邱余楊, 趙 輝, 何嘯宇, 祝芙蓉, 劉 斌, 劉慶華

[1.福建農林大學國家菌草工程技術研究中心；2.福建農林大學生命科學學院；3.福建農林大學食品科學學院；4.福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)，福建 福州 350002]

為緩解畜牧養(yǎng)殖逐漸規(guī)?；霈F的“人畜爭糧”現象，國家出臺了相關政策加強發(fā)展優(yōu)質飼草，以轉型至“以草換畜”的節(jié)約糧畜牧業(yè).巨菌草(CenchrusfungigraminusZ. X. Lin & D. M. Lin & S. R. Lan sp. nov.)富含糖分、木質素、粗蛋白和粗纖維，具有適口性好、易消化等優(yōu)點，且易種植、產量高，是一種具有市場潛力的高產、優(yōu)質的牧草資源[1].利用微生物發(fā)酵技術生產巨菌草飼料，可有效提高飼料營養(yǎng)及其消化吸收率；巨菌草飼料經瘤胃微生物發(fā)酵可產生豐富的營養(yǎng)物質，有利于調節(jié)胃腸道的菌群平衡，增強機體免疫功能[2].因此，巨菌草飼料的品質與反芻動物的健康和生產性能密切相關.

微生物發(fā)酵飼料的品質和營養(yǎng)不僅由發(fā)酵基料、益生菌群決定，還與菌的接種量、發(fā)酵溫度、體系含水量和發(fā)酵時間等工藝條件密切相關.因此，巨菌草飼料的最佳發(fā)酵工藝需分別對多因素和多指標進行篩選評價.針對多因素的篩選，除了正交設計[3]、均勻設計[4]外，響應面法[5]的試驗次數更少且結果更準確.飼料評價需考慮pH、纖維素、粗蛋白、有機酸等多個指標，指標間易相互影響，某一條件不一定對多個指標同時有效，因而本試驗引入總評歸一值，對多個指標進行綜合評價.此外，巨菌草自身附著的微生物和添加的復合菌可以協同作用降解菌草，而多種菌共存的體系往往不穩(wěn)定，所以獲得穩(wěn)定、高效的優(yōu)勢菌群尤為關鍵.早期，對單一菌的富集一般采用傳統培養(yǎng)計數法，對于某些重要微生物常使用常規(guī)PCR、熒光定量PCR法或克隆等方法檢測[6]，而對于傳代富集過程中物種組成和微生物的動態(tài)變化則常常采用高通量測序法[7-8].

本試驗采用單因素探究發(fā)酵條件的最適范圍，以主要檢測指標中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)、粗蛋白(crude protein, CP)、NH3-N/TN、乳酸/乙酸(lactic acid/acetic acid, LA/AA)和丁酸(butyric acid, BA)的總評歸一值(overall desirability, OD)為唯一響應值，采用響應面法建立數據模型進行分析優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵工藝；基于最佳工藝，對巨菌草飼料菌群傳代富集，以傳代富集中的各樣本作為考察對象，通過16S rRNA和ITS測序技術對菌群的組成和多樣性進行研究，旨在篩選出高效、穩(wěn)定的優(yōu)勢菌群，從而為改善菌草發(fā)酵飼料的品質提供依據.

1 材料與方法

1.1 菌草和菌種來源

巨菌草為高約2.5 m的2月齡新鮮菌草，由國家菌草工程技術研究中心提供.將巨菌草粉碎后50 ℃烘干，過20目篩，備用.玉米粉和麥麩購于河南麥德旺農副產品市場.飼料發(fā)酵菌群C：乳酸菌屬、酵母菌、芽孢桿菌、糞腸球菌、梭菌等，由本實驗室篩選保存[9].

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 稱取總量為50 g的發(fā)酵基料[巨菌草∶麥麩∶玉米粉=8∶1∶1(w∶w∶w)]，加入菌群C及無菌蒸餾水，配置成相應含水量的發(fā)酵體系，混勻后轉移至發(fā)酵袋，排除空氣，壓實密封，于培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵.

