菌草酒釀造工藝優(yōu)化及其品質(zhì)分析

范錦琳, 張麗麗, 張煜隆, 林 輝, 易 超, 林占熺, 林冬梅

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002)

菌草(JUNCAO)是1986年福建農(nóng)林大學(xué)林占熺研究員提出的.菌草是草品種的一個新類別，是新的農(nóng)業(yè)資源，是“菌”與“草”交叉科學(xué)研究與產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個新領(lǐng)域[1].菌草主要包括巨菌草、檸檬香茅、象草、五節(jié)芒、紫花苜蓿等草本植物.

釀酒的原料是保證成品酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素，對發(fā)酵后的感官特性有直接影響[2].生活中釀酒的原材料主要包括大米[3-4]、高粱[5-7]等谷物類，還有葡萄[8]、蘋果[9]、百香果[10]等果蔬類，而這些原材料成本遠(yuǎn)高于巨菌草.巨菌草(CenchrusfungigraminusZ. X. Lin & D. M. Lin & S. R. Lan sp. nov.)屬禾本科草本植物，是菌草中最重要的代表[11].巨菌草植株節(jié)節(jié)叢生，高大挺拔，在溫度適宜的地區(qū)為多年生植物，具有產(chǎn)量高、纖維含量高、粗蛋白和糖分含量高的特點[12].師靜等[13]對巨菌草纖維素的酶解條件進行研究，發(fā)現(xiàn)巨菌草中含有豐富的還原糖，這為利用巨菌草制備乙醇提供了理論依據(jù).檸檬香茅(CymbopogoncitratusStapf)屬禾本科草本植物，為常見的香草，具有檸檬香氣，也被稱為檸檬草，含有豐富的多糖、多酚、黃酮類及香茅精油[14]，這些成分具有降脂、降糖、抑菌等功效[15].童金華[16]以巨菌草、檸檬香茅和紫花苜蓿等為主要原料，研制出風(fēng)味獨特的菌草復(fù)合飲料.

目前，以巨菌草為主要原料釀造酒的相關(guān)研究尚未見報道.本研究以感官評分為綜合評價指標(biāo)，采用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面法對菌草酒的釀造工藝進行優(yōu)化，得到發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)[17]；通過對成品菌草酒的微生物安全性，理化、衛(wèi)生指標(biāo)，以及黃曲霉毒素含量進行分析，得到一種新型的符合國家標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)酵酒，為開發(fā)菌草產(chǎn)業(yè)新產(chǎn)品提供了一條新途徑，為菌草酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

巨菌草、檸檬香茅由福建農(nóng)林大學(xué)旗山校區(qū)國家菌草工程技術(shù)研究中心基地提供.酒曲包含黃酒生料釀酒曲(龍巖)、安琪白酒曲、安琪甜酒曲(甜味型)、安琪甜酒曲(風(fēng)味型)和白曲(龍巖)，均為市售，用密封袋密封并存放于4 ℃冰箱.

1.2 菌草酒的加工工藝流程

1.3 菌草酒釀造的工藝操作要點

1.3.1 篩選原料 挑選新鮮、無病蟲害的菌草，用流水沖洗附著在菌草表面的污垢和雜質(zhì)，置陰涼處將表面水分瀝干.

1.3.2 調(diào)糖 添加一定量的白砂糖到菌草汁中，再將菌草汁的可溶性固形物含量調(diào)至一定水平，推算出菌草生料發(fā)酵所需要添加白砂糖的含量.

1.3.3 釀酒酵母的活化 配制成糖含量5%、溫度35～40 ℃的無菌水溶液(酵母與水的體積比為1∶10)，小心混勻，靜置后使其復(fù)水、活化；隔10 min輕攪拌一下，使酵母通氧，15～25 min后有細(xì)膩泡沫出現(xiàn)即活化成功，再進行接種.

