關(guān)詩宇，谷興亮，沈宏旭，馬玉敏，程 雷，曲 磊，秦立紅,*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院（中國農(nóng)業(yè)科技東北創(chuàng)新中心），吉林 長春 130033；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；3.洮南市畜牧總站，吉林 白城 137100）

肌纖維組織學(xué)的特性決定肉用品質(zhì)的好壞，肌肉由肌纖維組成，也是骨骼肌的基本單位。隨著生活水平與質(zhì)量的不斷提高，人們的肉品質(zhì)選擇標(biāo)準(zhǔn)也不斷升高，因此掌握優(yōu)良肉牛品種的不同肉質(zhì)性狀是肉牛養(yǎng)殖應(yīng)當(dāng)解決的問題。研究表明，肌纖維半徑與橫截面積可以影響肌肉生長和肉質(zhì)的優(yōu)劣[1]。肌外膜、肌內(nèi)膜和肌束膜共同構(gòu)成肌內(nèi)結(jié)締組織。在肌肉的外圍被肌外膜所覆蓋；每個相鄰的肌肉纖維間由肌內(nèi)膜相連，形成肌束[2]；肌束膜緊緊將相鄰的不同肌束連接到一起。肌外膜在屠宰分割的過程中已經(jīng)剔除[3]，對肌纖維組織學(xué)特性的研究沒有影響。肌內(nèi)膜與肌束膜為緊緊包裹在肌纖維與肌束外的一層結(jié)締組織，對肌肉的嫩度有一定影響[4]。蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法依據(jù)蘇木素染色液可以將細胞核染成淡藍色，酸性的伊紅溶液能夠?qū)麧{呈現(xiàn)為紅色，從組織水平對肌肉組織纖維特性及形態(tài)學(xué)差異進行研究，最直觀反映肌肉組織結(jié)構(gòu)與功能變化規(guī)律，進而達到觀察肌肉組織的目的[5]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化還原酶（nicotinamide adenine dinucleotide tetrazolium oxidoreductase，NADH-TR）組織化學(xué)染色法是區(qū)分肌肉中不同肌纖維類型的主要方法之一[6]。肌肉由不同類型的肌纖維組成，依據(jù)肌纖維生理生化、形態(tài)學(xué)特征及組織化學(xué)的反應(yīng)，通過NADH-TR染色將肌肉纖維分為Ⅰ型慢收縮氧化型、ⅡA型和ⅡB型快收縮氧化型肌纖維。中國草原紅牛是經(jīng)本地牛與英國短角牛雜交培育而成的乳肉兼用的新品種[7]，主要分布于吉林省西部和內(nèi)蒙古等地區(qū)，具有耐粗飼、抗寒、抗逆性強、肉質(zhì)好等特性。

關(guān)于肌纖維組織學(xué)特性，在雞、豬、鵝、羊等家畜中研究較為廣泛[8-12]。萬磊等[13]研究發(fā)現(xiàn)，寧都黃雞不同部位肌內(nèi)膜與肌束膜厚度存在差異。侯小偉[14]比較不同地區(qū)的烏珠穆沁羊，發(fā)現(xiàn)不同部位間的肌束膜與肌內(nèi)膜的結(jié)締組織存在差異。關(guān)于牛的肌纖維組織學(xué)特性也有報道研究。王金泉等[15]對新疆褐牛與土黃牛間不同部位肌纖維面積進行比較分析，結(jié)果顯示，不同品種牛間相同部位肌纖維橫截面積存在差異。桂干北等[16]對去勢公牛的不同部位肉品質(zhì)進行比較，結(jié)果顯示，去勢公牛不同部位的肌肉理化特性存在顯著差異。Morgan等[17]對牛14 個不同部位的肌束膜與嫩度進行比較，結(jié)果顯示，肌束膜厚度與肉品質(zhì)嫩度呈現(xiàn)負相關(guān)。Brooks等[18]分割牛不同部位，比較肌束膜與嫩度發(fā)現(xiàn)，肌束膜厚度與牛肉嫩度之間有一定的相關(guān)性，且分割宰后成熟過程中肌束膜的變化也各有不同。

