeneMark/）進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，使用CD-HIT 軟件（V4.5.8,http://www.bioinformatics.org/cd-hit/）去冗余，使用Bowtie2（version2.2.4）進(jìn)行比對(duì)得到用于后續(xù)分析的非冗余基因（Unigenes），計(jì)算得到樣本中的豐度信息。

1.2.5 物種注釋分析 使用DIAMOND 軟件（v0.9.9.110,https://github.com/bbuchfink/diamond/）將Unigenes 與NCBI 的NR 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，獲得每個(gè)基因的物種注釋信息，并結(jié)合基因豐度表，獲得不同分類層級(jí)的物種豐度表。

1.2.6 功能注釋分析 使用DIAMOND 軟件將Unigenes 與KEGG、eggNOG、CAZy 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)得出相關(guān)基因的功能注釋和豐度分析。利用R對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)的可視化。

2 結(jié)果

2.1 RFI分組結(jié)果

對(duì)高低剩余采食量兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，HRFI 組與LRFI 組的剩余采食量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HRFI 組剩余采食量顯著高于LRFI 組（P<0.05），即HRFI 組每天比LRFI 組多采食1.46 kg，占LRFI 組日均采食量的12%；而兩組平均日增重?zé)o顯著差異（P>0.05）。由于與前期文章屬于同一批樣本，詳細(xì)表型統(tǒng)計(jì)見已發(fā)表文獻(xiàn)［21］。

2.2 基因預(yù)測(cè)和豐度分析

通過對(duì)數(shù)據(jù)預(yù)處理和組裝后，能夠得到用于后續(xù)處理的有效數(shù)據(jù)。經(jīng)質(zhì)控過濾，分別從糞便樣FB.H 和FB.L 及瘤胃液樣LWY.H 和LWY.L 中獲得了63 514.59、63 953.72、65 840.72 和65 736.44 Mb有效數(shù)據(jù)。有效數(shù)據(jù)中測(cè)序錯(cuò)誤率小于1%（Q20）的reads 達(dá)到97%以上，表明測(cè)序數(shù)據(jù)可靠性較高。對(duì)FB.H、FB.L、LWY.H 和LWY.L 進(jìn)行組裝后分別得到962 128 234、1 281 607 466、1 206 843 305和1 311 619 661 bp 的Scaftigs。基因預(yù)測(cè)分別得到1 470 490、1 951 578、1 822 963 和1 763 022 條ORFs，去冗余后，完整基因所占比例均達(dá)到了22%以上，表明后續(xù)物種注釋和基因功能分析有較高的可靠性。各樣本基本信息統(tǒng)計(jì)見表1。

表1 各樣本基本信息統(tǒng)計(jì)表Table 1 Basic information statistics of each sample

基于基因豐度表，通過隨機(jī)抽取不同數(shù)目的樣本，可以獲得不同數(shù)目樣本組合間的基因數(shù)目，由此構(gòu)建和繪制了Core 和Pan 基因的稀釋曲線，以研究樣本間的基因數(shù)目的相似性。隨著抽取樣本的增加，樣本核心基因（core-genome）數(shù)目逐漸降低，在樣本數(shù)達(dá)到4 之后非冗余基因數(shù)目就達(dá)到平衡（圖1-A），說明樣本之間核心基因的相似性很高；同時(shí)隨著樣本增加，樣本的泛基因組（pan-genome）數(shù)目不斷增加，并最終達(dá)到平衡（圖1-B），說明本試驗(yàn)采集的樣本數(shù)量多，足以覆蓋到機(jī)體胃腸道的全部微生物。

圖1 core-pan 基因稀釋曲線Fig.1 core-pan gene rarefaction curves

韋恩圖可以很好的解釋不同組間樣本的基因分布情況，尤其是不同組間的共有基因及特定基因的信息。糞便中共有基因?yàn)?7.23%，HRFI 組特異基因占23.18%，LRFI 組特異基因僅有9.59%（圖2-A）。瘤胃液中共有基因在兩組間高達(dá)80.03%，HRFI 組特異基因占10.13%，LRFI 組特異基因?yàn)?.84%（圖2-B）。

圖2 不同RFI 組瘤胃及糞便樣中基因數(shù)目比較Fig.2 Comparison of rumen and fecal gene numbers in different RFI groups