1.3.4 主發(fā)酵 在發(fā)酵前期進行厭氧發(fā)酵，在發(fā)酵后期定期進行排氣.發(fā)酵啟動后定期進行理化檢測，以便對發(fā)酵過程進行監(jiān)控.

1.3.5 后發(fā)酵 取發(fā)酵上清液在4 ℃條件下陳釀30 d.

1.4 菌草酒品質(zhì)指標(biāo)的測定

1.4.1 理化指標(biāo)測定 殘?zhí)牵簩⒄麴s水調(diào)零，采用數(shù)顯糖度計測定果酒的糖度[18].

酒精度：參考國家標(biāo)準(zhǔn)[19]測定.

總酸：通過標(biāo)定的氫氧化鈉溶液的酸堿中和滴定來測定[20].

可溶性固形物：采用手持屈折計對酒液中可溶性固形物進行3次重復(fù)測定.

pH值：采用pH計測定[21].

1.4.2 菌草酒的安全性檢測 微生物安全性指標(biāo)檢測參照國家標(biāo)準(zhǔn)[22].

理化和衛(wèi)生指標(biāo)的檢測參照國家標(biāo)準(zhǔn)[23].

黃曲霉毒素的檢測參照國家標(biāo)準(zhǔn)[24]，即使用酶聯(lián)免疫吸附法(試劑盒)對菌草酒樣品中的黃曲霉毒素B1(AFTB1)、黃曲霉毒素B2(AFTB2)、黃曲霉毒素G1(AFTG1)和黃曲霉毒素G2(AFTG2)進行檢測.將AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2按12∶6∶2∶1(體積比)混合，以混合毒素作為參照，對菌草酒樣品中的黃曲霉毒素進行檢測.

1.5 單因素試驗

設(shè)置釀酒酵母種類、初始糖度、發(fā)酵溫度、酒曲接種量和發(fā)酵時間5個因素進行單因素試驗.

1.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計Table 1 Experimental design of response surface analysis

利用響應(yīng)面優(yōu)化法進一步對菌草酒的釀造工藝進行優(yōu)化.響應(yīng)面試驗因素與水平見表1.根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，進行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以感官評分為響應(yīng)值，對菌草主發(fā)酵的發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化[25].用Design Expert 8.0.6軟件對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行處理和方差分析，得到菌草酒最佳感官評分的二次多元回歸方程.

1.7 感官評價

請10位食品專業(yè)感官品評員，參照感官評價標(biāo)準(zhǔn)(表2)對菌草酒進行感官評價；采用百分制，取10位品評員的平均分值，確定一個最佳口感，從而得到一個最佳的優(yōu)化工藝方案[26].

表2 感官評價標(biāo)準(zhǔn)表Table 2 Standards for sensory evaluation

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS (16.0)對所得到的試驗數(shù)據(jù)進行相關(guān)性及顯著性分析，采用Design Expert 8.0.6進行繪圖、分析.指標(biāo)數(shù)值為3個重復(fù)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差[27-29].

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 釀酒酵母對菌草酒品質(zhì)的影響 在發(fā)酵溫度25 ℃、初始糖度24°Brix、酒曲接種量0.3 g·L-1、發(fā)酵天數(shù)30 d的條件下，5種酵母菌對菌草酒品質(zhì)的影響如表3所示.從表3可知：以安琪白酒曲為釀酒酵母獲得的菌草酒的殘?zhí)呛孔畹?；以安琪甜酒?甜味型)和安琪甜酒曲(風(fēng)味型)為釀酒酵母獲得的菌草酒的殘?zhí)呛亢蚿H值均較高，其中以風(fēng)味型酒曲為釀酒酵母獲得的菌草酒的殘?zhí)呛孔罡?；而采用白酒曲作為釀酒酵母釀造的菌草酒的可溶性固形物含量最高，達到20.6%；采用風(fēng)味型酒曲釀造的菌草酒的可溶性固形物含量最低，只有7.7%.從感官評價來看：利用安琪甜酒曲(甜味型)和安琪甜酒曲(風(fēng)味型)為釀酒酵母獲得的菌草酒的酒體口味不純，有雜味；以生料釀酒曲釀造的酒體微紅，不夠清透；以白曲釀造的菌草酒的酒體比用安琪白酒曲釀造的稍顯單調(diào).孔明明[30]研究表明，酒中殘?zhí)呛亢蚿H 值偏高不利于酵母菌的發(fā)酵，酸度高使得口感不佳.綜上所述，利用安琪白酒曲作為釀酒酵母得到的菌草酒綜合效果最好，因此選擇安琪白酒曲作為菌草酒的最佳釀酒酵母.

