陳洪良 施 健 婁雪瑩 俞 瑩

糖尿病是由胰島素分泌不足或胰島素抵抗等原因引起的全身慢性代謝性疾病,在代謝性疾病中有非常重要的地位。由高血糖引起的糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病微血管病變最主要的表現(xiàn)之一[1]。DR晚期出現(xiàn)的視網(wǎng)膜新生血管可能會(huì)引起玻璃體積血、牽拉性視網(wǎng)膜脫離等嚴(yán)重并發(fā)癥,是發(fā)達(dá)國家人群致盲的主要原因,其發(fā)病機(jī)制尚不明確[2-3]。研究表明,DR與天然免疫系統(tǒng)激活下的慢性低度炎癥狀態(tài)密不可分[4-6]。中性粒細(xì)胞作為人體內(nèi)數(shù)量最多的白細(xì)胞,構(gòu)成了機(jī)體對(duì)抗微生物病原體的第一道防線。中性粒細(xì)胞胞外陷阱(NETs)是一種最新發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞殺菌機(jī)制,在血管損傷、創(chuàng)傷愈合、腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展、腎盂腎炎中均發(fā)揮重要作用,同時(shí)也積極地參與了DR的發(fā)生發(fā)展過程[7]。因此,本文就NETs形成及其在DR中作用的研究進(jìn)展做一綜述。

1 NETs的形成

在健康成人中,中性粒細(xì)胞是體內(nèi)數(shù)量最多的白細(xì)胞類型,占循環(huán)白細(xì)胞的50.0%～70.0%,同時(shí)也是最常見的非特異性免疫反應(yīng)的中心細(xì)胞[8-9]。中性粒細(xì)胞殺菌的機(jī)制除了最經(jīng)典的吞噬作用外,還存在一種自殺性的襲擊方式,這就是最新被發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞網(wǎng)捕死亡(NETosis),也稱為可溶性或自殺性NETosis。這種程序性細(xì)胞死亡始于表面受體的激活,該程序會(huì)在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成,并執(zhí)行4項(xiàng)關(guān)鍵任務(wù),包括細(xì)胞質(zhì)膜的滲透,細(xì)胞骨架和細(xì)胞核包膜的分解,染色質(zhì)的解致密化以及抗菌蛋白在染色質(zhì)支架上的組裝,最終形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稱為NETs[10]。這種新型的死亡方式不同于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死,沒有細(xì)胞凋亡后磷脂酰絲氨酸途徑及凋亡信號(hào),也沒有細(xì)胞壞死后肌動(dòng)蛋白、微觀蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白[11]。高分辨率掃描電子顯微鏡顯示,NETs由直徑為15～17 nm的光滑細(xì)絲堆疊組成的,在這個(gè)細(xì)絲骨架上布滿了直徑約為50 nm,由20多種顆粒蛋白組成的球狀結(jié)構(gòu)域,如肽基精氨酸脫亞胺酶4(PAD4)、中性粒細(xì)胞彈性酶(NE)、組織蛋白酶G、瓜氨酸化組蛋白3(Cit-H3)、蛋白酶3(PR3)、髓過氧化物酶(MPO)等[12]。PAD4能夠催化中性粒細(xì)胞組蛋白瓜氨酸化,誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞染色質(zhì)解凝并釋放到細(xì)胞外捕獲病原體。NETosis過程開始后,NE向細(xì)胞核遷移并且破壞組蛋白。由于MPO可直接導(dǎo)致中性粒細(xì)胞DNA與組蛋白解離[13],所以,這一過程可能受到MPO的影響而減弱[14]。MPO和NE共同促進(jìn)活性氧(ROS)進(jìn)入線粒體,介導(dǎo)線粒體功能障礙,加速ROS形成,誘導(dǎo)NETs的形成[15]。

除了這種自殺性NETosis,還存在一種生存性NETosis,與自殺性NETosis不同的是,染色質(zhì)解致密化后會(huì)通過小泡排出,而中性粒細(xì)胞由于吞噬等其他功能而存活,在產(chǎn)生NETs后仍能繼續(xù)起到吞噬細(xì)胞的作用[16]。