為了進(jìn)一步探究不同組之間基因數(shù)目差異，繪制箱型圖展示不同RFI 組個(gè)體在瘤胃及糞便樣本中的基因數(shù)目差異，如圖3所示，在糞便中HRFI、LRFI 組基因數(shù)目無差異（P>0.05），但在瘤胃液中HRFI 組基因數(shù)目顯著高于LRFI（P<0.05）。

圖3 不同RFI 組間基因數(shù)目差異箱圖Fig.3 Box plot of the differences in gene number among RFI groups

2.3 物種注釋

微生物樣本基因組的分類組成及物種注釋，可以更好地分析不同個(gè)體間微生物的差異［22］。本研究中，從不同分類層級(jí)的相對(duì)豐度表出發(fā)，選取在兩組中相對(duì)豐度最高的Top10 微生物種類，并將其余物種設(shè)置為Others，進(jìn)行組間及組織間菌群種類在門屬水平的差異特征。在門水平上，糞便中的物種分布無差異（P>0.05），擬桿菌門相對(duì)豐度最高，為優(yōu)勢(shì)菌門，其在HRFI、LRFI 組的相對(duì)豐度分別為37.49%、37.16%；其次是厚壁菌門，在HRFI、LRFI 組的相對(duì)豐度分別為31.52%、31.37%（圖4-A）。瘤胃液中優(yōu)勢(shì)菌門與糞便中相似，且HRFI的相對(duì)豐度豐度高于LRFI 組，如擬桿菌門在HRFI組相對(duì)豐度為36.07%，顯著高于LRFI 組的26.97%（P<0.05）；同樣的趨勢(shì)也體現(xiàn)在厚壁菌門，HRFI 組相對(duì)豐度為16.24%，顯著高于LRFI 組的12.54%（P<0.05）。

在屬水平上，糞便中HRFI、LRFI 組Top10 微生物的相對(duì)豐度無差異（P>0.05），第一優(yōu)勢(shì)屬為擬桿菌屬，HRFI、LRFI 組分別占10.37%、10.18%；普雷沃菌屬在HRFI、LRFI 組的相對(duì)豐度僅為3.79%、3.89%。與糞便組相比，瘤胃液中的普雷沃菌屬是最大優(yōu)勢(shì)屬，HRFI 組與LRFI 組存在顯著差異（P<0.05），普雷沃菌屬的相對(duì)豐度由HRFI 組的24.08%下降到LRFI 組的18.76%，其他優(yōu)勢(shì)屬均有相同的下降趨勢(shì)（圖4-B）。

圖4 門水平和屬水平的物種相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundances of species at phylum level and genus level

為了篩選HRFI、LRFI 組具有顯著差異的生物標(biāo)志物（biomarker），通過LefSe（LDA Effect Size）分析得到差異物種的LDA 值分布圖（圖5）。在糞便中，篩選得到的Biomarker 只在LRFI 組出現(xiàn)，分別為丹毒絲菌目（Erysipelotrichales）、丹毒絲菌綱（Erysipelotrichia）、Turicibacter屬、八迭球菌屬（Sarcina）。在瘤胃組，篩選得到的Biomarker 分布在HRFI 組，與糞便中恰好相反。LDA score ≥4共有11 個(gè)，分布在種水平有7 個(gè)，由于種水平對(duì)微生物組的貢獻(xiàn)有限，相關(guān)研究主要集中于種以上水平微生物特征［23］。根據(jù)上述結(jié)果，可作為糞便或瘤胃組中潛在Biomarker 的有甲烷桿菌綱（Methanobacteria）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、古細(xì)菌科（Paludibacteraceae）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）。

圖5 糞便和瘤胃液差異物種的LDA 值分布圖Fig.5 Distribution of LDA values for species with differences in fecal and rumen fluid