表3 釀酒酵母對菌草酒品質(zhì)的影響Table 3 Effect of yeast variety on quality of JUNCAO wine

2.1.2 初始糖度對菌草酒品質(zhì)的影響 以安琪白酒曲作為菌草酒發(fā)酵酒曲，在發(fā)酵溫度25 ℃、接種量0.3 g·L-1、發(fā)酵天數(shù)30 d的條件下，初始糖度對菌草酒口感的影響如表4所示.從表4可知：隨著初始糖度的提高，菌草酒殘?zhí)呛涂扇苄怨绦挝锖恐饾u升高；菌草酒中的總酸含量和pH值逐漸降低；菌草酒中的酒精度則呈逐漸上升的趨勢.當(dāng)初始糖度為16°Brix時，菌草酒酒精度最低，總酸含量和pH值最高，但口感最差，酒體渾濁，略有異味.當(dāng)初始糖度為24°Brix時菌草酒口感最佳，酒體協(xié)調(diào)，外觀呈草綠色，口感醇厚適口，余味舒適.當(dāng)初始糖度為32°Brix時，得到的菌草酒酒精度最高，但酸度和口感不如初始糖度為24°Brix釀成的菌草酒，可能是因為當(dāng)酒精含量過高時，酒體的酒精味重，刺激性強，掩蓋了原料的草香味.但若酒精含量低，則口感寡淡無味.綜合考慮各個影響因素[31]，確定菌草酒發(fā)酵的最佳初始糖度為24°Brix.

表4 初始糖度對菌草酒品質(zhì)的影響Table 4 Effect of initial sugar degree on quality of JUNCAO wine

2.1.3 發(fā)酵溫度對菌草酒品質(zhì)的影響 選用安琪白酒曲作為釀酒酵母，在發(fā)酵初始糖度24°Brix、接種量0.3 g·L-1、發(fā)酵天數(shù)30 d的條件下，發(fā)酵溫度對菌草酒品質(zhì)的影響如表5所示.從表5可知：隨著發(fā)酵溫度的升高，菌草酒中殘?zhí)呛康淖兓^為顯著；5個溫度梯度下菌草酒中的殘?zhí)呛亢蚿H值呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢；當(dāng)發(fā)酵溫度為27 ℃時，菌草酒中殘?zhí)呛孔畹停划?dāng)發(fā)酵溫度為23 ℃時，菌草酒中殘?zhí)呛孔罡?低溫造成菌草酒中殘?zhí)呛科叩脑蚩赡苁墙湍妇鷮Φ蜏夭贿m應(yīng)，進入休眠期，進而減慢甚至停止發(fā)酵.酵母菌的生長溫度為25～32 ℃[32].周文亞等[33]在探究發(fā)酵溫度對釀酒酵母菌株的影響時發(fā)現(xiàn)，在22～28 ℃，隨著發(fā)酵溫度的升高，酵母菌數(shù)量與發(fā)酵溫度呈正相關(guān)，甘油含量升高對酒的辣感、酸酐起到平衡作用.劉洋[34]在對肉蓯蓉酒的釀造工藝研究中發(fā)現(xiàn)較低的發(fā)酵溫度會影響酵母菌繁殖，導(dǎo)致酵母菌的繁殖和降糖出現(xiàn)滯后.張鑫等[35]采用響應(yīng)面法對無花果酒的釀造工藝進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度偏低，不適合酵母菌的生長繁殖，會導(dǎo)致發(fā)酵周期延長、發(fā)酵不完全或代謝產(chǎn)物發(fā)生改變，進而對酒的品質(zhì)產(chǎn)生影響.從表5還可以發(fā)現(xiàn)，酒精度和可溶性固形物含量呈先上升后下降的趨勢，基本均維持在比較合理的水平.總酸含量總體呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，可能是因為溫度升高會導(dǎo)致香氣成分揮發(fā)，致使揮發(fā)酸、醛類等副產(chǎn)物大量生成.當(dāng)發(fā)酵溫度為27 ℃時，酒精度和可溶性固形物含量最高，得到的酒體色澤呈明亮的金黃色，酸甜可口，醇香濃郁協(xié)調(diào)，純正無雜味，余味愉快，且有獨特的清香味.由此可知最適宜菌草酒釀造的發(fā)酵溫度為27 ℃.