本研究通過對中國草原紅牛的肌纖維組織進行HE和NADH-TR染色，進而對不同部位間肌肉組織學(xué)特性和肌纖維類型組成的占比進行比較分析，旨在探究草原紅牛肌肉發(fā)育進程中的組織學(xué)差異，為培育肉質(zhì)品質(zhì)優(yōu)良的肉牛品種提供依據(jù)，同時也可以為滿足消費者對不同品質(zhì)牛肉的需求提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取日齡、體質(zhì)量及飼養(yǎng)環(huán)境均一致的中國草原紅牛6 頭，在相同時間內(nèi)進行統(tǒng)一屠宰，嚴(yán)格參照GB/T 19477ü2004《牛屠宰操作規(guī)程》屠宰操作規(guī)范進行屠宰。

二甲苯 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇成都博瑞特化學(xué)技術(shù)有限公司；曙紅Y（醇溶） 上海生工有限公司；蘇木素、抗熒光衰減封片劑 北京索萊寶科技有限公司；NADH、氯化硝基四氮唑藍 美國Sigma公司；OTC冷凍包埋劑 日本Sakura公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DW-86L80 -80 ℃超低溫冰箱 浙江捷盛公司；BCD-170WLDPC冰箱（-20 ℃） 海爾公司；Histo Core MULTICUT石蠟切片機、Histo Core Arcadia H組織包埋機、CM1950冷凍切片機 德國Leica公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GG-43普通培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌肉樣本采集

統(tǒng)一屠宰后，迅速采集西冷、大條、米龍、上腦、小條及牛腩不同部位肌肉組織樣本各500 g，采取液氮保存運送方法，快速運送至實驗室，-80 ℃冰箱中進行長期保存。

1.3.2 切片制備與HE染色

從采集的液氮保存肌肉樣本上沿肌纖維紋路分割成約為1 cmh1 cmh1 cm 的冷凍肌肉組織樣品。將處理好的樣品在多聚甲醛溶液中固定24 h；依據(jù)常規(guī)方法[19]操作進行冰凍切片包埋、切片脫蠟至水；隨后進行HE染色，染色后對切片進行脫水、透明、封片處理，等待玻片室溫晾干后，在玻片掃描影像系統(tǒng)中進行掃描觀察。

1.3.3 冰凍切片與NADH-TR染色

將采集到的冷凍肌肉組織樣本切割修整為約1 cmh1 cmh1 cm的組織樣本。將不同部位組織樣本放入液氮中速冷處理，用甲醛溶液固定，同時進行NADH-TR染色[20]；封片，室溫晾干后放置于全景掃描影像系統(tǒng)中全片掃描。

1.3.4 切片的觀察和數(shù)據(jù)測量

將HE與NADH-TR染色晾干的玻片放置于全景掃描影像系統(tǒng)中進行全片掃描。同時在HE染色不同部位肌肉樣品切片中各隨機挑選30 個肌纖維橫截面積，用Image J軟件進行肌纖維橫截面積的測量；通過Image Viewer G軟件在100×視野下隨機挑選不同部位各30 個相鄰肌束間測量肌束膜厚度，隨機挑選測量30 個肌束內(nèi)相鄰的肌纖維間的距離。NADH-TR染色組織切片在相同視野（100×）下，通過Image pro plus軟件進行不同肌纖維類型的計數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Excel進行不同肌纖維類型的占比統(tǒng)計；利用SPSS 20.0軟件對所得實驗數(shù)據(jù)平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 草原紅牛不同部位肌纖維HE染色切片

圖1所示，經(jīng)HE染色后的肌肉切片呈現(xiàn)淡藍色、紅色或無色，淡藍色為肌肉纖維細胞核，同時可以清晰看見肌纖維間交錯分布的肌內(nèi)膜和存在于肌束間寬闊縱橫的肌束膜。肌內(nèi)膜為包裹在肌纖維外的一層結(jié)締組織，肌內(nèi)膜厚度為2 個相鄰肌纖維間結(jié)締組織的厚度。一個肌束由幾十條肌纖維聚集成束形成肌束，肌束膜則是包裹在肌束外的一層結(jié)締組織。

圖1 不同部位肌纖維HE染色切片（×100）Fig. 1 HE staining images of muscle fibers from different parts (× 100)

