3種草本凋落物混用強(qiáng)化修復(fù)石油污染土壤的效果

周雯星， 胡 漫， 王麗潔， 田 爽， 陳 風(fēng)， 黃琰瑩， 張曉曦,2

(1.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000；2.陜西省黃土高原資源植物研究與利用省市共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000)

作為最主要的能源和工業(yè)原料之一，石油為推動世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供了重要動力。然而其開發(fā)過程中頻發(fā)的泄漏事故或廢物不當(dāng)處理已造成了不同程度的土壤污染，使土壤透氣導(dǎo)水通路減少、抑制生物的生長甚至造成其死亡或群落結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致土壤生態(tài)功能被破壞、生態(tài)系統(tǒng)退化等問題[1-2]，尤其在油田開采區(qū)這類環(huán)境問題亟待解決。

生物刺激是目前廣受關(guān)注的油污土壤修復(fù)技術(shù)之一，具體是指通過添加刺激劑、改善土壤養(yǎng)分限制狀態(tài)和微生境、提高土著菌對污染物的降解能力的1種技術(shù)。植物殘?bào)w(如凋落物)作為生物刺激劑的1種，易于獲得且成本低廉。進(jìn)入土壤后，其可顯著改善土壤水、氣條件[3]，同時(shí)釋放養(yǎng)分和簡單有機(jī)物(如糖類和氨基酸)為降解菌提供易利用碳源和氮、磷源，解除其生長受到的限制；或釋放有機(jī)酸、黃酮、萜類、多酚和木質(zhì)素等輔助降解菌，吸收并分解污染物或誘導(dǎo)相應(yīng)的降解酶(如木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶、錳過氧化物酶和脫氫酶等)的分泌，從而大幅提高石油降解率[4-5]。如添加麥草秸稈后，油污土壤中厚壁菌門(Firmicutes)細(xì)菌等降解微生物的豐度顯著提高，使C14～C30烷烴降解90%以上[4]；可可豆莢和大蕉皮等農(nóng)業(yè)廢棄物可有效促進(jìn)土壤中石油降解細(xì)菌和真菌的增殖，使石油降解率達(dá)到80%以上[6]；而紫花苜蓿(Medicagosativa)凋落物處理120 d后，使石油殘留量比自然衰減對照減少60%以上[7]。

然而，現(xiàn)有研究多數(shù)僅僅關(guān)注單種植物殘?bào)w的修復(fù)效果，而較少關(guān)注混合植物殘?bào)w的修復(fù)能力。有研究表明，使用單種植物殘?bào)w處理污染土壤時(shí)，可能由于某些殘?bào)w化學(xué)組成的特殊性(如富含氮素但磷素缺乏)導(dǎo)致其對降解菌生長的促進(jìn)作用受限，抑或因分解緩慢而無法在污染物老化前充分發(fā)揮促進(jìn)降解的作用。而數(shù)種植物殘?bào)w混合分解時(shí)往往可為微生物提供更均衡的養(yǎng)分、加速凋落物整體的分解和物質(zhì)釋放。相應(yīng)地，其對土壤生化性質(zhì)的影響也呈現(xiàn)類似的非加和效應(yīng)[8-9]。當(dāng)混合分解產(chǎn)生明顯協(xié)同作用時(shí)，即可能顯著改善土壤的生化性質(zhì)。例如，馬尾松(Pinusmassoniana)、小葉櫟(Quercuschenii)和白茅(Imperatacylindrica)凋落物混合處理后，土壤全氮和速效鉀含量顯著增加，對微生物數(shù)量和多樣性的改善效果也顯著高于任一單種凋落物的處理效果[8]；小葉楊(Populussimonii)與落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)凋落物混合分解時(shí)，其對土壤過氧化氫酶和脫氫酶等活性的提高率均表現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)[9]。鑒于上述土壤性質(zhì)均顯著影響石油污染物的降解，筆者推測采用混合植物殘?bào)w處理油污土壤，可能可以利用其對土壤相關(guān)生化性質(zhì)的協(xié)同改善強(qiáng)化其修復(fù)效果。然而，已有研究對于混合殘?bào)w修復(fù)效果的關(guān)注仍較少，且往往將混合視為一個(gè)整體而不考慮凋落物間的相互作用，因此上述推測尚需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