巨菌草發(fā)酵飼料的主要影響因素為接種量、發(fā)酵溫度、含水量、發(fā)酵時間，以這些因素為變量，檢測巨菌草發(fā)酵飼料的營養(yǎng)指標，判定試驗過程是否正常.以NDF、ADF、纖維素、相對飼用價值(relative feeding quality, RFQ)、CP、NH3-N/TN、pH、LA、LA/AA和BA的OD為綜合評價指標，確定最適單因素.基于單因素試驗，以OD為響應值，采用響應面法優(yōu)化巨菌草飼料發(fā)酵工藝，再基于優(yōu)化的最佳工藝，以菌群C為原始菌種，發(fā)酵基料為培養(yǎng)基，連續(xù)傳代富集培養(yǎng)直至菌群穩(wěn)定.

評分標準：采用Hassan方法，對上述6個指標進行歸一化處理，pH、NDF、ADF、纖維素、NH3-N/TN和BA，取值越小越好，計算公式為di=(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin)；而RFQ、CP、LA和LA/AA，取值越大越好，計算公式為di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)；幾何平均數總評歸一值OD=(d1+d2+d3+…dk)/k，其中k為指標數[10].

1.2.2 單因素優(yōu)化試驗 試驗基本條件為：含水量50%，發(fā)酵溫度30 ℃，接種量2.5%，發(fā)酵時間12 d.單因素試驗條件為接種量(1.5%、2.5%、3.5%、4.5%)、發(fā)酵溫度(25、30、35、40 ℃)、含水量(40%、50%、60%、70%)、發(fā)酵時間(0、3、6、9、12 d)，分別考察接種量、發(fā)酵溫度、含水量和發(fā)酵時間對巨菌草發(fā)酵飼料的營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質的影響.

表1 試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of experiment

1.2.3 響應面優(yōu)化試驗 基于單因素試驗，以發(fā)酵溫度(A)、含水量(B)、接種量(C)為考察因素，以主要檢測指標NDF、ADF、CP、NH3-N/TN、LA/AA和BA的OD為響應值.按Box-Behnken的中心組合設計原則進行試驗設計(表1)，優(yōu)化巨菌草飼料發(fā)酵工藝.

1.2.4 傳代富集培養(yǎng) 基于響應面的最佳工藝，對飼料菌群(總量20 kg)進行富集傳代，每發(fā)酵4 d為1代；再從前1代取總量的20%接種到新的發(fā)酵基料(20 kg)，混合均勻轉至發(fā)酵桶，壓實密封，靜置發(fā)酵；連續(xù)傳代富集至第5代，共計20 d；每代試驗結束后，按要求采樣檢測，每組試驗重復3次.

1.3 指標測定

1.3.1 營養(yǎng)成分的測定 發(fā)酵結束后，取25 g樣品，65 ℃烘48 h后檢測指標.CP、NDF、ADF、RFQ的測定，以及纖維素和半纖維素含量計算參考Rohweder et al[11]的方法.

1.3.2 發(fā)酵品質的測定 取10 g發(fā)酵飼料于三角瓶中，加入1∶9(v：v)的蒸餾水攪拌均勻，4 ℃冰箱浸提24 h，再常溫水浴超聲300 W 30 min，過濾后離心(7 850 r·min-1)10 min，取上清.用于測定pH值、有機酸和氨態(tài)氮(NH3-N)的含量，-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?采用超高效液相色譜(Water型)測定LA、AA和BA的含量，參考本實驗室方法[9].NH3-N含量的測定采用苯酚—次氯酸鈉比色法[12].

1.3.3 菌群分析鑒定 分別收集原菌液和富集傳代中第0、1、3、4、5代的樣本，于-80 ℃凍存?zhèn)溆?并依次命名為MCC、CSP0、CSP1、CSP3、CSP4和CSP5.每組3個重復.

采用CTAB/SDS法提取各傳代樣本的基因組DNA，利用1%的瓊脂糖凝膠來監(jiān)測DNA的濃度和純度[13]，再用無菌水將DNA稀釋至1 μg·μL-1.對于飼料中菌群多樣性的分析，用通用引物515F和806R擴增細菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)，用通用引物ITS5-1737F和ITS2-2043R擴增真菌ITS1-5F區(qū)域[14].利用Illumina NovaSeq平臺進行測序.利用QIIME[15]對原始標簽進行質量過濾，使用UCHIME算法去除嵌合[16].利用Uparse軟件對所有樣本中相似度達到97%的有效標簽聚類得OTUs(operational taxonomic units)[17]，再進行Beta和菌群組成等多樣性分析.利用RStudio軟件繪制菌群和發(fā)酵飼料營養(yǎng)品質的Spearman相關熱圖.通過Cytoscape 3.6.1對相關網絡進行可視化[18].