2.4 功能注釋

為了深入了解微生物群落的功能多樣性，基于KEGG、eggNOG、CAZy 數(shù)據(jù)庫對(duì)去冗余后的ORFs進(jìn)行了各數(shù)據(jù)庫level1 層級(jí)的功能注釋。KEGG 通路分析如圖6-A 所示，在糞便中，HRFI、LRFI組的新陳代謝（Metabolism）分別占所有通路的50.67%、48.94%，遺傳信息處理（genetic information processing）分別占所有通路的23.90%、22.67%。在瘤胃液中HRFI、LRFI 組中的新陳代謝分別占所有通路的30.17%、23.96%，遺傳信息處理分別占所有通路的14.49%、12.16%。對(duì)糞便、瘤胃液微生物的六大代謝通路進(jìn)行分析對(duì)比，可以得到糞便中注釋到通路上基因大于瘤胃液的（P<0.05）。進(jìn)一步對(duì)組間功能差異的LEfSe 分析，在瘤胃液中LRFI 組最具代表性的是K07451（mcrA）、K01185（lysozyme）、K03283（HSPA1s）、K07198（AMPK）、K07893（RAB6A）、K07874（RAB1A）、K08857（NEK1_4_5）、k13412（CPK）、k02334（dpo）、k07901（RAB8A）（圖7-A）。如圖6-B 所示，eggNOG 功能注釋佐證了KEGG 的分析結(jié)果，糞便中功能基因的相對(duì)豐度顯著高于瘤胃液中功能基因的相對(duì)豐度（P<0.05）。在eggNOG 數(shù)據(jù)庫的富集中，富集的功能類別主要集中在翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物生成，復(fù)制、重組和修復(fù)，碳水化合物的運(yùn)輸和代謝，氨基酸的運(yùn)輸和代謝（圖7-B）。碳水化合物活性酶（CAZymes）數(shù)據(jù)庫經(jīng)常用于解密與碳水化合物酶相關(guān)的宏基因組序列的功能關(guān)聯(lián)。由圖6-C 可以看出糖苷水解酶類（GHs）的含量在各組中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，分別占總碳水化合物酶的59.25%、58.15%、55.61%、48.61%；其次為糖苷轉(zhuǎn)移酶類（GTs）、多糖裂解酶類（PLs）、糖水化合物脂酶類（CEs）和碳水化合物結(jié)合模塊（CBMs）；輔助模塊酶類（AAs）相對(duì)豐度最低。利用LefSe 分析篩選顯著差異的功能Biomarker 時(shí)，LDA score>4的有3 個(gè)，分別是LRFI 瘤胃液中的GH24，HRFI瘤胃液中的GH43，LRFI 糞便中的GH13（圖7-C）。

圖6 KEGG、eggNOG、CAZy 功能注釋圖Fig.6 Functional annotation map of KEGG,eggNOG,and CAZy

圖7 KEGG、eggNOG、CAZy 差異功能的LDA 值分布圖Fig.7 Distribution of LDA values for KEGG,eggNOG,and CAZy differential functions

3 討論

3.1 不同RFI組物種組成差異和生物標(biāo)記物

本研究分析結(jié)果顯示，無論在門水平還是屬水平，糞便中微生物的物種組成總比瘤胃液中擁有更少的差異性，這是由于瘤胃微生物群落是飼料利用效率中的核心，可以通過發(fā)酵活性調(diào)節(jié)宿主可獲得的能量［24］，而腸道末端的糞便雖然來源于十二指腸上端，但隨著食糜從一個(gè)部位轉(zhuǎn)移到另一個(gè)部位，微生物群落多樣性會(huì)發(fā)生顯著變化［25］。本研究中，糞便樣中的微生物在HRFI、LRFI 組之間差異不顯著，表明糞便中細(xì)菌群落與RFI 表型相關(guān)性較低，因此，糞便樣本能否作為瘤胃液的替代物對(duì)RFI 相關(guān)微生物群落進(jìn)行分析及早期篩選，有待更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支撐，這與Noel 等［26］的結(jié)論一致。在瘤胃液中，LRFI 組微生物的相對(duì)豐度小于HRFI 組，較低的相對(duì)豐度出現(xiàn)在飼料利用效率更高的群體。已有的文獻(xiàn)中也得到了類似的結(jié)果，較低的微生物組基因含量和分類單元豐富度與較高的飼料效率緊密相關(guān)［27］；研究人員通過分析不同奶牛產(chǎn)奶量的瘤胃細(xì)菌群落發(fā)現(xiàn)，與低產(chǎn)奶牛相比，高產(chǎn)奶牛的瘤胃細(xì)菌豐度和菌種均勻度較低［28］。高效的瘤胃微生物組成多樣性及相對(duì)豐度較低［27-28］，可能產(chǎn)生的相關(guān)分解代謝物范圍較小，意味著較少的微生物代謝損耗。

