特醫(yī)食品中VC檢測關(guān)鍵控制點(diǎn)及穩(wěn)定性研究

范春婷，殷耀，張萍，陸慧媛*，張曉燕，沈偉健

南京海關(guān)動植物與食品檢測中心（南京 210019）

維生素C（Vitamin C，VC）作為特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品（Food for Special Medical Purposes，F(xiàn)SMP）（以下簡稱特醫(yī)食品）中重要的營養(yǎng)元素，具有促進(jìn)抗體形成、促進(jìn)鐵吸收、清除自由基等功能[1]*。但因其對光、熱、氧等極不穩(wěn)定的特性[2]*，使得快速、準(zhǔn)確測定特醫(yī)產(chǎn)品中VC的含量成為行業(yè)難點(diǎn)。根據(jù)現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)[3]*，特醫(yī)食品中VC的檢測方法GB 5413.18—2010[4]*存在前處理過程過濾困難、濾液不澄清等缺點(diǎn)[5]*。目前，VC檢測方法還有二氯靛酚滴定法[6-7]*、紫外分光光度法[8-10]*和高效液相色譜法[11-12]*。GB 5009.86—2016[13]*包含了除熒光法之外的3種方法，但此標(biāo)準(zhǔn)適用范圍也不包含特醫(yī)食品，且前處理過程因特醫(yī)食品富含蛋白質(zhì)的特性，影響定量。食品及藥品中VC的穩(wěn)定性一直備受關(guān)注[14-17]*，但目前未見關(guān)于特醫(yī)食品尤其是特醫(yī)食品液態(tài)產(chǎn)品中VC穩(wěn)定性的研究。因此，研究并掌握特醫(yī)食品中VC的降解規(guī)律，找到可有效保持其穩(wěn)定的方法成為特醫(yī)食品研發(fā)、生產(chǎn)過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

此次研究對GB 5009.86—2016[13]*的液相色譜法進(jìn)行優(yōu)化，將蛋白沉淀作為前處理的關(guān)鍵控制點(diǎn)，建立回收率穩(wěn)定且更適于特醫(yī)食品VC的測定方法；并對特醫(yī)食品液態(tài)產(chǎn)品中的VC進(jìn)行穩(wěn)定性考察，為特醫(yī)食品中VC的檢測和研發(fā)提供技術(shù)保障及參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；SQP Quintix224-1 cn電子天平（德國賽多利斯公司）；Sigma2-16K臺式冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）。

維生素C標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.98%，Sigma Aldrich）；磷酸、偏磷酸、乙酸鋅、磷酸二氫鉀，均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇，色譜純（美國 默克公司）。

所有特醫(yī)食品樣品均來源于南京海關(guān)動植物與食品檢測中心送檢的委托樣品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液配制（現(xiàn)配現(xiàn)用）：稱取0.01 g（精確至0.000 1 g）維生素C標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用偏磷酸溶液（20 g/L）溶解并定容。

偏磷酸溶液：稱取20 g（精確至0.1 g）偏磷酸，溶于水并稀釋至1 L。

200 g/L乙酸鋅溶液：稱取200 g（精確至0.1 g）乙酸鋅，加入水溶解至1 L。

1.2.2 樣品前處理

稱取2 g（精確至0.001 g）樣品于50 mL棕色容量瓶中，加入1 mL 200 g/L乙酸鋅溶液，加入20 g/L偏磷酸溶液震搖溶解并定容。搖勻，全部轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，超聲提取5 min后，以8 000 r/min離心5 min，取上清液過0.45 μm水相膜，待分析。

1.2.3 色譜條件

儀器及色譜條件參考GB 5009.86—2016[13]*第一法高效液相色譜法6.4儀器參考條件。

1.3 特醫(yī)食品中VC穩(wěn)定性研究

依據(jù)《特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品穩(wěn)定性研究要求（試行）》（2017版）的相關(guān)規(guī)定，選取不同特醫(yī)食品液態(tài)樣品，對其貯藏過程中VC含量的穩(wěn)定性進(jìn)行跟蹤試驗(yàn)。

1.3.1 加速、長期和影響因素試驗(yàn)

將樣品分別存放于不同藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中（已通過相應(yīng)溫濕度檢定），進(jìn)行加速試驗(yàn)和長期試驗(yàn)，溫、濕度分別為30±2 ℃，Hr60%±5%和25±2 ℃，Hr60%±10%。影響因素考察高溫和高濕條件，條件分別為40 ℃，60 ℃和光照4 500 Lx±500 Lx。加速試驗(yàn)于第0，第1，第2，第3，第4和第5個(gè)月取出檢測，長期試驗(yàn)于第0，第3，第6，第9，第12和第15個(gè)月取出檢測，影響因素于第5天和第10天取出檢測。

1.3.2 使用中穩(wěn)定性試驗(yàn)

將樣品開封后，放置1 min，蓋上蓋子分別置于4～8 ℃或25±2 ℃條件下存放24 h，然后檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

檢測數(shù)據(jù)、色譜圖、標(biāo)準(zhǔn)曲線圖采用液相色譜儀自帶工作站的數(shù)據(jù)分析軟件處理，表格及圖像數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用Excel 2019及Origin 8.5處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 維生素C標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分析