陜北地區(qū)是中國主要的石油基地之一，同時(shí)其脆弱生境也受到石油污染的嚴(yán)重威脅。達(dá)烏里胡枝子(Lespedezadavurica)、鐵桿蒿(Artemisiagmelinii)和黃蒿(Artemisiascoparia)是當(dāng)?shù)爻Ｒ姷囊吧参铮以谖廴緟^(qū)能夠大量生長，其凋落物是污染區(qū)周邊最易獲取的植物殘?bào)w。因此，筆者以上述3種植物的單種和混合凋落物處理含石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)15 g/kg的油污土壤，比較單種和混合凋落物處理對去除石油污染物的效果。另外，考慮到對油污土壤修復(fù)最終需要實(shí)現(xiàn)對土壤功能的恢復(fù)[10]，同時(shí)評價(jià)了混用凋落物對改善土壤受損生化性質(zhì)的效果是否也存在強(qiáng)化效應(yīng)。以期為探索通過簡單混合方式強(qiáng)化植物殘?bào)w修復(fù)效果的技術(shù)途徑提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

石油購自延安市延長縣嚴(yán)家灣鎮(zhèn)某采油區(qū)。達(dá)烏里胡枝子凋落物(LD)、鐵桿蒿凋落物(AG)和黃蒿凋落物(AS)，于2018年10月采集自延安市延長縣嚴(yán)家灣鎮(zhèn)某采油區(qū)附近未污染區(qū)域，通過齊地刈割的方法收集3種凋落物后，去除腐爛及蟲蛀部分后帶回實(shí)驗(yàn)室風(fēng)干、粉碎、過2 mm篩分后備用。3種凋落物化學(xué)組成見表1。二氯甲烷、甲醇、正己烷、無水硫酸鈉、中性氧化鋁、氯化鉀、苯酚、碳酸氫鈉、乙酸銨、高錳酸鉀、尿素、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、磷酸苯二鈉、4-氨基安替比林、2,3,5-三苯基氯化四氮唑、焦性沒食子酸、層析硅膠(100～200目)、次氯酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%)和過氧化氫(質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酶活性測定試劑盒、Biolog Eco板，購自陜西軒宸生物科技有限公司。

表1 3種凋落物的化學(xué)組成Table 1 Chemical constitution of three types of litters

1.2 模擬污染土壤的制備

隨機(jī)選取油污區(qū)周邊坡地上的裸露地塊，隨機(jī)選取1 m×1 m的樣方若干，采集0～10 cm土層土壤?；旌暇鶆蚝蟛捎? mm篩去除石礫和動植物殘?bào)w，以四分法獲得約10 kg土壤，并采用質(zhì)量法確定該土樣不含石油污染物[11]。預(yù)留部分上述土樣用于確定未污染土壤生化性質(zhì)的初始狀態(tài)，其余用于模擬污染土壤制備。根據(jù)當(dāng)?shù)貙?shí)際石油污染程度(含石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)15.40～43.58 g/kg)，選取面積最大的輕度污染區(qū)為模擬對象，設(shè)定石油污染質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15 g/kg。制備模擬污染土樣時(shí)，不使用有機(jī)溶劑以避免對土壤生化性質(zhì)的干擾。稱取7.2 kg土壤，將108 g石油與2.2 kg土壤充分揉搓混合均勻，隨后與剩余5 kg土壤再次混合均勻。制備好的污染土壤靜置15 d以使其中污染物達(dá)到自然均質(zhì)化后，采用質(zhì)量法[11]測得石油殘留率為96.80%(實(shí)際總石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.5 g/kg，其中飽和烴、芳香烴和非烴物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.4、4.2和2.9 g/kg)?？紤]測定誤差時(shí)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上可以認(rèn)為均質(zhì)化后土壤的污染物質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變。預(yù)留部分污染土壤用于確定污染對土壤生化性質(zhì)的干擾后，其余用于后續(xù)修復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 對照和處理設(shè)置及油污修復(fù)土壤實(shí)驗(yàn)

