蔡紹莉，徐皆歡，何孟纖，張德福，孫玲偉，張樹山，李婉君，吳彩鳳，主 性，戴建軍*

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025； 2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海 201106； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽資源(豬)評價利用重點實驗室，上海 201106； 4.上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201302)

自1972年Whittingham等[1]實現(xiàn)小鼠卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存以來，該技術(shù)已在牛、羊、兔、大鼠等二十多個物種上推廣應(yīng)用。與之相比，豬卵母細(xì)胞因脂質(zhì)含量高、滲透性差，阻礙了滲透保護劑對水分的充分置換，導(dǎo)致其冷凍時胞內(nèi)水分形成冰晶而發(fā)生機械性損傷。目前，豬卵母細(xì)胞冷凍效率仍很低[2]，直到2014年[3]和2015年[4]才分別自GV期與MII期冷凍卵母細(xì)胞中獲得了存活后代，但冷凍效率尚不足以推廣至生產(chǎn)應(yīng)用。已有研究證實，豬卵母細(xì)胞對低溫極其敏感，15 ℃下15 min基本喪失存活能力[5]。大量研究表明，豬卵母細(xì)胞胞內(nèi)的高濃度脂肪顆粒是造成其對低溫敏感的主要原因[6]。盡管通過對卵母細(xì)胞或胚胎進行離心去脂處理，可提高凍后存活率[7]，但高速離心和顯微操作會造成透明帶受損，導(dǎo)致潛在的病原感染風(fēng)險[8]，且成本高、技術(shù)難度大，不適用于生產(chǎn)應(yīng)用。另外，卵母細(xì)胞內(nèi)脂肪參與了氧化磷酸化、糖酵解、三羧酸循環(huán)等產(chǎn)能途徑，為細(xì)胞提供所需能量，是卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育的重要能源物質(zhì)。離心和去脂處理對脂肪顆粒分布、卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的完整性和能量供給均產(chǎn)生較大負(fù)面作用，嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進程[9]。

一些天然化合物，如左旋肉堿[10]、毛喉素[11]等已被證實可在不影響卵母細(xì)胞成熟的情況下降低其脂質(zhì)含量，但目前尚未在冷凍保存中得到應(yīng)用。毛喉素是一種自毛喉鞘蕊花中分離得到的天然降脂物質(zhì)，不僅能促進脂質(zhì)分解，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞生理進程與新陳代謝[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，在豬胚胎培養(yǎng)基中加入毛喉素可降低其胚胎中的脂質(zhì)含量[11,13]。基于此，本研究擬利用非侵入式的化學(xué)降脂方法，通過在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)過程中添加毛喉素，成熟后檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴含量、超微結(jié)構(gòu)、線粒體膜電位、卵母細(xì)胞活性氧水平、凍后存活率及發(fā)育潛能等多方面的變化，評價毛喉素的降脂效果和對豬卵母細(xì)胞抗凍能力的影響，促進卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)在豬保種中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗分組

豬卵母細(xì)胞分組處理如下：經(jīng)體外成熟培養(yǎng)的MII期卵母細(xì)胞組(Fresh)、成熟培養(yǎng)期間經(jīng)毛喉素處理的MII期卵母細(xì)胞組(Forskolin)、未經(jīng)毛喉素處理的MII期卵母細(xì)胞冷凍-解凍組(Vitirfied)、經(jīng)毛喉素處理的MII期卵母細(xì)胞冷凍-解凍組(Vitirfied+Forskolin)。

1.2 試劑

Medium-199 with HEPES、胎牛血清(foetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青鏈霉素(penicillin streptomycin)及丙酮酸鈉(sodium pyruvate)購自美國Gibco。乙二醇(ethylene glycol，EG)購自美國Fluka。人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)及孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)購自寧波第三激素制品有限公司。毛喉素(Forskolin)、二乙酸螢光素(FDA)、25 mL·L-1戊二醛(電鏡專用)及尼羅紅購自上海源葉生物科技有限公司?；钚匝鯔z測試劑盒、JC-1膜電位檢測試劑盒、Annexin-V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。豬卵泡液(porcine follicular luid，pFF)由本實驗室自制。其他試劑購自美國Sigma。