2.2 草原紅牛不同部位肌肉NADH-TR染色切片

由圖2可知，肌肉切片經(jīng)過NADH-TR染色后呈現(xiàn)出顏色深淺不一，Ⅰ型肌纖維染色為深藍色，ⅡB型肌纖維染色為淡藍發(fā)白灰色，介于2 種顏色之間的為ⅡA型肌纖維。由于不同部位肌肉肌纖維特性差異，染色后的肌肉切片中不同類型肌纖維交錯分布，不同部位間肌纖維占比也各有不同。

圖2 不同部位肌纖維NADH-TR染色切片（×100）Fig. 2 NADH-TR staining images of muscle fibers from different parts (× 100)

2.3 草原紅牛不同部位肌纖維組織學(xué)特性

由表1可知，上腦部位平均肌纖維直徑與橫截面積分別為75.41 μm和4 570.35 μm2，但與其他部位差異不顯著；米龍部位平均肌纖維直徑與橫截面積均小于其他部位。草原紅牛不同部位肌肉樣本肌纖維直徑與橫截面積均差異不顯著。牛腩部位肌束膜厚度平均為109.03 μm，極顯著高于其他部位（P＜0.01）；西冷部位肌束膜厚度平均為25.99 μm，極顯著低于其他部位（P＜0.01）；大條部位平均肌束膜厚度為64.64 μm，與米龍、上腦、小條相比差異極顯著（P＜0.01）。米龍、上腦、小條部位間的肌束膜厚度差異不顯著。西冷部位肌內(nèi)膜厚度為5.49 μm，極顯著低于米龍、上腦、小條和牛腩部位肌內(nèi)膜厚度（P＜0.01）；大條部位肌內(nèi)膜厚度與西冷部位相比差異不顯著，大條部位與米龍、上腦、牛腩部位相比差異顯著（P＜0.05）；米龍、上腦、牛腩相比差異不顯著，米龍與小條部位肌內(nèi)膜厚度相比差異極顯著（P＜0.01）；上腦部位肌內(nèi)膜厚度平均為13.47 μm，與小條部位相比差異極顯著（P＜0.01）。

2.4 草原紅牛不同部位肌纖維類型組成占比

由表2可知，不同部位的肌纖維類型組成占比有所不同。對于Ⅰ型肌纖維，西冷部位占比為48.29%，極顯著高于大條、米龍、上腦、牛腩部位（P＜0.01）；牛腩部位占比為22.39%，極顯著低于其他所測5 個部位（P＜0.01）；大條與米龍、上腦相比Ⅰ型肌纖維占比差異顯著（P＜0.05）；小條部位Ⅰ型肌纖維占比為43.09%，顯著高于米龍、上腦（P＜0.05）；米龍部位與上腦部位間Ⅰ型肌纖維占比無明顯差異。對于ⅡA型肌纖維，草原紅牛的不同部位間無明顯差異。對于ⅡB型肌纖維，牛腩部位占比為49.92%，極顯著高于其他部位（P＜0.01）；米龍部位ⅡB型肌纖維占比為35.93%，與大條、上腦部位相比差異極顯著（P＜0.01），與小條部位無明顯差異；西冷部位ⅡB型肌纖維占比為30.21%，極顯著低于其他部位（P＜0.01）；大條部位與上腦部位間差異顯著（P＜0.05）。

表2 不同部位肌纖維組織類型組成占比Table 2 Proportion of muscle fiber types in different parts %

3 討 論

3.1 肌纖維直經(jīng)與橫截面積

肌纖維直徑與橫截面積為肌肉組織學(xué)特性的一部分。肌纖維直徑的大小可以影響肉質(zhì)性狀[21]，在本研究中二者均無明顯差異，且不同部位間差異不顯著，但與陳玲等[22]的研究結(jié)果有所不同，這可能是由于牛品種不同的原因。Solomon等[23]的研究顯示，通過對豬、牛、羊等動物的日糧進行限制飼喂可以對肌纖維直徑的減小產(chǎn)生影響。本研究測得的草原紅牛肌纖維平均直徑為69.8 μm，這與陳俐靜等[24]所測得的安格斯牛的肌纖維直徑32.86 μm、新疆褐牛肌纖維直徑41.52 μm相比要大。說明草原紅牛的肌纖維嫩度較低，在育種改良上可以著重改進草原紅牛的嫩度。肌纖維直徑與橫截面積的不同可能與性別因素有關(guān)，歐秀瓊等[25]的研究證明，在不同性別的長榮豬之間，母豬的肌纖維面積在前期的生長發(fā)育過程中要大于同一時期的公豬，但在生長后期，公豬的肌纖維橫截面積、直徑則要遠超同一時期的母豬。不同品種、性別及營養(yǎng)水平均會造成肌纖維直徑與橫截面積的差異，本研究雖無明顯差異，但也為草原紅牛的肉質(zhì)改進提供了依據(jù)。