分別稱量(干重)LD、AG和AS單種凋落物每種3份、3種凋落物混合物3份(LD、AG、AS質(zhì)量比為1∶1∶1)，共計(jì)12份凋落物樣品。

設(shè)置未污染土壤(未污染土壤直接測定，Unc)和污染土壤(污染物自然均質(zhì)化15 d后測定，CS)2個(gè)對照，采用自然衰減(NA)、LD添加、AG添加、AS添加和混合凋落物添加(Mix)5種處理方式。分別稱取400 g油污土壤樣品15份，其中3份不添加凋落物作為自然衰減處理樣品。其他12份按照凋落物/土壤質(zhì)量比1/50混合得到凋落物修復(fù)樣品[7]，按單種凋落物和混合凋落物處理樣品分為4組，每組3份。將每份自然衰減或凋落物處理樣品置于容積為750 mL的塑料培養(yǎng)缽中，均勻噴入滅菌蒸餾水，調(diào)節(jié)土壤含水量為飽和持水質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%。利用保鮮膜封口避免土壤水分的蒸發(fā)，并在保鮮膜上均勻扎開氣孔以為微生物活動提供空氣。定期根據(jù)失水量(通過質(zhì)量損失測定)揭開缽口用噴壺補(bǔ)充蒸餾水以保持土壤含水量一致，在20～25 ℃、土壤濕度為飽和水質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的條件下培養(yǎng)150 d終止。

1.4 石油組分及土壤化學(xué)指標(biāo)的測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每份樣品中取出約200 g，在避光條件下風(fēng)干并過1 mm篩，然后測定石油及其組分殘留量(用以計(jì)算降解率)以及土壤化學(xué)指標(biāo)。其中，單位質(zhì)量(10 g)土壤中的石油殘留質(zhì)量采用超聲波萃取-質(zhì)量法測定。殘留石油經(jīng)正己烷溶解、沉淀后，其中飽和烴、芳香烴和非烴物質(zhì)的質(zhì)量采用柱層析分離-質(zhì)量法測定(經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，分離過程未造成污染物質(zhì)量顯著損失)[11]。土壤pH值采用玻璃電極法測定(水/土質(zhì)量比2.5/1)，硝銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量分別采用氯化鉀浸提-靛酚藍(lán)比色法-紫外光度法、碳酸氫鈉浸提-磷鉬藍(lán)比色法和乙酸銨浸提-火焰光度法測定[12]。

將回收后各處理預(yù)留的約200 g土樣(每種處理方法分別制備3份)分別過1 mm篩，直接用于測定土壤酶活性。依據(jù)《土壤酶及其研究方法》[13]，蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定，脲酶活性采用靛酚藍(lán)比色法測定，過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定，堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定，脫氫酶活性采用三苯基四氮唑氯化物比色法測定，多酚氧化酶活性采用鄰苯三酚比色法測定，木質(zhì)素過氧化物酶活性采用2,2′-聯(lián)氨-雙-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二氨鹽(ABTS)比色法測定，漆酶活性采用藜蘆醇比色法測定，錳過氧化物酶活性采用硫酸錳比色法測定。除過氧化氫酶活性以反應(yīng)20 min后滴定殘留底物(過氧化氫)消耗的0.01 mol/L KMnO4溶液的體積(mL)表示外，上述酶活性均以單位時(shí)間內(nèi)單位質(zhì)量土壤(換算為干重，g)中產(chǎn)生的相應(yīng)催化產(chǎn)物的質(zhì)量或物質(zhì)的量表示。

利用Biolog-ECO技術(shù)分析土壤微生物群落的代謝(碳源利用)特征。在Biolog Eco測試板上依據(jù)賈夏等[14]的方法制備和接種土壤菌液，隨后將Eco板在25 ℃下培養(yǎng)240 h，每24 h讀取590 nm波長下的光密度值(OD590 nm)。測定完成后，基于培養(yǎng)240 h時(shí)讀取的數(shù)據(jù)計(jì)算所有31種或特定碳源類型(劃分為6大類，包括胺類、氨基酸類、糖類、羧酸類、雙親化合物和聚合物)的平均孔顏色變化率(Average well color development，AWCD)，用以代表微生物的代謝強(qiáng)度。同樣基于240 h獲取的數(shù)據(jù)，使用IBM SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，使用Microsoft Office Excel 2019軟件計(jì)算代謝多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener指數(shù)H′和均勻度指數(shù)E)。

AWCD=∑(Ci-R)/n

(1)