表5 發(fā)酵溫度對菌草酒品質(zhì)的影響Table 5 Effect of fermentation temperature on quality of JUNCAO wine

2.1.4 酒曲接種量對菌草酒品質(zhì)的影響 酒曲接種量會影響發(fā)酵周期[36].以安琪白酒曲作為釀酒酵母，在初始糖度24°Brix、發(fā)酵溫度27 ℃、發(fā)酵天數(shù)30 d的條件下，酒曲接種量對菌草酒品質(zhì)的影響如表6所示.從表6可知，隨著酒曲接種量的增加，菌草酒中的殘?zhí)恰H值、酒精度和可溶性固形物含量均呈先下降后上升的趨勢.可能是因為當(dāng)酵母含量降低時，酵母生長的延遲期變長；同時，發(fā)酵速度減慢，發(fā)酵過程容易受到其他雜菌的影響.當(dāng)酵母增加到一定量時，酵母的呼吸作用逐漸增強，生長延遲期也縮短，同時被用于酵母的生長和繁殖的基質(zhì)消耗量增大，導(dǎo)致酒精度下降.結(jié)果(表6)表明，當(dāng)酒曲接種量為0.45 g·L-1時，酒精度達到最大值，且菌草酒具有菌草特有的清香味，醇香味較濃，色澤清澈，風(fēng)味較佳.因此，確定菌草酒的最適酒曲接種量為0.45 g·L-1.

表6 酒曲接種量對菌草酒品質(zhì)的影響Table 6 Effect of yeast inoculum dosage on quality of JUNCAO wine

2.1.5 發(fā)酵時間對菌草酒品質(zhì)的影響 以安琪白酒曲作為釀酒酵母，在初始糖度24°Brix、發(fā)酵溫度27 ℃、酒曲接種量0.45 g·L-1的條件下，發(fā)酵時間對菌草酒品質(zhì)的影響如表7所示.從表7可知：菌草酒中的殘?zhí)呛吭诎l(fā)酵初期下降較快，從第10天到第30天由21.6 g·L-1迅速降到8.1 g·L-1；發(fā)酵30 d后殘?zhí)呛繋缀醪辉傧陆?可能是因為隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵罐中的氧氣含量降低，使得酵母菌新陳代謝加快，酒精含量迅速提高；當(dāng)酒精達到一定濃度時，酵母菌的生長繁殖受到抑制，使得發(fā)酵停止，從而造成酒中的糖分殘留[37].并且，隨著發(fā)酵時間的延長，酒精度的變化趨勢與酒中殘?zhí)呛康淖兓厔菡孟喾矗@與酒精度上升時總糖下降的變化規(guī)律相吻合.同時，總酸含量隨發(fā)酵時間的延長逐漸上升，可能是因為原料中的糖在酵母的作用下轉(zhuǎn)化成為乙醇.發(fā)酵前期酵母菌活性強，代謝活躍，因此乙醇的轉(zhuǎn)化速率高；發(fā)酵后期乳酸、醋酸菌等產(chǎn)酸菌大量生成有機酸，對酵母菌產(chǎn)生抑制作用，因此隨著發(fā)酵時間的延長，總酸含量上升，pH值下降.本研究結(jié)果表明，可溶性固形物含量在發(fā)酵前期呈逐漸上升的趨勢，但在第40天有所下降，可能是因為發(fā)酵液中的糖轉(zhuǎn)化較完全，發(fā)酵基本接近終點.感官評分在發(fā)酵第10天至第30天逐漸增加，并且在第30天達到最大值；在發(fā)酵第30天后感官評分逐漸降低.可能是因為隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵罐中酸度和酒精度升高，導(dǎo)致口感酸澀和辛辣味較濃.綜合考慮感官評價和成本因素，確定菌草酒的最佳發(fā)酵時間為30 d.