參照GB 5009.86—2016[13]*第一法，采用液相色譜儀對維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，目標(biāo)物在8.4 min出峰，峰形尖銳，總分析時(shí)長13 min，在0.5～50 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=88.704 98X，相關(guān)系數(shù)0.999 96（詳見圖1）。按3倍信噪比確定此方法檢出限為0.5 mg/100 g，10倍信噪比確定定量限為2 mg/100 g。

圖1 維生素C液相色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 蛋白沉淀劑的選擇

擬在GB 5009.86—2016[13]*第一法的基礎(chǔ)上，增加蛋白沉淀步驟。常用的蛋白沉淀劑包括金屬鹽、有機(jī)溶劑等[18]*。其中，乙醇可以使蛋白質(zhì)和溶劑分子之間的相互作用減弱，使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集而沉淀[19]*；乙酸鋅可以通過降低蛋白質(zhì)的溶解度，使蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出[20]*。研究比較無水乙醇和乙酸鋅對樣品中蛋白質(zhì)的沉淀效果。結(jié)果顯示，無水乙醇含量達(dá)50%時(shí)沉淀效果較好，但此時(shí)色譜峰變寬，峰形差（詳見圖2a），且回收率僅70%左右，經(jīng)分析可能是提取液中較高含量的乙醇使VC在色譜柱上的保留性變差導(dǎo)致的；而乙酸鋅既可以很好地沉淀蛋白，又不會影響VC在色譜柱上的保留性，色譜峰對稱且尖銳（圖2b）。

圖2 樣品及維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

基于上述結(jié)果，對乙酸鋅的最佳使用量進(jìn)行摸索。固態(tài)基質(zhì)樣品分別加入0.2，0.4和0.8 g乙酸鋅，液態(tài)基質(zhì)樣品分別加入0.1，0.2和0.3 g乙酸鋅。結(jié)果表明，固態(tài)基質(zhì)樣品中，0.2 g乙酸鋅蛋白沉淀效果較差，提取離心后樣品溶液仍渾濁（圖3a），0.4 g和0.8 g乙酸鋅可以獲得較清澈的樣品溶液（圖3b，圖3c），本著節(jié)約試劑的原則，選擇0.4 g乙酸鋅作為特醫(yī)食品固態(tài)基質(zhì)樣品蛋白沉淀劑；而0.1 g乙酸鋅固體即可在液態(tài)基質(zhì)樣品中達(dá)到較好沉淀效果（圖4a），故選擇0.1 g乙酸鋅作為液態(tài)基質(zhì)樣品蛋白沉淀劑。

圖3 固態(tài)基質(zhì)特醫(yī)食品乙酸鋅蛋白沉淀效果

圖4 液態(tài)基質(zhì)特醫(yī)食品乙酸鋅蛋白沉淀效果

為進(jìn)一步提升可操作性，研究將乙酸鋅固體配制成200 g/L乙酸鋅溶液。將樣品用偏磷酸溶液溶解后，分別加入2 mL（固態(tài)樣品）、0.5 mL（液態(tài)樣品），處理后的樣品詳見圖5。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以較好地完成過濾和后續(xù)檢測。

圖5 乙酸鋅溶液蛋白沉淀效果

2.3 不同特醫(yī)食品樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

為驗(yàn)證優(yōu)化后方法的準(zhǔn)確性，選取特醫(yī)食品液態(tài)及固態(tài)基質(zhì)樣品共24個(gè)，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。結(jié)果顯示，液態(tài)基質(zhì)特醫(yī)食品加標(biāo)回收率范圍95.6%～104.2%，固態(tài)基質(zhì)特醫(yī)食品加標(biāo)回收率范圍95.9%～102.2%（詳見表1），均符合GB/T 27417[21]*的要求，表明此方法重復(fù)性較好，可用于液態(tài)和固態(tài)特醫(yī)食品的檢測。

表1 不同基質(zhì)特醫(yī)食品維生素C加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.4 維生素C穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4.1 加速和長期試驗(yàn)中維生素C穩(wěn)定性

隨機(jī)選取3個(gè)特殊醫(yī)學(xué)用途全營養(yǎng)配方食品液態(tài)基質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)行加速和長期穩(wěn)定性試驗(yàn)，對VC的穩(wěn)定性進(jìn)行跟蹤檢測。每瓶樣品在檢測前均處于密封狀態(tài)，一旦開瓶，立即進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，經(jīng)5個(gè)月加速試驗(yàn)和15個(gè)月長期試驗(yàn)后，VC含量均明顯降低（圖6，圖7），衰減率分別為30.6%～80.3%和30.0%～78.4%；長期試驗(yàn)中，VC含量的降低在前3個(gè)月最為明顯，衰減率為18.3%～31.0%；第9～第15個(gè)月下降趨勢逐漸趨于平緩，衰減率僅為3.4%～4.3%。經(jīng)分析，可能與樣品中存在殘氧量有關(guān)，初期VC氧化較快，隨時(shí)間延長殘氧剩余量減少，VC相對穩(wěn)定。