式(1)中：Ci為第i個(gè)非對照孔的吸光值；R為對照孔的吸光值(無量綱)；n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)。

H′=-∑Ai-lnAi

(2)

E=H′/lnN

(3)

式中(2)、(3)：Ai為第i個(gè)孔的吸光值；N為被利用碳源的總數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

測定結(jié)束后，依據(jù)式(4)計(jì)算土壤樣品中石油及其各組分的降解率(Rj，%)。

(4)

在假設(shè)不同凋落物處理土壤時(shí)不產(chǎn)生相互影響的情況下(即加性效應(yīng))，混合凋落物添加處理后土壤石油及其組分降解率或其他土壤生化性質(zhì)的預(yù)測值可以視為3種單獨(dú)凋落物處理下對應(yīng)指標(biāo)值的算術(shù)平均[9]。在后續(xù)表述中，將其同樣視為一種處理方式(記為MixP)以便于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

使用SPSS 23.0軟件對各處理方式下土壤石油及其組分降解率或土樣的化學(xué)和生物學(xué)指標(biāo)做單因素方差分析，多重比較采用最小顯著差法(LSD)，顯著性檢驗(yàn)水平為α=0.05。當(dāng)混合凋落物添加處理后某指標(biāo)的實(shí)測值顯著大于對應(yīng)預(yù)測值時(shí)，可認(rèn)為凋落物混合使用時(shí)產(chǎn)生顯著協(xié)同促進(jìn)作用，使凋落物的修復(fù)效果得到強(qiáng)化。其中當(dāng)針對混合凋落物添加處理后某一指標(biāo)的實(shí)測值同時(shí)顯著大于任一單種凋落物添加處理下的實(shí)測值時(shí)，可認(rèn)為混合處理的強(qiáng)化效應(yīng)最優(yōu)。使用SPSS 23.0軟件對微生物31種碳源的代謝強(qiáng)度值作主成分分析。繪圖使用OriginPro 2021軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同處理方式對土壤中石油及其組分的降解效果

不同處理方式對土壤中石油及其組分的降解效果見圖1。由圖1可知：自然衰減處理150 d后土壤中的石油降解率為32.44%(概率P<0.05)，其中飽和烴的降解率(41.26%)遠(yuǎn)高于芳香烴和非烴物質(zhì)降解率(分別為29.90%和14.20%)；所有凋落物處理均可大幅提高石油降解率(提高了33.09%～42.80%)，其中飽和烴、芳香烴和非烴物質(zhì)的降解率分別提高了16.54%～38.70%、40.71%～47.94%、46.88%～58.71%(P<0.05)。

NA—Natural attenuation (without litter addition); LD—Lespedeza davurica litter; AG—Artemisia gmelinii litter; AS—Artemisia scoparia litter; Mix—Mixed litter addition withm(LD)∶m(AG)∶m(AS)=1∶1∶1; MixP—Predicted value of mixed litter addition treatment圖1 不同處理方式下土壤中石油及其組分的降解率(R)Fig.1 Degradation rates (R) of petroleum in soil and its components in different treatmentsConditions: T=20—25 ℃; Incubation 150 d; 50% of soil saturated water holding capacity