1.3 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)與毛喉素處理

自屠宰場采集新鮮豬卵巢，39 ℃保溫，1 h內(nèi)送至實驗室。利用10 mL注射器抽吸卵巢表面2～6 mm卵泡，收集卵泡液，沉淀30 min以上，棄上清，沉淀置于倒置顯微鏡下挑選卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus- oocyte complexes，COCs)，Medium-199洗滌3次，置于成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)44 h，培養(yǎng)條件39 ℃、50 mL·L-1CO2和飽和濕度。成熟培養(yǎng)液(IVM)配方：取1 mL FBS、1 mL pFF、100 μL 1 000 IU·mL-1PMSG、100 μL 1000 IU·mL-1hCG、100 μL雙抗、100 μL 6.9 mg·mL-1L-Cys、10 μL 10 μg·mL-1EGF溶于7.6 mL Medium-199中混勻。培養(yǎng)后的COCs置于1 mL·L-1透明質(zhì)酸酶中反復(fù)吹打，直至顆粒細(xì)胞完全洗脫，Medium-199洗滌3次后備用。參照Prates等[14]研究報道，本研究試驗組為在體外成熟培養(yǎng)液中添加終濃度為10 μmol·L-1的毛喉素。

1.4 冷凍-解凍

卵母細(xì)胞于冷凍平衡液(每10 mL中含0.75 mL EG、0.75 mL DMSO和2 mL FBS，Medium-199定容至10 mL，混勻)中平衡5 min，移入玻璃化冷凍液(每10 mL中含1.36 g蔗糖、1.5 mL DMSO、1.5 mL EG和2 mL FBS，Medium-199定容至10 mL，混勻)，30 s后裝載至Cryotop載桿，立即投入液氮，于液氮下插入冷凍套管中，轉(zhuǎn)移至液氮罐凍存2周。解凍時，將Cryotop細(xì)胞裝載區(qū)提出液氮面并立即置入39 ℃解凍液I(每10 mL中含1.026 g蔗糖，2 mL FBS，Medium-199定容至10 mL，混勻)中，5 min后將卵母細(xì)胞移入解凍液II(每10 mL中含0.513 g蔗糖，2 mL FBS，Medium-199定容至10 mL，混勻)孵育5 min，再移入孵育液(100 mL·L-1FBS的Medium-199溶液)中洗滌3次后孵育2 h，獲得冷凍-解凍卵母細(xì)胞。

1.5 卵丘擴散及卵母細(xì)胞成熟率檢測

經(jīng)成熟培養(yǎng)后，于鏡下檢測卵丘擴散程度。洗脫顆粒細(xì)胞后，觀察卵母細(xì)胞第一極體排出情況，排出第一極體視為卵母細(xì)胞成熟。

1.6 脂滴數(shù)量及面積檢測

卵母細(xì)胞置于含10 μmol·L-1尼羅紅Medium-199中39 ℃孵育15 min，Medium-199洗滌3次，壓片，封片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察卵母細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量及面積(激發(fā)波長410 nm，發(fā)射波長455 nm；掃描時選取卵最大橫截面進行脂滴數(shù)量及面積統(tǒng)計)。

1.7 超微結(jié)構(gòu)觀察

卵母細(xì)胞于25 mL·L-1戊二醛中4 ℃固定2 h，預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次，每次10 min。于10 mL·L-1鋨酸(4 ℃)中固定2 h，4 ℃雙蒸水洗滌2次，每次10 min；乙醇逐級脫水，環(huán)氧丙烷置換2次，每次10 min，再用Epon 812浸透，60 ℃烘箱內(nèi)包埋48 h，切片，枸櫞酸鉛電子染色，自然干燥后于透射電子顯微鏡(HITACHI H-7650)下觀察、拍照。

1.8 線粒體膜電位檢測

利用JC-1檢測試劑盒(碧云天)檢測卵母細(xì)胞的線粒體膜電位(ΔΨm)。卵母細(xì)胞于含2 μmol·L-1JC-1的Medium-199中39 ℃孵育20 min，洗滌3次，壓片，封片。激光掃描共聚焦顯微鏡檢測熒光強度，紅(JC-1聚合物最大激發(fā)波長為585 nm，最大發(fā)射波長為590 nm)/綠(JC-1單體最大激發(fā)波長為514 nm，最大發(fā)射波長為529 nm)熒光強度比值即為ΔΨm。