2 NETs的機(jī)制

NETosis的發(fā)生依賴于多種細(xì)胞外刺激,其中包括病原體、自身抗體、細(xì)胞因子、免疫復(fù)合物、有絲分裂原、激素、氧化應(yīng)激成分、熱休克蛋白等[17]。NETs作用機(jī)制的不同很大程度上取決于刺激的類型。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶介導(dǎo)的ROS通路是NETs發(fā)生的經(jīng)典核心機(jī)制。PAD4、鈣離子載體(A23187)、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌或B組鏈球菌刺激中性粒細(xì)胞時(shí),NADPH氧化酶復(fù)合物釋放兩個(gè)電子并轉(zhuǎn)移到O2,形成超氧陰離子O2-,它可以自發(fā)或被超氧化物歧化酶(SOD)催化轉(zhuǎn)化成過氧化氫(H2O2),H2O2又被MPO轉(zhuǎn)化為次氯酸[18],ROS(O2-、H2O2、OH-等)在刺激后20 min 內(nèi)會(huì)快速增加,使中性粒細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,進(jìn)一步引起線粒體功能障礙和大量細(xì)胞核空泡化,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)解凝和細(xì)胞質(zhì)膜破裂,最終排出細(xì)胞外形成NETs來捕獲相應(yīng)的病原體[19]。Arai等[20]利用尿酸促進(jìn)中性粒細(xì)胞內(nèi)ROS的轉(zhuǎn)化清除,結(jié)果發(fā)現(xiàn),低濃度尿酸能抑制NADPH氧化酶的活性,減少NETs的產(chǎn)生,而尿酸濃度增高時(shí)會(huì)通過核因子κB(NF-κB)這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)NETs的產(chǎn)生。

Fuchs等[11]利用葡萄糖氧化酶產(chǎn)生的H2O2刺激中性粒細(xì)胞來模擬NADPH氧化酶下游的激活。中性粒細(xì)胞被刺激90 min后可檢測(cè)到DNA的釋放,NE和DNA-組蛋白復(fù)合物表達(dá)增加,這表明,在沒有NADPH氧化酶參與下同樣可以產(chǎn)生NETs。慢性肉芽腫患者體內(nèi)攜帶NADPH氧化酶突變基因,因此,不能激活NADPH氧化酶。分離培養(yǎng)慢性肉芽腫患者血清中的中性粒細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),無論是被細(xì)菌還是佛波12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)刺激(即刺激NADPH氧化酶的上游)均不能生成NETs,但當(dāng)這些中性粒細(xì)胞受到H2O2刺激時(shí),也就是刺激NADPH氧化酶下游,則會(huì)產(chǎn)生NETs[21]。因此,即使在 NADPH 氧化酶被抑制或缺乏的情況下利用H2O2刺激也可以產(chǎn)生NETs。根據(jù)NETs形成過程中對(duì)ROS的需求表明,ROS在NETosis中作為第二信使,激活NADPH氧化酶及下游信號(hào),最終導(dǎo)致NETs形成[22]。

另一種類型的NETosis是不依賴NADPH氧化酶所產(chǎn)生的ROS,而是通過電壓依賴的鈣通道開放,進(jìn)而激活小電導(dǎo)鈣激活鉀(SK)分子的SK3通道,這種類型與SK3通道的開放密切相關(guān),SK3可以直接控制NETs的形成[23],該研究也證實(shí)了中性粒細(xì)胞可以在不激活NADPH氧化酶復(fù)合物的前提下形成NETs。

3 NETs在糖尿病中的作用

高血糖會(huì)刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物和多種細(xì)胞因子,有利于NETosis的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),糖尿病患者血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平升高,刺激中性粒細(xì)胞形成NETs,并釋放細(xì)胞內(nèi)的中性粒細(xì)胞絲氨酸蛋白酶,包括NE和PR3,因此,在1型糖尿病患者的血清中能夠檢測(cè)到NE和PR3的水平和酶活性均有所升高[24]。升高的NE和PR3能夠募集中性粒細(xì)胞至炎癥部位,形成負(fù)反饋調(diào)節(jié),加重自身免疫性糖尿病,因此,在1型糖尿病患者中會(huì)出現(xiàn)中性粒細(xì)胞減少,而NETs的增加就是其中一個(gè)重要的原因。高糖還能刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-6(IL-6)和TNF-α,這些增加的細(xì)胞因子又能促進(jìn)中性粒細(xì)胞的氧化應(yīng)激,更有利于NETs的產(chǎn)生[25-26]。