凋落物混用強(qiáng)化去除土壤污染物的能力，使石油降解率實(shí)測值比預(yù)測值提高了12.16%，其中飽和烴、芳香烴和非烴物質(zhì)的降解率實(shí)測值分別比各自的預(yù)測值提高了14.43%、9.24%和10.52%(P<0.05)。且混合凋落物處理對石油、特別是其中芳香烴和非烴物質(zhì)的降解能力均顯著高于任一單種凋落物(P<0.05)，僅對飽和烴的降解能力未超過單種凋落物處理的上限。產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因可能首先是油污土壤處于氮、磷限制狀態(tài)(不考慮土壤本身碳含量而氮、磷以全量計(jì)算時(shí)，污染土壤的碳、氮、磷質(zhì)量比約為100∶5∶5，高于降解微生物的適生范圍[2])，凋落物提供的速效氮、磷和其他養(yǎng)分促進(jìn)了降解菌的增殖和活性的提高，從而加速污染物的降解[2,15-16]。微生物代謝強(qiáng)度與硝態(tài)氮含量/飽和烴降解率的正相關(guān)關(guān)系以及銨態(tài)氮含量與非烴類物質(zhì)降解率的正相關(guān)關(guān)系均證明了這一推測(Spearman相關(guān)系數(shù)均大于0.9，P<0.05)。同時(shí)，凋落物可釋放有機(jī)酸等洗脫污染物協(xié)助微生物對其的吸收[5,17-18]，或提供萜類、黃酮、酚類和木質(zhì)素等共代謝底物，誘導(dǎo)木質(zhì)素降解酶和雙加氧酶等的分泌，從而促進(jìn)石油中難降解芳香環(huán)的裂解[19]。然而，單種凋落物難以滿足上述所有條件，而混用3種凋落物可以利用化學(xué)組成特性的互補(bǔ)通過上述多個(gè)途徑促進(jìn)污染物的降解，由此強(qiáng)化其整體的修復(fù)能力。例如，凋落物AS和LD能釋放的氮、磷、鉀、可溶性糖和氨基酸等更多，從而使微生物能獲取大量養(yǎng)分和能量加速其生長和代謝，同時(shí)其提供的黃酮和多酚較多，能夠協(xié)助微生物降解污染物[18]；而凋落物AG的木質(zhì)素含量更高，誘導(dǎo)微生物分泌木質(zhì)素氧化酶系能力更強(qiáng)[20]，且其提供的萜類共代謝底物也更多[19]。其次，凋落物混用使其化學(xué)多樣性增加并改善土壤的微環(huán)境條件，有利于分解者的生物量積累；而養(yǎng)分和分解抑制物在凋落物間的擴(kuò)散則可直接提高其總體的可分解性[21]。上述兩方面的改變可能導(dǎo)致顯著的混合分解非加和效應(yīng)，加速凋落物分解，從而短時(shí)間內(nèi)補(bǔ)充土壤微生物生長所需的能源和養(yǎng)分，在污染物老化前提高其降解率[15]。此外，不同凋落物基質(zhì)質(zhì)量的差異導(dǎo)致其“篩選”出特定的分解者，因而混用凋落物將在相當(dāng)程度上將增加土壤微生物的多樣性[22]。使得具有不同降解能力的微生物可以相互配合降解各種污染物組分，抑或通過自身代謝活動(如氮、磷轉(zhuǎn)化)為其他微生物提供養(yǎng)分支持，從而加快污染物的降解[23]。

2.2 不同處理方式對土壤生物學(xué)性質(zhì)的改善作用

不同處理方式下土壤酶活性的測定結(jié)果見表2。由表2可知：石油污染導(dǎo)致土壤脲酶和漆酶活性顯著降低，而堿性磷酸酶和多酚氧化酶活性顯著提高(P<0.05)；自然衰減導(dǎo)致脲酶和漆酶活性進(jìn)一步顯著降低，使磷酸酶活性顯著回落(仍高于對照水平，P<0.05)，且使未受污染影響的過氧化氫酶和木質(zhì)素過氧化物酶的活性也顯著降低。

表2 不同處理方式下的土壤酶活性Table 2 Soil enzyme activity in different treatments

較之自然衰減，所有單種凋落物處理均顯著恢復(fù)了脲酶和木質(zhì)素過氧化物酶活性，并提高了蔗糖酶和脫氫酶活性(P<0.05)。僅LD凋落物顯著提高了漆酶活性，其他凋落物則對其產(chǎn)生進(jìn)一步抑制(P<0.05)。除AS凋落物外，其他凋落物處理顯著提高了磷酸酶活性，使之達(dá)到污染土樣的水平(P<0.05)。

混用凋落物處理對過氧化氫酶和漆酶的活性影響存在協(xié)同效應(yīng)，使前者活性顯著高于預(yù)測值，且顯著高于所有單種凋落物處理(P<0.05)。但混用凋落物處理對蔗糖酶、多酚氧化酶和木質(zhì)素過氧化物酶活性的影響存在拮抗效應(yīng)，甚至使多酚氧化酶活性顯著低于單種凋落物處理的下限(AG和AS處理，P<0.05)，上述現(xiàn)象與前人在非污染土壤中觀察到的結(jié)果相似[9,24]。其中，協(xié)同效應(yīng)的產(chǎn)生原因