1.9 活性氧(ROS)水平檢測

利用活性氧(reactive oxygen species，ROS)試劑盒(碧云天)檢測卵母細(xì)胞ROS水平，將卵母細(xì)胞置于含10 μmol·L-1DCFH-DA的Medium-199中，39 ℃孵育20 min，Medium-199洗滌3次后于熒光顯微鏡下拍照，統(tǒng)計熒光強度值。

1.10 細(xì)胞早期凋亡檢測

利用Annexin V細(xì)胞凋亡試劑盒(碧云天)檢測卵母細(xì)胞早期凋亡。將卵母細(xì)胞置于含50～100 μL Annexin V-mCherry的Binding Buffer中室溫避光孵育30 min，孵育結(jié)束后置于冰浴中，Medium-199洗滌3次，熒光顯微鏡觀察，紅色熒光即為發(fā)生早期凋亡的卵母細(xì)胞。

1.11 凍后存活率檢測

利用二乙酸熒光素(Fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)熒光探針檢測卵母細(xì)胞凍后存活率。卵母細(xì)胞于含5 μg·mL-1FDA的Medium-199中39 ℃孵育10 min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡觀察，綠色熒光即為存活的卵母細(xì)胞。

1.12 卵母細(xì)胞凍后胚胎發(fā)育能力檢測

卵母細(xì)胞于電激活液[15]中洗滌3次，移入鋪有電激活液的0.5 mm激活槽中電激活，激活參數(shù)為1.2 kv·cm-1、30 μs，一次脈沖。電激活后，卵母細(xì)胞經(jīng)胚胎培養(yǎng)液(PZM-3)洗滌3次，移入PZM-3中39 ℃、50 mL·L-1CO2飽和濕度下培養(yǎng)，2 d觀察卵裂、5 d觀察桑椹胚、7 d觀察囊胚形成情況。

1.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個試驗至少重復(fù)3次，每個重復(fù)使用30個卵母細(xì)胞。采用Image-Pro Plus 6.0量化熒光值，采用SPSS l7．0 (SPSS Inc，Chicago，IL，USA)對數(shù)據(jù)執(zhí)行單因素方差分析，LSD多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05代表組間差異顯著，P<0.01代表組間差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 毛喉素對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

圖1結(jié)果表明，經(jīng)毛喉素處理后，F(xiàn)resh組和Forskolin組的卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)后卵丘均勻擴散，且在第一極體排出率上差異不顯著(88.00%vs.92.00%,P>0.05)。

2.2 毛喉素促進冷凍豬卵母細(xì)胞脂滴降解

體外成熟卵母細(xì)胞中脂滴熒光定位及統(tǒng)計結(jié)果如圖2所示。與Fresh組相比，成熟培養(yǎng)過程中添加毛喉素極顯著降低了豬卵母細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量(192.34±14.15vs.459.86±25.53,P<0.01)及相對面積(0.62±0.05vs.1.00±0.05,P<0.01)。與Fresh組相比，Vitrified組卵母細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量(245.87±36.72vs.459.86±25.53,P<0.01)和脂滴相對面積(0.50±0.039vs.1.00±0.054)極顯著下降(P<0.01)。Vitrified+Forskolin組的卵母細(xì)胞脂滴數(shù)量(140.07±11.09)和脂滴相對面積(0.33±0.031)均顯著低于Vitrified組(245.87±36.72和0.50±0.039)(P<0.01)。結(jié)果顯示成熟培養(yǎng)過程中添加毛喉素可顯著降低冷凍前后卵母細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。

A.尼羅紅染色熒光影像。尼羅紅染色后卵母細(xì)胞內(nèi)的脂滴可被檢測到紅色熒光，標(biāo)尺=50 μm。B.卵母細(xì)胞脂滴數(shù)量統(tǒng)計學(xué)分析。C.卵母細(xì)胞脂滴相對面積統(tǒng)計學(xué)分析。柱上不同字母代表組間差異極顯著，P<0.01，下同A. Fluorescent images stained with Nile red. Red fluorescence can be detected in lipid droplets in oocytes after Nile red staining, Scale bar=50 μm. B. Statistical analysis of the number of lipid droplets in oocytes. C. Statistical analysis of relative area of lipid droplets in oocytes. Different letters on the column represent extremely significant differences, P<0.01, the same as below圖2 卵母細(xì)胞脂滴數(shù)量與定位Fig.2 Number and location of lipid droplets in oocytes