Joshi等[25]研究了高血糖如何調(diào)節(jié)NETs釋放,結(jié)果發(fā)現(xiàn),高血糖能減弱脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞脫顆粒作用,導(dǎo)致嗜氮顆粒MPO和NE的釋放減少;與非糖尿病患者相比,糖尿病患者血清中NE酶活性降低,這表明糖尿病期間NETs的重要蛋白成分出現(xiàn)了功能障礙;在20 mmol·L-1糖濃度下,中性粒細(xì)胞在沒有LPS刺激的情況下產(chǎn)生NETs,而在30 mmol·L-1糖濃度下,中性粒細(xì)胞DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)瓦解,NETs結(jié)構(gòu)破壞,對(duì)LPS刺激失去反應(yīng),這表明中性粒細(xì)胞在高血糖條件下能夠成型活化,降低了對(duì)外部刺激的反應(yīng)能力,這樣的NETs負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制使得糖尿病患者更容易受到外部感染。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),與低糖濃度(5 mmol·L-1)相比,暴露于高糖濃度(25 mmol·L-1)的非糖尿病個(gè)體的中性粒細(xì)胞更容易發(fā)生自發(fā)性的NETosis,由于非能量糖不影響NETosis,因此,這一現(xiàn)象可能是通過糖酵解途徑增加ROS的產(chǎn)生進(jìn)而激活下游途徑導(dǎo)致的[27]。在人類和小鼠糖尿病模型的研究中發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞受到LPS、PMA或IL-8刺激后會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加,并且用鈣離子載體離子霉素和A23187治療能夠誘導(dǎo)NETs的釋放[28]。

有研究顯示,與正常對(duì)照組相比,1型糖尿病和2型糖尿病患者體內(nèi)的中性粒細(xì)胞中PAD4蛋白表達(dá)水平增加了4倍,正是這些PAD4蛋白催化中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs,這表明PAD4蛋白的增加可能有利于染色質(zhì)解凝,但目前尚不明確高糖能否在轉(zhuǎn)錄或翻譯后水平促進(jìn)PAD4蛋白的表達(dá);在高PAD4的刺激下,糖尿病患者體內(nèi)的中性粒細(xì)胞更易形成NETs結(jié)構(gòu),在糖尿病小鼠模型中,如果PAD4的活性缺失,NETs的形成會(huì)被阻斷[26]。在2型糖尿病患者的血清中,NETs相關(guān)的生物標(biāo)志物NE、單核苷酸體、寡核苷酸體和雙鏈DNA(dsDNA)均增加,并與糖化血紅蛋白水平呈正相關(guān),dsDNA又與腎病和心血管疾病的發(fā)生相關(guān)。此外,2型糖尿病患者的血清中,IL-6濃度更高,并與血清dsDNA水平相關(guān),這提示NETosis在高血糖和炎癥之間的相互作用中有重要意義[27]。有研究表明,在糖尿病患者中,血糖的增加可誘導(dǎo)更多的NETs形成[29],而且與糖尿病類型無關(guān)[30]。通過dsDNA和MPO的共定位檢測(cè)發(fā)現(xiàn),糖尿病患者胰腺中浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞能夠釋放NETs,主要是由于組蛋白瓜氨酸化促進(jìn)了染色質(zhì)解凝,導(dǎo)致NETs的釋放[31]。

4 NETs在DR中的作用

DR是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥[32],其病理生理機(jī)制尚不完全清楚,但糖基化的終產(chǎn)物、多元醇的積累、蛋白激酶C的激活和中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)均被認(rèn)為是導(dǎo)致DR的危險(xiǎn)因素[33-34]。DR的特征是組織缺血、缺氧引發(fā)血管生長(zhǎng)因子的生成和炎癥因子的釋放,引起視網(wǎng)膜新生血管,并發(fā)生纖維化形成視網(wǎng)膜纖維血管增殖膜,嚴(yán)重的情況下患者會(huì)發(fā)生出血或牽拉性視網(wǎng)膜脫離[35-37]。為了研究NETs在DR中的作用,Park等[38]檢測(cè)了PDR患者玻璃體中dsDNA的含量,dsDNA是在NETs產(chǎn)生后釋放出來的產(chǎn)物,是檢測(cè)NETs的重要指標(biāo),結(jié)果顯示,與有糖尿病但無DR的患者相比,PDR患者玻璃體中的dsDNA濃度顯著升高;此外,在體外高糖(30 mmol·L-1)刺激下,中性粒細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生更多的DNA-組蛋白復(fù)合物和NE,并且NETs的標(biāo)志物DNA-組蛋白復(fù)合物和NE是衡量炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度的指標(biāo)。Wang等[39]研究中,根據(jù)視網(wǎng)膜病變的程度將糖尿病患者分為不同階段,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與無DR的糖尿病患者相比,有DR的糖尿病患者外周血中NE、dsDNA的產(chǎn)生水平顯著升高。Barliya等[40]研究發(fā)現(xiàn),將IL-8或TNF-α注射到小鼠玻璃體內(nèi)會(huì)導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),同時(shí)在小鼠視網(wǎng)膜上也發(fā)現(xiàn)了NE、MPO和Cit-H3等NETs標(biāo)志物的陽性表達(dá)。