1.4 數據與統計分析

采用Excel 2019錄入數據，SPSS 13.0和design expert software 8.0對數據進行統計分析，試驗數據均采用平均值±標準偏差形式表示，方差分析的顯著性水平為P<0.05，極顯著性水平為P<0.01.

2 結果與分析

2.1 接種量的優(yōu)化

隨著菌群C接種量的增加，飼料中的NDF、ADF、纖維素含量，NH3-N/TN和BA含量均呈先降低后升高的趨勢，RFQ、CP含量、LA/AA和OD值則先升高后降低，且接種量2.5%的發(fā)酵效果最佳(表2).綜上，確定菌群C接種量最適范圍為1.5%～3.5%.

2.2 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

隨著發(fā)酵溫度的升高，飼料中NDF和ADF含量及NH3-N/TN均先降低后升高，RFQ和OD值則先升高后降低(表3).30和35 ℃的發(fā)酵溫度體系的OD值極顯著高于40 ℃，但30 ℃的體系與25 ℃的無顯著差異，OD30 ℃>OD35 ℃>OD25 ℃>OD45 ℃.綜上，確定發(fā)酵溫度最適范圍為25～35 ℃.

2.3 含水量的優(yōu)化

隨著含水量的升高，飼料中NDF、ADF、纖維素含量呈先降低后升高的趨勢，而RFQ、CP含量、LA含量、LA/AA和OD值則呈明顯的先升高后降低的趨勢(表4).含水量60%的飼料中纖維素和BA含量及pH均極顯著低于其他組(P<0.01)，RFQ、LA含量和OD值均極顯著高于其他組(P<0.01)，表明含水量為60%的發(fā)酵體系的飼料營養(yǎng)品質最優(yōu).綜上，確定含水量最適范圍為50%～70%.

表2 菌群C的接種量對巨菌草發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質的影響1)Table 2 Effect of inoculum size of microflora C on nutrient composition and fermentation quality of feed based on C. fungigraminus

表3 發(fā)酵溫度對巨菌草發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質的影響1)Table 3 Effect of fermentation temperature on nutrient composition and fermentation quality of fermented feed based on C. fungigraminus

表4 含水量對巨菌草發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質的影響1)Table 4 Effect of water content on nutrient composition and fermentation quality of fermented feed based on C. fungigraminus

2.4 發(fā)酵時間的優(yōu)化

相比于發(fā)酵初期，隨著發(fā)酵時間的延長，后期飼料中NDF、ADF和纖維素都能被有效降解(P<0.01)，pH也顯著降低(P<0.01)，RFQ、LA含量和OD值也顯著增加(P<0.01)；各指標在6 d內的變化最大，在9和12 d時趨于平穩(wěn).相比于12 d，發(fā)酵時間為9 d時的NH3-N/TN(P<0.05)和BA含量更低，CP含量較高；且OD9 d=OD12 d(表5).綜上，確定最佳發(fā)酵時間為9 d.

表5 發(fā)酵時間對巨菌草發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質的影響1)Table 5 Effect of fermentation time on nutrient composition and fermentation quality of fermented feed based on C. fungigraminus

2.5 響應面優(yōu)化試驗結果

由SPSS 13.0進行數據處理，再由design expert software 8.0對表6所列結果進行整理分析，得到發(fā)酵溫度(A)、含水量(B)、接種量(C)3個因素與OD之間的回歸方程.方程如下：

OD=0.86-0.14A-0.047B+0.035C-0.043AB-0.013AC+0.017BC-0.13A2-0.25B2-0.22C2

表6 響應面試驗結果1)Table 6 Results of response surface test

通過模型預測的最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵溫度27.36 ℃、含水量59.35%、接種量2.59%，在該優(yōu)化條件下，預測OD可達0.90.根據實際操作，將模型優(yōu)化后的最優(yōu)工藝參數調整為：發(fā)酵溫度28 ℃、含水量60%、接種量2.6%，并在該條件下進行3次驗證.結果表明(表8)，OD為0.89、0.92、0.86[平均值(average，AVG)為0.89，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為0.03]，與理論預測值基本一致，說明此模型具有一定的可靠性.