M. 非均質(zhì)脂滴；N. 均質(zhì)脂滴；黑色箭頭指向線粒體；標(biāo)尺=2 μmM. Heterogeneous lipid droplets; N. Homogeneous lipid droplets; Black arrows point to mitochondria; Scale bar=2 μm圖3 卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察Fig.3 Ultrastructural observation of oocytes

2.3 毛喉素對冷凍豬卵母細(xì)胞脂滴及線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞內(nèi)存在兩種脂滴形態(tài)，分別為非均質(zhì)脂滴和均質(zhì)脂滴，非均質(zhì)脂滴呈球形并伴有許多透亮的線狀條紋。冷凍前，F(xiàn)resh組中非均質(zhì)脂滴的數(shù)量要略高于均質(zhì)脂滴，且非均質(zhì)脂滴的大小比均質(zhì)脂滴大，線粒體均勻分布于胞質(zhì)中，線粒體嵴明顯；經(jīng)毛喉素處理后，卵母細(xì)胞中非均質(zhì)脂滴與均值脂滴的數(shù)量比例則進一步擴大，且比均質(zhì)脂滴更大，線粒體成簇分布在非均質(zhì)脂滴的周圍，線粒體嵴明顯。

卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后，細(xì)胞內(nèi)的非均質(zhì)脂滴明顯增加；與Vitrified組相比，經(jīng)毛喉素處理的冷凍卵母細(xì)胞非均質(zhì)脂滴的比例進一步增加，均質(zhì)脂滴減少甚至是消失，脂滴大小進一步下降。冷凍后的卵母細(xì)胞線粒體模糊或消失，脂滴周圍空泡化程度加劇。

2.4 毛喉素緩和豬卵母細(xì)胞凍后線粒體去極化

卵母細(xì)胞線粒體膜電位檢測結(jié)果見圖4。無論是毛喉素處理卵母細(xì)胞，還是未處理卵母細(xì)胞，冷凍后其線粒體膜電位值均極顯著低于其對應(yīng)的未冷凍卵母細(xì)胞(P<0.01)，說明冷凍會導(dǎo)致卵母細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低；與Vitrified組相比，Vitrified+Forskolin組的線粒體膜電位顯著提高(1.04±0.53vs.0.51±0.03,P<0.01)，說明毛喉素處理可顯著改善凍后卵母細(xì)胞的線粒體功能。

A.卵母細(xì)胞線粒體膜電位檢測。線粒體處于高膜電位時，JC-1聚合物呈紅色熒光；低膜電位時，JC-1單體呈綠色熒光，標(biāo)尺=50 μm。B. 線粒體膜電位結(jié)果統(tǒng)計學(xué)分析A. The determination of oocyte ΔΨm. Red florescence of poly-JC-1 can be monitored when ΔΨm is high, while green florescence of mono-JC-1 is monitored when ΔΨm is low, Scale bar=50 μm. B. Statistical analysis of ΔΨm圖4 卵母細(xì)胞線粒體膜電位檢測Fig.4 Determination of oocyte mitochondrial membrane potential

2.5 毛喉素減輕豬卵母細(xì)胞凍后氧化應(yīng)激

卵母細(xì)胞活性氧檢測結(jié)果見圖5。無論是毛喉素處理卵母細(xì)胞，還是未處理卵母細(xì)胞，冷凍后卵母細(xì)胞的ROS熒光強度值均極顯著高于未冷凍組(P<0.01)，表明玻璃化冷凍加劇了卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激。與Vitrified組相比，在成熟培養(yǎng)液中添加毛喉素極顯著降低了凍后卵母細(xì)胞ROS水平(11.57±0.58vs.22.77±2.23,P<0.01)。表明成熟培養(yǎng)期間添加毛喉素能減緩冷凍對卵母細(xì)胞造成的氧化應(yīng)激。