2.2 響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，通過響應(yīng)面試驗對菌草酒的釀造工藝進行優(yōu)化，選取初始糖度(A)、發(fā)酵溫度(B)和酒曲接種量(C)3個因素，設(shè)置3個水平進行試驗.以感官評價為響應(yīng)值進行試驗評價.以響應(yīng)面法優(yōu)化菌草酒發(fā)酵工藝的設(shè)計方案和響應(yīng)值，結(jié)果如表8所示.

表7 發(fā)酵時間對菌草酒品質(zhì)的影響Table 7 Effect of fermentation time on quality of JUNCAO wine

表8 響應(yīng)面試驗的設(shè)計方案和響應(yīng)值Table 8 Response surface experimental design and response value

利用Design Expert 8.0.6對表8的數(shù)據(jù)進行多元回歸方程擬合.以菌草酒的感官評分為響應(yīng)值構(gòu)建的菌草酒釀造工藝參數(shù)的二次回歸模型為：

Y=84.40+6.38A-1.50B-1.87C-2.75AB-1.50AC-0.75BC-5.95A2-6.70B2-7.95C2

由表9可知回歸模型中P值為0.031 3(P<0.05)，表明具有顯著差異.失擬項P值為0.933 1(P>0.05)，表明無顯著差異，即失擬項與純誤差之間差異不顯著，說明二次回歸模型顯著，可用回歸方程對試驗結(jié)果進行分析和預(yù)測[38].

R2=0.850 5，校正后R2=0.858 4，說明此模型可以解釋85.84%的響應(yīng)值變化；PredR2=0.565 9，信噪比=5.155>4，表明此模型擬合度好，試驗誤差小.

表9 回歸系數(shù)及顯著性檢驗1)Table 9 Regression coefficient and significance test

響應(yīng)面越陡峭，說明該因素對試驗結(jié)果的影響越顯著[39].從圖1可以看出，在所選范圍內(nèi)存在極值，坡度陡表明發(fā)酵溫度與初始糖度之間的交互作用顯著.從圖2可以看出，響應(yīng)面呈先升高后下降的趨勢，表明酵母接種量與發(fā)酵溫度之間有交互作用.由圖3可以看出，隨著酵母接種量的增加，感官評價變化不明顯.由此可知，初始糖度對感官評價的影響大于酵母接種量.