表7 回歸模型ANOVA分析結果1)Table 7 ANOVA analysis of regression model

表8 驗證試驗結果Table 8 Results of validation test

2.6 傳代富集試驗

第1代飼料中的NDF、ADF、CP含量和RFQ的變化與第0代無顯著差異(P>0.05)，但第1代飼料中LA含量、LA/AA和OD值顯著升高(P<0.01)，pH顯著降低(P<0.05).相比于第1代，第3代和第4代飼料中的NDF和ADF含量分別顯著降低了6.78%和6.80%、14.74%和16.68%(P<0.01)，RFQ、CP含量和OD值分別顯著升高了17.34%和18.65%(P<0.01)、8.54%和9.81%(P<0.05)、2.77和2.74倍(P<0.01)；pH均極顯著降低了29.19%(P<0.01)，LA含量和LA/AA分別極顯著升高了2.56和2.61倍、1.58和1.70倍(P<0.01).第5代飼料中NDF含量、NH3-N/TN和pH顯著高于第3、4代(P<0.05)，其他指標無顯著差(表9).綜上，第4代的飼料營養(yǎng)品質最佳.

表9 傳代富集對巨菌草發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質的影響1)Table 9 Effect of subculture enrichment on nutrient composition and fermentation quality of fermented feed based on C. fungigraminus

2.7 Beta多樣性分析

采用主坐標分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)對傳代富集過程中的飼料菌群結構進行分析(圖1)，圖中兩點距離的遠近表示樣本間群落結構的差異，若樣本距離越近，則物種組成結構越相似[21].由圖1A知，MCC、CSP0和CSP5間分布距離遠，說明CSP5中菌群結構變化最大；CSP1、CSP3和CSP4分布距離近，表明經傳代富集巨菌草中的細菌菌群改變，但CSP3和CSP4間差異并不顯著.由圖1B知，MCC分布于最右方，CSP0分布于上方，CSP1、CSP3、CSP4和CSP5之間的距離近且聚集在左下方.表明巨菌草基料自身所含菌群(CSP0)及傳代后菌群(CSP1～CSP5)與原始復合菌(MCC)的菌群結構組成差異較大，傳代后菌群與對照CSP0有一定差異，而CSP3和CSP4無明顯差異.這可能是因為MCC中所含真菌大多是飼料發(fā)酵的好氧菌，與CSP0中所含好氧菌不同，在進入飼料厭氧發(fā)酵階段后，大部分好氧菌失活致死，因此傳代后的巨菌草飼料所含的真菌菌群結構與MCC及CSP0的差異較大.而在傳代持續(xù)的選擇壓力下，微生物不斷選擇，逐漸形成相對穩(wěn)定的菌群.

A：細菌；B：真菌.圖1 主坐標分析Fig.1 Principal coordinates analysis

2.8 菌群結構組成

巨菌草飼料發(fā)酵菌群的細菌在門水平上(圖2A)，MCC組以變形菌門(63.02%)和厚壁菌門(36.47%)為主導，CSP0的優(yōu)勢菌門則以變形菌門(94.43%)為主，厚壁菌門(2.30%)和藍細菌(1.85%)次之.隨著傳代富集數增加，各代優(yōu)勢菌門均為變形菌門(CSP1 79.72%、CSP3 74.17%、CSP4 73.15%、CSP5 59.43%)和厚壁菌門(CSP1 19.54%、CSP3 24.91%、CSP4 24.81%、CSP5 34.45%)，此外，擬桿菌門在CSP5(2.28%)中的豐度顯著高于其他各組(P<0.05).在屬水平上(圖2B)，MCC的優(yōu)勢菌屬為片球菌屬(21.11%)和腸球菌屬(8.40%)，二者在傳代中的豐度很低.泛菌屬在MCC中豐度較低(1.09%)，而在CSP0中最高(59.80%)，經傳代后其豐度降低(CSP1 51.37%、CSP3 53.32%、CSP4 51.57%和CSP5 43.61%).乳酸桿菌屬在各代的豐度依次為3.31%(MCC)、0.31%(CSP0)、14.89%(CSP1)、21.88%(CSP3)、21.76%(CSP4)和19.27%(CSP5).此外，各代中其余菌屬Pseudomonas(假單胞菌屬)、Staphylococcus(葡萄菌屬)、Cronobacter(阪崎腸桿菌)等致病菌都僅有較低豐度.