A. DCFH-DA染色熒光影像。DCFH-DA染色后，含有ROS的卵母細(xì)胞可被檢測到綠色熒光，標(biāo)尺=100 μm。B. 卵母細(xì)胞活性氧水平統(tǒng)計學(xué)分析A. Images of DCFH-DA staining. After stained by DCFH-DA, oocytes containing ROS can be monitored in green florescence, Scale bar=100 μm. B. Statistical analysis of oocyte ROS level圖5 卵母細(xì)胞活性氧檢測Fig.5 Determination of ROS level in oocytes

2.6 毛喉素抑制冷凍豬卵母細(xì)胞早期凋亡

卵母細(xì)胞早期凋亡檢測結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，成熟培養(yǎng)過程中添加毛喉素對成熟卵母細(xì)胞早期凋亡率指標(biāo)沒有顯著影響(6.00%vs.5.57%,P>0.05)；經(jīng)玻璃化冷凍后，Vitrified組和Vitrified+Forskolin組的早期凋亡比例與未冷凍組相比均極顯著上升(P<0.01)，表明冷凍極易引起凍后卵母細(xì)胞凋亡。與Vitrified組相比，成熟培養(yǎng)過程中添加毛喉素可極顯著抑制卵母細(xì)胞冷凍后的早期凋亡率(68.30%vs.86.03%,P<0.01)。結(jié)果表明，添加毛喉素可顯著降低冷凍引起的卵母細(xì)胞早期凋亡。

A. Annexin-V染色熒光影像。Annexin-V染色后，出現(xiàn)早期凋亡的卵母細(xì)胞可被檢測到紅色熒光，標(biāo)尺=100 μm。B. 卵母細(xì)胞早期凋亡統(tǒng)計學(xué)分析A. Images of Annexin-V staining. After stained by Annexin-V, early apoptotic oocytes can be monitored in red florescence, Scale bar=100 μm. B. Statistical analysis of oocyte early apoptosis rates圖6 卵母細(xì)胞早期凋亡檢測Fig.6 Determination of oocyte early apoptosis

2.7 毛喉素提高豬卵母細(xì)胞冷凍存活率

卵母細(xì)胞存活率檢測結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示，新鮮卵母細(xì)胞中毛喉素處理對卵母細(xì)胞的凍前存活率(98.67%vs.95.90%)無顯著影響(P>0.05)。經(jīng)玻璃化冷凍后，毛喉素處理組的凍后存活率由51.47%提高至71.17%(P<0.01)。表明冷凍會導(dǎo)致卵母細(xì)胞死亡率升高，在成熟培養(yǎng)期間添加毛喉素能上調(diào)冷凍后卵母細(xì)胞的存活率。

A. FDA染色熒光影像。FDA染色后，具有細(xì)胞活性的卵母細(xì)胞可被檢測到綠色熒光，標(biāo)尺=100 μm。B. 卵母細(xì)胞存活率統(tǒng)計學(xué)分析A. Images of FDA staining. After FDA staining, green fluorescence can be detected in living oocytes, Scale bar=100 μm. B. Statistical analysis of oocyte viability圖7 卵母細(xì)胞存活率檢測Fig.7 Determination of oocyte viability

2.8 毛喉素提高豬卵母細(xì)胞冷凍體外發(fā)育能力

卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力檢測結(jié)果見圖8及表1。結(jié)果顯示，新鮮卵母細(xì)胞中毛喉素處理對卵母細(xì)胞的凍前孤雌激活卵裂率(91.37% vs. 86.13%)無顯著影響(P>0.05)，而在桑椹胚率(62.21% vs. 53.19%)和囊胚率(19.57% vs. 5.05%)上差異顯著(P<0.05)。經(jīng)玻璃化冷凍后，毛喉素處理組的凍后孤雌激活卵裂率由8.23%提高至16.63%(P<0.05)，毛喉素處理組的凍后孤雌激活桑椹胚率和囊胚率差異性不顯著，但有升高的趨勢。表明在成熟培養(yǎng)期間添加毛喉素能上調(diào)冷凍后卵母細(xì)胞的孤雌激活卵裂及凍前桑椹胚率和囊胚率。