可能是混合凋落物提供的額外養(yǎng)分刺激了土壤微生物的生長并使其活性提高[2,15-16]，從而增加了過氧化氫酶和漆酶等的分泌(微生物代謝強(qiáng)度與漆酶活性顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.572，P<0.05)。另外，石油對酶活性的抑制作用部分源于其改變酶的分子構(gòu)象使其失活，或附著在酶表面阻止其與底物接觸[25-28]。而混合凋落物處理下污染物降解加速，解除了其對酶活性的直接抑制或其對底物和酶的包裹，使測得的酶活性有所提高[25,27-28]。再者，有研究表明，混用凋落物處理可能導(dǎo)致土壤中具有降解芳香環(huán)能力的微生物的數(shù)量比單種凋落物處理顯著提高[29]，從而提高相應(yīng)酶(如漆酶)的活性。而拮抗效應(yīng)的產(chǎn)生原因首先可能是混用加速了凋落物分解，導(dǎo)致凋落物源次生代謝物(如黃酮和萜類物質(zhì))在土壤中快速累積到臨界濃度，對微生物的生長和酶活性產(chǎn)生抑制效應(yīng)，從而使上述酶活性受到相應(yīng)的拮抗抑制[30]。此外，多酚氧化酶和木質(zhì)素過氧化物酶等的活性往往與底物的誘導(dǎo)有關(guān)[20,31]。由于混合凋落物處理后芳香族污染物降解加速，上述的酶活性可能由于大部分污染物在采樣時(shí)已經(jīng)降解，微生物對于相應(yīng)酶的需求降低而呈現(xiàn)顯著降低。例如本研究中，多酚氧化酶與多環(huán)芳烴的降解率即呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)-0.900，P<0.05)。

當(dāng)然，石油污染物和凋落物源次生代謝物對土壤酶活性的影響是非常復(fù)雜的，兩類物質(zhì)均可作為底物誘導(dǎo)酶活性的提高，同時(shí)也可能因其生物毒性對酶活性產(chǎn)生抑制(取決于其在土壤中的含量)。另外即使是同一類酶(如木質(zhì)素過氧化物酶和漆酶)，由于對底物的選擇性以及對污染物耐受能力的差異[32-33]，其活性對混用凋落物處理的響應(yīng)結(jié)果也可能存在差異(前者受到協(xié)同促進(jìn)而后者受到拮抗抑制)。因此，混用凋落物對于污染物降解及凋落物自身化學(xué)物質(zhì)釋放速率的改變將通過多個(gè)途徑影響酶活性，從而使混用凋落物處理對土壤酶活性的影響呈現(xiàn)出協(xié)同、拮抗或加性效應(yīng)等多種結(jié)果。

不同處理方式下土壤微生物的碳源利用特征見圖2。由圖2可知:污染顯著提高了土壤微生物的代謝強(qiáng)度(P<0.05，見圖2(a))，且增加了其對糖類和聚合物碳源的利用偏好(見圖2(b))，自然衰減處理則使其代謝強(qiáng)度顯著降低(特別是聚合物，P<0.05)。較之自然衰減處理，凋落物處理普遍顯著提高了微生物對6類碳源的代謝強(qiáng)度(特別是凋落物L(fēng)D，P<0.05)，且增加了其對胺類、羧酸類、雙親化合物和聚合物的利用偏好，使其對6類碳源的代謝強(qiáng)度趨于平均，這與甄麗莎等[34]以及王利彥等[35]對非污染土壤的研究結(jié)果類似。其原因可能是凋落物提供的氮、磷養(yǎng)分以及對微生境的改善促進(jìn)了微生物的生長[2,15]，而其提供的多種底物(如糖類和氨基酸)誘導(dǎo)了微生物對這些底物的利用[34]。