巨菌草飼料發(fā)酵菌群的真菌在門水平上(圖2C)，各組優(yōu)勢菌門均為子囊菌門，傳至第5代時其相對豐度有所降低，此外各組間還存在豐度較低的擔子菌門和毛霉菌門，相比于CSP1中的擔子菌門(1.59%)和毛霉菌門，CSP3(4.42%)和CSP4(2.72%)中的擔子菌門豐度顯著增加(P<0.05)，而CSP3～CSP5中的毛霉菌門豐度均降低.在屬水平上(圖2D)，MCC中以木霉屬(97.78%)為主導，傳代后期豐度很低(豐度<0.5%).布氏白粉菌屬在各傳代階段(CSP1～CSP5)的豐度較高，該菌可能是菌草自身攜帶，在傳代中富集增加.Naganishia、Khuskia和Meyerozyma菌屬在CSP3(3.87%、5.82%和6.24%)和CSP4(1.68%、6.32和5.31%)中的相對豐度均顯著高于其他各組(P<0.05).Candida和Wickerhamomyces在CSP0的豐度較低但高于CSP3～CSP5.

A：細菌門；B：細菌屬；C：真菌門；D：真菌屬.圖2 細菌和真菌在門、屬水平的物種相對豐度柱形圖Fig.2 Histogram of relative abundance of bacteria and fungus at the phylum and genus level

2.9 傳代富集微生物群與巨菌草飼料營養(yǎng)品質的相關性分析

采用Spearman秩相關分析計算細菌和真菌(圖3A，3C)微生物系統類型與巨菌草飼料營養(yǎng)品質相關參數之間的相關性，并通過網絡可視化(細菌|r|>0.7，真菌|r|>0.5，P<0.05)(圖3B，3D).由圖3A和B可知，各組中豐度最高的泛菌屬與NH3-N/TN和BA呈負相關.CSP3和CSP4組中豐度較高的乳酸桿菌屬與pH、NDF、ADF呈負相關，與RFQ、CP、LA、LA/AA和BA呈正相關.片球菌屬與ADF呈正相關，腸球菌屬與RFQ呈負相關.Lachnospiraceae_NK4A136_group和Colidextribacter均與ADF呈正相關，與RFQ、LA、LA/AA和BA呈負相關.

由圖3C和D知，在CSP3和CSP4中相對豐度較高的Naganishia與pH、NDF、ADF呈負相關，與RFQ、CP、LA和LA/AA呈正相關，而Meyerozyma僅與NH3-N/TN呈負相關，Khuskia和Nigrospora與NDF呈負相關，與RFQ和LA呈正相關.在CSP3和CSP4中相對豐度極低的Candida和Wickerhamomyces與pH、NDF、ADF呈正相關，與RFQ、CP、LA呈負相關.

3 討論

有關研究表明，利用復合菌群發(fā)酵飼料易受溫度和接種量的直接影響.首先，菌群C富含乳酸菌屬、酵母菌等，過低或過高的溫度不利于有益菌的生長繁殖，還會延長發(fā)酵期，滋生有害菌.其次，飼料發(fā)酵是從有氧向無氧過程的轉化，接種量過多會使發(fā)酵初期菌體生長過快，耗盡營養(yǎng)物而不利于后期厭氧階段對營養(yǎng)物的轉化，增加成本；接種量過低則發(fā)酵期延長，生產速率低[22].相關調研指出，含水量和發(fā)酵時間也是飼料發(fā)酵的關鍵.基料的含水量過低，不易壓實導致空氣殘留量高，延長好氧期，使厭氧發(fā)酵期延后而不利于微生物的生長；含水量過高，則易滋生霉菌，更不利于飼料飼喂和貯存[23].再者，發(fā)酵時間過短，不利于飼料纖維物質的降解和粗蛋白的產生；而發(fā)酵時間過長，蛋白易被分解造成營養(yǎng)物質流失[24].因此，本試驗通過單因素確定了飼料最適發(fā)酵時間為9 d，經響應面試驗優(yōu)化獲得巨菌草飼料的最佳發(fā)酵工藝，使得飼料營養(yǎng)和品質均顯著提高；其中，發(fā)酵溫度對飼料營養(yǎng)品質的影響最大，含水量次之.