在NETs的形成過程中,中性粒細(xì)胞釋放的游離DNA表面帶負(fù)電荷,可激活凝血因子XII,裂解前激肽酶產(chǎn)生激肽釋放酶,進(jìn)而裂解高分子量激肽原(HK)為緩激肽(BK)和裂解的高分子量激肽原(HKa)。HK能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集并釋放NE和O2-,并加重?fù)p傷。BK通過緩激肽受體B2(B2R)和細(xì)胞黏附分子刺激細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),引發(fā)急性炎癥反應(yīng)。而HKa有多種活性,與中性粒細(xì)胞表面受體巨噬細(xì)胞表面分子抗原Mac-1結(jié)合,刺激產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和NE以及O2的釋放,從而引起組織的慢性炎癥。由此可見,NETs通過激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(KKS)通路參與了DR的急性和慢性炎癥損傷過程[41]。Song等[42]也在DR患者玻璃體內(nèi)檢測(cè)到了DNA-組蛋白復(fù)合物和XIIa的高水平表達(dá),證實(shí)了高糖不僅能誘導(dǎo)NETs的形成,還能激活KKS通路加重DR的炎癥損傷。

研究發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞募集產(chǎn)生NETs還與DR的血管重塑有關(guān)。氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(OIR)小鼠視網(wǎng)膜上缺氧的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生衰老,分泌細(xì)胞因子并觸發(fā)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs,促進(jìn)消除衰老血管內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)而為重塑視網(wǎng)膜血管做好準(zhǔn)備[43]。通過敲除小鼠PAD4基因,能夠削弱小鼠中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs的能力,進(jìn)而抑制衰老細(xì)胞的清除,延緩病理性新生血管的消退。因此,NETs既可參與誘導(dǎo)炎癥和血栓形成過程,也可參與糖尿病誘導(dǎo)的血管病變的發(fā)展[19,44]。

Liu 等[45]研究顯示,糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中有大量中性粒細(xì)胞聚集并釋放NE,NE可以通過蛋白酶激活受體(PAR2),髓樣分化因子初次應(yīng)答基因88(MyD88)和NF-κB等細(xì)胞因子增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性,進(jìn)而加重了視網(wǎng)膜血管的滲漏。在缺乏NE的糖尿病小鼠中視網(wǎng)膜血管通透性顯著降低,這說明,NETs能夠提高DR小鼠視網(wǎng)膜血管通透性,導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫。

5 NETs在DR治療中的應(yīng)用

NETs的形成標(biāo)志物DNA-組蛋白復(fù)合物和NE是DR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,這一發(fā)現(xiàn)為通過抑制NETs形成來防治DR提供了新的治療和預(yù)防方法[46],這意味著可以通過抑制或阻斷NETs通路中的標(biāo)志物來延緩DR的發(fā)生發(fā)展,但這一過程尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn),在不同的疾病如急性心肌梗死、中風(fēng)和糖尿病中阻斷PAD4能夠控制糖尿病的進(jìn)展[47],這也為進(jìn)一步治療DR提供了事實(shí)依據(jù)。Weitz[48]研究通過阻斷NE能夠減輕視網(wǎng)膜血管通透性,為減輕患者視網(wǎng)膜水腫,提高視力提供了新的治療靶點(diǎn)。NADPH氧化酶介導(dǎo)的ROS是NETs形成的經(jīng)典機(jī)制,利用抑制性藥物PMA抑制NADPH氧化酶的活性,可以抑制中性粒細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)解凝,進(jìn)而減少NETs生成,減輕組織的氧化損傷,因此,抑制NADPH氧化酶活性的藥物開發(fā)或可用于DR的防治[21]。凝血系統(tǒng)中XIIa因子啟動(dòng)的KKS通路是NETs引起炎癥的重要機(jī)制,XIIa因子的抑制劑(反義寡核苷酸、重組蛋白、合成肽和小分子量因子XIIa抑制劑)均已證實(shí)可以拮抗血栓的形成[42],深入研究XIIa抑制劑在NETs中的作用將進(jìn)一步拓展這些藥物的適應(yīng)證,可能為DR的防治提供新思路。

6 結(jié)束語

NETs通過參與炎癥反應(yīng)在DR發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用。了解NETs在DR中的發(fā)生及作用,并利用NETs形成過程中所產(chǎn)生的生物標(biāo)志物,如組蛋白、MPO、NE和DNA-組蛋白復(fù)合物等能夠判斷DR的進(jìn)展程度,同時(shí)也為DR的防治提供了新的靶標(biāo)及思路。