AWCD—Average well color development; Unc—Uncontaminated soil; CS—Contaminated soil; NA—Natural attenuation (without litter addition); LD—Lespedeza davurica litter; AG—Artemisia gmelinii litter; AS—Artemisia scoparia litter; Mix—Mixed litter addition with m(LD)∶m(AG)∶m(AS)=1∶1∶1; MixP—Predicted value of mixed litter addition treatment圖2 不同處理方式下土壤微生物的碳源利用特征Fig.2 Characteristics of carbon source utilization by soil microorganisms in different treatments(a) Alterations in the overall metabolic intensity of microbes during incubation; (b) The metabolic ability of microbes on 6 types of carbon sources at 240 h; (c) PCA of the microbial utilization for 31 species of carbon sources based on the data collected at 240 h; (d) The loading of 31 species of carbon sources on the axis PC1 and PC2, names of each carbon source presented in literature[14]Conditions: T=20—25 ℃; 50% of soil saturated water holding capacity

混用凋落物并未使處理后微生物的代謝強(qiáng)度與預(yù)測值產(chǎn)生顯著差異(P>0.05)，這與污染物降解和酶活性普遍受到顯著非加和影響的結(jié)果不符。其原因是主要從恢復(fù)土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化功能的角度出發(fā)[10]，選擇了以簡單糖、氨基酸和羧酸類(約占檢測碳源的2/3)為主要檢測碳源的Biolog Eco板。而由于混用對凋落物碳源種類的改變有限，因而對上述碳源代謝能力的影響較小。在后續(xù)研究中，可以通過使用Biolog MT板，增加其他更能反映污染物化學(xué)特性的碳源，以更全面地反映混用凋落物對土壤微生物代謝能力的影響。

進(jìn)一步的主成分分析(PCA)表明，污染明顯改變了土壤微生物的碳源偏好(主成分分析中，污染土壤(CS)樣品的第二主成分得分(PC2)與未污染對照(Unc)樣品的PC2值差異顯著，主要反映2種土壤中微生物對D-木糖、i-赤蘚糖醇、D-半乳糖酸γ-內(nèi)酯、L-精氨酸、L-天冬酰胺和腐胺等碳源利用偏好的差異)，而自然衰減處理對其幾無影響(見圖2(c))。

所有單種凋落物處理均使土壤微生物對糖類和氨基酸類碳源的利用接近未污染狀態(tài)(見圖2(d)，PC2軸)，但同時(shí)使其對羧酸類碳源的利用特征與未污染狀態(tài)下的區(qū)別更為明顯(見圖2(d))。混用凋落物處理后，土壤微生物的碳源偏好則與預(yù)測狀態(tài)以及凋落物AG和AS處理一致。其原因可能是凋落物提供了更多易于利用、且更接近未污染土壤有機(jī)質(zhì)組成的碳、氮源(糖類和氨基酸)[36]。但同時(shí)，凋落物分解產(chǎn)生的羧酸類物質(zhì)使處理后土壤微生物對羧酸類碳源的偏好增加。然而，由于混用并不影響凋落物總體的化學(xué)組成，因而混用對土壤微生物代謝偏好的影響也十分有限。

不同處理方式下土壤微生物的碳源利用多樣性測定結(jié)果見表3。由表3可知，污染導(dǎo)致土壤微生物碳源利用的香農(nóng)指數(shù)顯著升高(P<0.05)，而自然衰減處理對其無顯著影響(P>0.05)。所有單種凋落物處理均進(jìn)一步顯著提高了微生物代謝多樣性，其中LD和AS凋落物處理的提高效果顯著優(yōu)于AG凋落物(P<0.05);混合使用則并未顯著改變凋落物對微生物代謝多樣性的影響結(jié)果(P>0.05)。

表3 不同處理方式下的土壤微生物碳源利用多樣性Table 3 Diversity of carbon source utilization by soil microorganisms in different treatments

2.3 不同處理方式對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

不同處理方式下土壤的化學(xué)性質(zhì)見表4。由表4可知：污染導(dǎo)致土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷含量和pH值顯著降低。其原因是微生物降解污染物時(shí)需要適宜的碳、氮、磷比例，大量石油污染物碳源的輸入迫使微生物消耗土壤氮、磷養(yǎng)分對其進(jìn)行降解[16]，同時(shí)產(chǎn)生的酸性中間產(chǎn)物導(dǎo)致了土壤的酸化[37]。自然衰減處理導(dǎo)致土壤銨態(tài)氮和有效磷含量以及pH值進(jìn)一步顯著降低(P<0.05)。所有單種凋落物處理普遍可以大幅提高污染土壤的硝態(tài)氮和有效磷含量(P<0.05)，但所有凋落物對于銨態(tài)氮含量的恢復(fù)能力相對較弱，僅比自然衰減提高14%～72%，并使pH值進(jìn)一步顯著降低。