HRFI、LRFI 組在門水平最豐富的微生物均為擬桿菌門和厚壁菌門，但糞便中的厚壁菌門是瘤胃液中的兩倍左右。厚壁菌門擁有能夠分解纖維素并產(chǎn)生機(jī)體可以直接吸收利用的短鏈脂肪酸的能力［29］，厚壁菌門的顯著差異可能是不同部位消化效率差異的原因之一。在瘤胃液中，擬桿菌門在HRFI組占比36.07%，高于LRFI 組的26.97%，而擬桿菌門主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的水解，碳水化合物的降解以及氨基酸向乙酸鹽的發(fā)酵［30］，這可能與HRFI 消耗更多的飼料有關(guān)。在屬水平上，糞便中和瘤胃液中的物種組成在屬水平有顯著差異。糞便中第一優(yōu)勢(shì)屬為擬桿菌屬，而瘤胃液中相對(duì)豐度最高的為普雷沃菌屬，這與前人的研究結(jié)果一致［31-32］，但相對(duì)豐度低于之前的研究，可能是研究物種、日糧條件、環(huán)境及研究方法等不同引起。

利用LEfSe 對(duì)不同RFI 組間微生物物種差異進(jìn)行分析，當(dāng)LDA 值≥4 時(shí)，認(rèn)為該物種是生物標(biāo)記物（Biomarker）。丹毒絲菌綱（Erysipelotrichia）豐度在糞便中組間具有顯著差異，且在LRFI 有較多的富集，這與McGovern 等［33］的研究相符，關(guān)于該菌種的相關(guān)研究較少，尚不清楚其具體作用，但有研究者在研究人的肥胖與菌種關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)該菌種在肥胖組中有較高豐度［34］。此外，瘤胃液中差異最顯著的是甲烷桿菌綱，在HRFI 組有較多的富集，Lam等［35］的研究也有相同的發(fā)現(xiàn)。有研究通過35 個(gè)國家的32 個(gè)動(dòng)物物種的742 個(gè)樣本中前腸微生物群落組成，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的特征較差，但甲烷菌在世界范圍內(nèi)高度保守［36］。因此，可以推測(cè)甲烷菌的這種差異可能與RFI 相關(guān)，甲烷桿菌綱在HRFI 組的較高豐度表明HRFI 組肉牛采食量較高的同時(shí)也更容易產(chǎn)生甲烷，這個(gè)結(jié)果符合前人的研究［37］。據(jù)報(bào)道，具有不同RFI 的肉牛的能量代謝顯著不同［38］，其中牛產(chǎn)生甲烷所需的能量是其攝入能量的6%［39］，這導(dǎo)致宿主攝入能量的大量流失。甲烷菌的差異可能造成消化效率的差異，進(jìn)而影響RFI 的高低。在HRFI 組還發(fā)現(xiàn)了沙眼衣原體，這是能夠引起許多疾病的病原菌，也會(huì)引起一些亞臨床癥狀［40］，造成機(jī)體消化效率降低，可能是導(dǎo)致RFI 較高的原因之一。