圖6 加速試驗(yàn)維生素C含量變化

圖7 長期試驗(yàn)維生素C含量變化

2.4.2 高溫試驗(yàn)中維生素C的穩(wěn)定性

高溫試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度對特醫(yī)食品貯藏過程中VC的穩(wěn)定性影響較大，在40 ℃或60 ℃保存10 d，VC的衰減率分別為12.1%～18.2%和36.4%～43.6%（圖8和圖9），且溫度越高，衰減越快，如60 ℃保存5 d，VC衰減率高達(dá)22.5%。這個(gè)結(jié)果與Guerra-Hernandez等[22]*的發(fā)現(xiàn)一致，即嬰幼兒液態(tài)奶在55 ℃儲藏90 d VC的含量遠(yuǎn)低于在20 ℃下儲存的產(chǎn)品。

圖8 高溫試驗(yàn)40 ℃維生素C含量變化

圖9 高溫試驗(yàn)60 ℃維生素C含量變化

2.4.3 光照試驗(yàn)中維生素C的穩(wěn)定性

選擇實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的兩種包裝材質(zhì)，分析不同透光率的包材在特醫(yī)食品中VC受光照影響中的作用，包裝材質(zhì)如圖10所示，特醫(yī)食品D使用不透光材質(zhì)進(jìn)行包裝，特醫(yī)食品E、F使用透光材質(zhì)進(jìn)行包裝。結(jié)果顯示，在4 500 Lx±500 Lx照度下的第5天和第10天（圖11），不透光材質(zhì)瓶裝的特醫(yī)食品D衰減率分別為0.96%和7.00%，而透光瓶裝特醫(yī)食品E、F中VC的衰減率分別為7.95%，12.55%和15.89%，14.67%，由此可見光照對產(chǎn)品中VC的穩(wěn)定性與包材的透光性有很大關(guān)系。這一結(jié)果與閻然等[23]*的結(jié)果一致，即光照會降低NFC鮮榨橙汁中VC濃度，避光則顯著減少VC的損失。另有研究表明光線會加速VC的降解，其降解反應(yīng)速率符合一級反應(yīng)模型[24]*，且自然日光的照射比日光燈的照射損失更快[2]*。

圖10 不透光和透光包裝材質(zhì)示例

圖11 光照試驗(yàn)維生素C含量變化

2.4.4 使用中穩(wěn)定性試驗(yàn)維生素C的含量變化及保持其穩(wěn)定性方式確認(rèn)

結(jié)果顯示，樣品開封后，無論常溫或冷藏條件下特醫(yī)食品F中VC含量下降均很快，衰減率分別為18.1%和19.0%，經(jīng)分析，可能與樣品開封后空氣進(jìn)入瓶中，導(dǎo)致VC發(fā)生氧化和降解有關(guān)，而與空氣的影響比較，不同貯藏的溫度條件對VC含量的影響不明顯。王亞楠等[25]*也發(fā)現(xiàn)菠菜汁中VC保存率與空氣暴露時(shí)間的長短有很大關(guān)系，暴露時(shí)間越長，VC保存率越低。在氧氣作用下，L-抗壞血酸極易被氧化為L-脫氫抗壞血酸，從而導(dǎo)致VC含量的衰減，這與Renner[26]*的研究結(jié)果一致，當(dāng)UHT乳中氧含量達(dá)到8～9 mg/L，28 d后UHT乳中VC的損失率達(dá)100%。

圖12 使用中穩(wěn)定性試驗(yàn)維生素C含量變化

為確認(rèn)樣品中殘氧及開瓶后產(chǎn)品中空氣進(jìn)入對樣品中VC穩(wěn)定性的影響，隨機(jī)取一瓶特醫(yī)食品液態(tài)樣品，首次開瓶進(jìn)行檢測后立即充入高純氮?dú)猓兌龋?9.999%），密封后冷藏保存，分別于不同時(shí)間進(jìn)行檢測，且在每次檢測后都充入氮?dú)獗４?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品中VC含量在3個(gè)月內(nèi)僅下降2.79%，具體數(shù)據(jù)詳表2。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)樣品中VC的衰減與樣品中殘留空氣有關(guān)。

表2 充入氮?dú)獗４嫣蒯t(yī)食品樣品后維生素C含量的變化結(jié)果

3 結(jié)論

研究根據(jù)特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的基質(zhì)特性，確定了特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中VC檢測的關(guān)鍵控制點(diǎn)，利用蛋白沉淀劑凈化樣品，C18色譜柱分離，紫外檢測器定量，建立了一種可準(zhǔn)確檢測特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中VC含量的高效液相色譜檢測法。經(jīng)實(shí)際樣品檢測，該方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、高效。同時(shí)，對特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品貯藏過程中VC的穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，儲存溫度、光照、包材避光性及樣品瓶中殘留的空氣均可對樣品中的VC造成影響，因此在特醫(yī)食品的研發(fā)、生產(chǎn)以及儲存過程中均應(yīng)選擇低溫、避光場所，并采用隔氧、避光的包裝材料，以保證產(chǎn)品中VC的穩(wěn)定。