A. 2 d卵裂圖，標(biāo)尺=100 μm。B. 5 d桑椹胚圖，標(biāo)尺=50 μm。C. 7 d囊胚圖，標(biāo)尺=100 μmA. Image of cleavage at 2 d, Scale bar=100 μm. B. Image of morula at 5 d, Scale bar=50 μm. C. Image of blastocyst at 7 d, Scale bar=100 μm圖8 卵母細(xì)胞發(fā)育能力檢測Fig.8 Detection of oocyte development ability

表1 卵母細(xì)胞發(fā)育能力檢測Table 1 Detection of oocyte development ability %

3 討 論

豬卵母細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量過高，一直被認(rèn)為是制約豬卵母細(xì)胞冷凍效率提高的重要原因。盡管目前冷凍豬卵母細(xì)胞復(fù)原后可獲得存活后代[4-5]，但尚不足以推廣應(yīng)用。降脂或去脂已成為提高豬卵母細(xì)胞冷凍效率的一個重要途徑。毛喉素是一種自毛喉鞘蕊花中分離得到的天然降脂物質(zhì)，具有促進脂質(zhì)分解、調(diào)節(jié)細(xì)胞生理進程與新陳代謝的作用。因此推斷，在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)過程中添加降脂劑毛喉素可降低卵母細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量。Prates等[14]研究證實，在體外成熟過程中毛喉素可通過改變脂滴的分布與形態(tài)，降低豬卵母細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。本研究通過在豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過程中添加10 μmol·L-1毛喉素，極顯著降低了成熟卵母細(xì)胞中的脂滴數(shù)量、大小和面積，降脂效果明顯，該結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，再次證實了毛喉素可有效降低豬卵母細(xì)胞中的脂肪含量。

毛喉素降脂處理是否會影響卵母細(xì)胞成熟和體外發(fā)育也是本研究關(guān)注的重點。毛喉素是一種引起cAMP升高的腺苷酸環(huán)化酶的激動劑，傅國棟等[16]研究發(fā)現(xiàn)，成熟前毛喉素短期預(yù)處理時能夠刺激豬卵母細(xì)胞體外成熟，且這種作用是與卵丘細(xì)胞的存在有關(guān)。本研究顯示，成熟過程中全程添加毛喉素可部分提高豬卵母細(xì)胞成熟率、線粒體膜電位和體外發(fā)育能力、降低氧化應(yīng)激和早期凋亡率水平，但均與未添加組無顯著差異(P>0.05)。兩者的研究均證實毛喉素不影響GV期卵母細(xì)胞向MII期過渡和成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量，說明成熟培養(yǎng)期間添加毛喉素調(diào)節(jié)脂質(zhì)含量是安全可行的。

由于體積較大，在玻璃化冷凍過程中，豬卵母細(xì)胞不可避免地會受到高濃度冷凍保護劑的滲透壓和毒性損傷，同時冷凍和解凍過程中溫度的劇烈變化，還會導(dǎo)致卵母細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)變化。研究表明，豬卵母細(xì)胞中的脂肪酸含量遠(yuǎn)高于牛、羊等，且這種高的脂肪酸含量主要歸之于豐富的甘油三磷脂儲量，且其他不飽和脂肪酸儲量的種屬特異性差異可成為比較豬和反芻動物(牛、羊)卵母細(xì)胞冷凍敏感性的基礎(chǔ)[17]。Isachenko等[18]報道，豬卵母細(xì)胞內(nèi)含有均質(zhì)性和非均質(zhì)性兩種形態(tài)的脂滴，且均質(zhì)性脂滴可在低溫條件下轉(zhuǎn)化為非均質(zhì)性脂滴。本研究發(fā)現(xiàn)，脂滴在一定條件下會轉(zhuǎn)化為卵母細(xì)胞在冷凍-解凍過程所需的能量，對維持卵母細(xì)胞生物學(xué)功能有一定作用。在此過程中大脂滴會被消耗及分解成小脂滴，小脂滴又會被消耗，是最終造成脂滴數(shù)量減少和脂滴相對面積降低的主要原因。同時在冷凍-解凍時細(xì)胞內(nèi)的均質(zhì)脂滴部分轉(zhuǎn)化為非均質(zhì)脂滴，還有部分脂滴發(fā)生溶解，導(dǎo)致玻璃化冷凍后超微結(jié)構(gòu)內(nèi)的空泡化加劇，進而造成玻璃化冷凍后豬卵母細(xì)胞內(nèi)的非均質(zhì)脂滴數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于凍前的均質(zhì)脂滴和非均質(zhì)脂滴。該結(jié)果與薛夢琦等[19]、武彩紅等[20]、王勇杰等[21]在豬冷凍卵母細(xì)胞上的研究結(jié)果相似。本研究超微結(jié)構(gòu)觀察也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)毛喉素處理后，無論是新鮮還是冷凍卵母細(xì)胞，非均質(zhì)脂滴所占比例均進一步提高，提示這種脂滴成分的變化可能是毛喉素提高豬卵母細(xì)胞抗凍能力的重要因素之一。