表4 不同處理方式下土壤的速效養(yǎng)分含量和pH值Table 4 Content and pH value of soil available nutrients in different treatments

凋落物混用使其對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響表現(xiàn)出一定拮抗效應(yīng)，使混合物對土壤硝態(tài)氮的補(bǔ)充作用顯著低于預(yù)測值和單種凋落物處理結(jié)果，降低均在20%～29%(P<0.05)范圍內(nèi)，且顯著削弱了單種凋落物對土壤的酸化效應(yīng)(P<0.05)，這與使用混合凋落物處理非污染土壤時(shí)的結(jié)果相似[9,24,38]。其原因是凋落物對土壤養(yǎng)分的補(bǔ)充作用一方面是由于其直接釋放了大量有效態(tài)養(yǎng)分，另一方面是由于凋落物處理去除了污染物，因而使得其對養(yǎng)分的固持減少[7]；而微生物的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化功能(如固氮、硝化、反硝化和脫磷酸作用等)有所恢復(fù)[3, 23]。然而混合凋落物處理下微生物生長和活性超出預(yù)期的提高及其對凋落物和污染物的快速降解均需要額外消耗大量的氮，這使得凋落物中釋放、甚至是土壤中加速轉(zhuǎn)化而來的速效氮被微生物固定[38]，造成表觀上的拮抗效應(yīng)。值得注意的是，混用并不影響凋落物對土壤銨態(tài)氮和速效磷、鉀的補(bǔ)充效果，其原因是混合分解不能改變凋落物釋放養(yǎng)分的總量，而混用凋落物處理對土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化功能的促進(jìn)效果可能有限(如混用凋落物處理時(shí)土壤脲酶和磷酸酶的活性與預(yù)測值無異)，因而對上述養(yǎng)分的補(bǔ)充效果等于單種凋落物處理的算術(shù)平均值。當(dāng)然，也可能是混用凋落物對土壤速效養(yǎng)分產(chǎn)生的協(xié)同補(bǔ)充效應(yīng)與微生物數(shù)量活性增加導(dǎo)致的養(yǎng)分消耗相互抵消，從而無法觀察到明顯的非加和效應(yīng)。產(chǎn)生上述現(xiàn)象的具體機(jī)理尚需通過測定分析土壤全量養(yǎng)分、微生物氮磷以及土壤速效養(yǎng)分含量及其之間的關(guān)系來確定。對于土壤pH值而言，凋落物處理使其降低的原因可能是凋落物自身分解釋放了酸性中間產(chǎn)物[37]，而混用加速了凋落物的徹底分解，因而使凋落物處理后土壤pH值的降低幅度減小。當(dāng)然，上述推測也尚需進(jìn)一步的研究加以驗(yàn)證。

3 結(jié) 論

(1)胡枝子、鐵桿蒿和黃蒿的凋落物混合添加(按質(zhì)量比為1∶1∶1)強(qiáng)化了對土壤石油污染物的降解效率，使石油總體的降解率比預(yù)測值(3種凋落物單獨(dú)處理的平均值)提高了12.16%，其中飽和烴、芳香烴和非烴物質(zhì)的降解率比對應(yīng)的預(yù)測值分別提高了14.43%、9.24%和10.52%。

(2)凋落物混用強(qiáng)化了對土壤漆酶和過氧化氫酶活性的刺激作用，但同時(shí)削弱了凋落物對木質(zhì)素過氧化物酶、蔗糖酶和多酚氧化酶活性的刺激作用和對土壤硝態(tài)氮的補(bǔ)充效果以及對土壤的酸化效應(yīng)；基于Biolog技術(shù)分析，混用并未改變凋落物處理對土壤微生物代謝強(qiáng)度、代謝多樣性和碳源偏好的影響結(jié)果。

(3)總體而言，不同凋落物混合利用可顯著強(qiáng)化土壤石油污染物的去除效果，但其對受損土壤性質(zhì)的改善效果的強(qiáng)化相對不明顯。凋落物混用處理油污土壤的同時(shí)，尚需配合其他手段以恢復(fù)土壤受損的生態(tài)功能。