圖1 發(fā)酵溫度與初始糖度對感官評價的響應(yīng)面Fig.1 Effect of fermentation temperature and initial sugar degree on sensory quality by response

圖3 酵母接種量與初始糖度對感官評價的響應(yīng)面Fig.3 Effect of yeast inoculum dosage and initial sugar degree on sensory quality by response surface methodology

2.3 菌草酒的安全性

2.3.1 菌草酒微生物安全性指標(biāo) 菌落總數(shù)是體現(xiàn)酒體生物安全性的一個重要指標(biāo).本研究結(jié)果表明：菌草酒中的菌落總數(shù)<10 cuf·mL-1，符合白酒中菌落總數(shù)≤50 cuf·mL-1的要求；大腸菌群為0.01 MPN·mL-1，符合國標(biāo)中大腸菌群≤0.03 MPN· mL-1的要求；沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌均未檢出，滿足國標(biāo)中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌等不得檢出的要求.從檢測結(jié)果可以看出，采用上述工藝發(fā)酵的菌草酒，符合國家對固態(tài)釀造白酒微生物的要求，說明該菌草酒是一種安全的發(fā)酵食品.

2.3.2 菌草酒理化和衛(wèi)生指標(biāo) 本研究結(jié)果表明，菌草酒的酒精度為52%，為高度酒.總酸含量為1.9 g·L-1，符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求(≥0.30 g·L-1)；總酯含量為2.31 g·L-1，符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求(≥0.6 g·L-1)；甲醇含量為0.04 g·L-1，符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求(≤0.30 g·L-1)；鉛含量未檢出，符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求(≤0.5 mg·L-1).

2.3.3 菌草酒中黃曲霉毒素含量 菌草酒樣品中黃曲霉毒素的檢測結(jié)果如圖4所示.從圖4中可知:當(dāng)黃曲霉毒素濃度為100.0 ng·mL-1時，T線不明顯;當(dāng)黃曲霉毒素濃度為12.5 ng·mL-1時，T線剛開始顯現(xiàn).表明菌草酒樣品中黃曲霉毒素含量遠(yuǎn)低于12.5 ng·mL-1，菌草酒中的黃曲霉毒素符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求(≤20 ng·mL-1).

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗對菌草酒發(fā)酵工藝進行研究.本研究結(jié)果表明：

(1)選用安琪白酒曲作為釀酒酵母發(fā)酵得到的菌草酒的殘?zhí)呛孔畹?，風(fēng)味最好，因此選用安琪白酒曲作為釀造菌草酒的最佳酵母.

(2)在初始糖度為24°Brix時發(fā)酵得到的菌草酒口感最佳.在發(fā)酵溫度為27 ℃時發(fā)酵得到的菌草酒的酒精度和可溶性固形物含量最高，感官評價分?jǐn)?shù)最高.當(dāng)酵母接種量為0.45 g·L-1時，酒精度達到最大值，且感官評價分?jǐn)?shù)最高.感官評分在發(fā)酵第10天至第30天顯著提高，并且在第30天達到最高值.

陰性對照不含黃曲霉毒素；100.0和12.5 ng·mL-1是用混合黃曲霉毒素稀釋后的濃度.圖4 菌草酒樣品中的黃曲霉毒素含量分析

(3)通過響應(yīng)面試驗對菌草酒的釀造工藝進行優(yōu)化，最終確定菌草酒的最佳發(fā)酵工藝條件為：初始糖度24°Brix，發(fā)酵溫度29 ℃，酵母接種量0.45 g·L-1.在此工藝條件下進行3次平行試驗，得到的菌草酒感官評分為91分，與預(yù)測值差距較小.

(4)對菌草酒中微生物的安全性，理化、衛(wèi)生指標(biāo)和黃曲霉毒素含量進行檢測，結(jié)果顯示：菌落總數(shù)<10 cuf·mL-1，大腸菌群0.01 MPN·mL-1，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌均未檢出；酒精度52% vol、總酸含量1.90 g·L-1，總酯含量2.31 g·L-1，甲醇含量0.04 g·L-1，鉛未檢出，黃曲霉毒素含量遠(yuǎn)低于12.5 ng·mL-1.得到的結(jié)果均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，說明菌草酒是一種安全的發(fā)酵酒.成品菌草酒醇厚干爽，氣味醇香，色澤透亮，酒體協(xié)調(diào)，有濃郁而獨特的菌草香氣，具有較好的推廣價值.