3.2 不同RFI組的微生物功能注釋

在KEGG 數(shù)據(jù)庫的富集中，新陳代謝的基因數(shù)量最多，其次是遺傳信息處理，環(huán)境信息處理，細(xì)胞過程、人類疾病和生物體系統(tǒng)。通過LEfSe 分析篩選組間具有顯著差異的功能Biomarker，在瘤胃液中HRFI 組、LRFI 組，糞便中HRFI 組都發(fā)現(xiàn)了區(qū)分不同組的Biomarker。這些Biomarker 在菌落的生長過程發(fā)揮不同的作用。研究人員發(fā)現(xiàn)mcrA基因可以分辨不同甲烷菌的種群［41］，本文中的差異可能預(yù)示HRFI、LRFI 組中的甲烷菌屬于不同的種群。有研究人員發(fā)現(xiàn)熱休克70 kD 蛋白基因的純合性與肥胖高度相關(guān)［42］。AMP 依賴的蛋白激酶（AMPK）是至關(guān)重要的細(xì)胞能量傳感器，可以調(diào)節(jié)全身的代謝能量平衡［43］。Ras 通路是一個(gè)十分明確的通路，它能夠在級(jí)聯(lián)放大后激活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞的生長分化［44］。這些功能上的差異表明腸道微生物作為一個(gè)整體時(shí)會(huì)呈現(xiàn)出一定的差異，這有助于深入理解微生物對(duì)宿主的影響。在瘤胃液中HRFI 組，K07133（dUTP 焦磷酸酶）有顯著富集，dUTP 焦磷酸酶（dUTPase）能夠催化dUTP 水解為dUMP 和PPi，從而防止復(fù)制過程中尿嘧啶摻入DNA 影響遺傳穩(wěn)定，該酶對(duì)細(xì)菌的生長繁殖非常重要［45］。另外有K02335（DNA 聚合酶I）、K05349（β-葡糖苷酶）、K01992（ABC-2 型運(yùn)輸系統(tǒng)滲透酶蛋白）在瘤胃液中HRFI 組顯著富集。在糞便中HRFI 組，K01955（氨基甲酰磷酸合酶大亞基）、K01915（谷氨酰胺合成酶）、K00764（氨基磷酸肌苷轉(zhuǎn)移酶）、K01951（GMP 合成酶）、K02355（延展因子G）有顯著富集，但在糞便中LRFI 組卻沒有發(fā)現(xiàn)Biomarker，可能與糞便中HRFI 組和LRFI 組功能注釋無差異有關(guān)。

腸道微生物編碼的碳水化合物活性酶在將飼料中復(fù)雜的碳水化合物分解成可被宿主腸上皮吸收的成分中起著至關(guān)重要的作用［46］。本研究的結(jié)果顯示，HRFI、LRFI 組碳水化合物活性酶的多樣性無差異，但各碳水化合物活性酶的相對(duì)豐度卻存在顯著差異。糖苷水解酶類是瘤胃液中相對(duì)豐度最高的一類酶，這與張慧敏等［47］在海子水牛的結(jié)果一致。因?yàn)槠绽孜志鷮偈桥Ａ鑫钢蠫Hs 的主要貢獻(xiàn)者［48］，瘤胃中糖苷水解酶的相對(duì)豐度與普雷沃菌屬的相對(duì)豐度有很大的相似性。糖苷水解酶類能夠水解復(fù)雜碳水化合物的糖苷鍵，有助于微生物降解纖維素、半纖維素和淀粉［49］。HRFI 組CHs 相對(duì)豐度高于LRFI 組的原因可能是過多糖苷水解酶加速微生物對(duì)飼料中纖維素的降解，造成機(jī)體的空腹感增強(qiáng)，從而導(dǎo)致采食量增加，RFI 升高。為了補(bǔ)充胃腸道微生物群的功能注釋分析，使用eggNOG 數(shù)據(jù)庫對(duì)胃腸道微生物組的直系同源群（orthologous groups,OGs）進(jìn)行了功能分析，但較多富集的同源蛋白并未表現(xiàn)出差異，一些差異顯著的同源蛋白在微生物中表達(dá)水平普遍較低，但在相對(duì)豐度上卻存在顯著差異，由于目前的研究較少，沒有足夠的證據(jù)證明微生物中同源蛋白的相對(duì)豐度會(huì)通過微生物間接影響宿主的消化利用和機(jī)體生長。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)瘤胃液與糞便樣本微生物結(jié)構(gòu)組成差異顯著。糞便及瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌門均為擬桿菌門和厚壁菌門；糞便中的優(yōu)勢(shì)屬為擬桿菌屬，瘤胃液中的優(yōu)勢(shì)屬為普雷沃菌屬。糞便中的丹毒絲菌綱、瘤胃液的甲烷桿菌綱可作為肉牛LRFI 個(gè)體篩選的潛在生物標(biāo)志物。瘤胃及糞便微生物可部分解釋肉牛RFI 差異，同時(shí)微生物基因功能上的差異也有助于理解肉牛RFI 相關(guān)的表型變異。