細(xì)胞內(nèi)線粒體作為最重要的細(xì)胞器之一，與胞內(nèi)能量供應(yīng)、細(xì)胞呼吸、氧的代謝等有著十分密切的關(guān)系，凍后線粒體損傷將引起細(xì)胞氧化損傷、凋亡和發(fā)育能力下降[22]。本研究還發(fā)現(xiàn)，冷凍后出現(xiàn)部分線粒體固縮、線粒體嵴模糊或消失等現(xiàn)象，這與眾多研究結(jié)果一致[23-24]，同時，線粒體在凋亡信號的誘導(dǎo)下，發(fā)生膜電位的降低，隨之線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放[25]。本研究也證實，玻璃化冷凍后的線粒體膜電位顯著降低；與此同時，與冷凍卵母細(xì)胞相比，在體外成熟培養(yǎng)期間添加毛喉素處理可極顯著上調(diào)冷凍卵母細(xì)胞線粒體膜電位。可能的原因是卵母細(xì)胞在冷凍前的去脂處理，導(dǎo)致冷凍時水分置換更充分，冰晶形成減少，減輕了線粒體受到的機械性損傷，證實了毛喉素能在一定程度上維持冷凍后線粒體穩(wěn)態(tài)，保證了線粒體功能正常。ROS主要由線粒體合成并釋放。冷凍引起的線粒體去極化通過改變卵母細(xì)胞中幾種氧化還原途徑而導(dǎo)致ROS的生成增加[26]，本研究也證實了卵母細(xì)胞冷凍時線粒體發(fā)生去極化使這期間胞內(nèi)平衡失調(diào)，導(dǎo)致正常的線粒體功能受到破壞，線粒體過量釋放的活性氧造成卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞早期凋亡的現(xiàn)象是磷酯酰絲氨酸外翻，正常情況下其分布于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，本研究中卵母細(xì)胞冷凍后顯著性地誘導(dǎo)早期凋亡，出現(xiàn)了大量磷酯酰絲氨酸外翻現(xiàn)象；與冷凍卵母細(xì)胞相比，成熟培養(yǎng)期毛喉素處理極顯著的抑制凍后卵母細(xì)胞早期凋亡。凋亡是引起細(xì)胞程序性死亡的主要途徑之一，被認(rèn)為是冷凍保存失敗，冷凍效率低下的直接原因[27-28]。毛喉素通過保護線粒體穩(wěn)態(tài)、防止氧化應(yīng)激，有效減輕了凍后早期凋亡的發(fā)生，這可能是毛喉素提升冷凍效率的關(guān)鍵原因。

本研究證實了通過非侵入式降脂法(降脂劑毛喉素)可有效降低豬卵母細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量，改善了因冷凍保護劑對水分的不充分置換引起的凍后線粒體機械性損傷，降低了氧化應(yīng)激與凋亡的發(fā)生，從而顯著提升冷凍效率。本研究為化學(xué)降脂劑毛喉素在豬卵母細(xì)胞冷凍中的應(yīng)用提供了理論和現(xiàn)實依據(jù)。

4 結(jié) 論

4.1豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)期間添加毛喉素可降低其胞內(nèi)脂質(zhì)含量。

4.2體外成熟培養(yǎng)期間添加毛喉素可減輕冷凍卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激與早期凋亡。

4.3體外成熟培養(yǎng)期間添加毛喉素可提升冷凍卵母細(xì)胞的存活率和發(fā)育潛能。