3.2 肌纖維結(jié)締組織

肌纖維結(jié)締組織包括肌外膜、肌內(nèi)膜和肌束膜，肌外膜通常在屠宰時剔除，因此不考慮。肌內(nèi)膜包裹肌纖維，肌束膜包裹由幾十個肌纖維聚集而成的肌束，肌內(nèi)膜為細微波狀膠原纖維構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，肌束膜則為粗高波狀膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[13]。肌內(nèi)膜在肌肉樣本中為網(wǎng)狀，分布于肌肉纖維間，影響肌肉嫩度[26]。而肌纖維橫截面積的變化也與結(jié)締組織的生長有關(guān)。本研究中，牛腩肌束膜厚度極顯著高于其他部位，而西冷部位極顯著低于其他部位，可能與不同部位嫩度不同有關(guān)[27]。嫩度與肌肉結(jié)締組織的厚度呈現(xiàn)負相關(guān)，且在宰后成熟過程中隨著時間的延長結(jié)締組織會逐漸降解，導(dǎo)致呈現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的肌束膜與肌內(nèi)膜逐漸被破壞，改變肌肉品質(zhì)的嫩度[28-29]。在本研究中，牛腩肌束膜厚度高于其他部位，說明牛腩部位的嫩度比較低，肌纖維橫截面積與嫩度呈現(xiàn)負相關(guān)，則牛腩部位肌纖維橫截面積較大。西冷部位肌內(nèi)膜厚度小于其他部位，說明草原紅牛的西冷部位嫩度較高。

3.3 肌纖維類型組成占比

通過NADH-TR染色，將肌肉纖維分為Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型，由于草原紅牛在運動過程中不同部位的肌肉發(fā)揮不同的作用，來滿足動物機體不同的生理功能，這也直接影響不同肌肉中肌纖維的組成占比。在本研究中，草原紅牛不同部位間的Ⅰ型肌纖維占比由大到小依次為：西冷、小條、米龍、上腦、大條、牛腩；而ⅡB型肌纖維占比由大到小依次為：牛腩、上腦、大條、小條、米龍、西冷；Hwang等[30]的研究表明，韓牛肌肉的ⅡB型肌纖維比例與剪切力呈正相關(guān)，Ⅰ型肌纖維占比與剪切力呈負相關(guān)；在本研究中，西冷部位Ⅰ型肌纖維占比最大，牛腩部位最小，與剪切力呈負相關(guān)，則西冷部位剪切力與其他所測部位相比較小；肌肉的嫩度可以通過剪切力來判定，剪切力與嫩度呈負相關(guān)，因此西冷部位嫩度較高。但在Joo等[31]的研究中發(fā)現(xiàn)，肌纖維類型的組成比例與肉質(zhì)的嫩度關(guān)系較為復(fù)雜，在形成過程中，肌纖維類型受運動方式和強度大小等多種因素的影響。

4 結(jié) 論

本研究對中國草原紅牛的不同部位肌肉纖維分別進行HE染色與NADH-TR染色，對染色后肌肉切片的結(jié)締組織厚度、肌纖維橫截面積及直徑，以及肌纖維類型組成占比進行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明：中國草原紅牛不同部位肌纖維直徑與橫截面積間差異不顯著，但不同部位間結(jié)締組織厚度卻有明顯差異，牛腩部位肌束膜厚度顯著高于其他部位，說明牛腩部位肌肉纖維嫩度也較低，西冷部位肌纖維結(jié)締組織厚度低于其他部位，說明西冷肌纖維嫩度較高。大條、米龍和小條部位肌束膜與肌內(nèi)膜無明顯差異。西冷部位Ⅰ型肌纖維占比最大，牛腩部位占比最小，ⅡB型肌纖維占比則是牛腩部位最大，西冷部位占比最小，ⅡA型肌纖維各部位間無明顯差異。通過對中國草原紅牛不同部位肌纖維組織學(xué)特性的分析，為草原紅牛的培育和肌肉改良提供參考依據(jù)。