A：細菌的相關性熱圖； B：真菌的相關性熱圖.顏色變化代表了關聯程度.C：細菌的可視化相關網絡；D：真菌的可視化相關網絡.黃色節(jié)點：微生物屬；紅色節(jié)點：品質參數；藍色節(jié)點：營養(yǎng)參數；紅色實線：Spearman秩相關系數(細菌>0.6，真菌>0.5)，FDR調整P<0.05；灰色虛線：Spearman秩相關系數(細菌<-0.6，真菌<-0.5)，FDR調整P<0.05.線寬表示相關強度.圖3 巨菌草飼料營養(yǎng)品質與飼料微生物群間的Spearman相關性統計Fig.3 Spearman′s correlations between nutrient quality parameters and microbiota of C. fungigraminus feed

傳統復合菌飼料多采用單菌復配且比例明確的復合菌，對飼料原料(秸稈、花生秧等)的降解效果雖優(yōu)于單菌，但也不及一個自然存在或經自然選擇的菌群的降解能力[25]，并且復合菌也會因復配后組分不穩(wěn)定、優(yōu)勢菌群不突出而影響菌群功能的穩(wěn)定性[26].基于此，本文在探討最佳發(fā)酵工藝外，也對菌群進行傳代富集，以獲得組成穩(wěn)定的優(yōu)勢菌群.在傳至第1代時，飼料纖維降解效果較差，但pH明顯降低，說明菌群在短時間內對纖維物質的降解率低，但微生態(tài)環(huán)境pH的降低有利于后期微生物的生長繁殖.在傳至第3和第4代時，巨菌草發(fā)酵飼料的NDF、ADF含量和pH明顯降低，RFQ、CP含量、LA含量和LA/AA得到有效提高且趨于穩(wěn)定，說明此時飼料中的菌群生長較穩(wěn)定；第5代的OD顯著降低可能是由于傳代次數太多，優(yōu)勢菌群降低或有害菌增多，這有待依靠測序技術進一步分析驗證.傳代后巨菌草飼料的營養(yǎng)品質得到了明顯改善，第3代和第4代的菌群效果最佳.

飼料菌群經富集后，飼料營養(yǎng)品質有顯著提高，菌群的組成和多樣性也有著不同程度的變化.本試驗發(fā)現飼料中變形菌門的豐度較高，研究指出變形菌門是胃腸道的致病菌門，也有研究指出其與植物病蟲害防治、植物生長發(fā)育和產量有關[27-28]，彭田露[25]的研究證實稻殼堆肥樣品中變形菌門的豐度與水稻秸稈的降解率呈正相關，說明該菌門的存在有利于纖維物質的降解.此外，各代菌群中變化較大的是厚壁菌門和擬桿菌門.厚壁菌門屬于化能營養(yǎng)型，在木質纖維素的降解中起主導作用，可水解有機物產生短鏈脂肪酸、糖和蛋白質等[29].擬桿菌門是參與碳水化合物發(fā)酵的主要微生物，對有機物的降解起主導作用，能將纖維和糖類物質分解成脂肪酸[25,30].雖然CSP5中厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度增加，但CSP5的飼料的營養(yǎng)品質并不及CSP3和CSP4，這有可能與變形菌門豐度的降低有關.再者，從真菌組成來看，豐度較高的子囊菌門和擔子菌門是重要的真菌分解者，子囊菌門中的真菌屬能降解纖維素，同時擔子菌門能高效降解木質纖維素和多糖類物質[31].CSP5中飼料營養(yǎng)品質的下降也與這兩種菌門豐度的降低有關.此外，研究表明[32]，木霉屬屬于好氧型真菌，具有較強的纖維素分解能力，但飼料發(fā)酵過程僅在好氧發(fā)酵階段起作用，這也是發(fā)酵進入厭氧期后(CSP1～CSP5)該屬真菌豐度極低的原因.

為進一步揭示飼料菌群與營養(yǎng)品質參數之間的關系，進行了Spearman相關性分析.在相關性分析中，泛菌屬與NH3-N/TN和BA呈負相關.泛菌屬是兼性厭氧的化能異養(yǎng)菌，具有代謝和發(fā)酵功能，能降解D-葡萄糖和其他糖類產生酸；在傳代過程中泛菌屬的相對豐度逐漸降低，這與NH3-N/TN和BA含量逐漸增大的趨勢一致.此外，乳酸桿菌屬與pH、NDF、ADF呈負相關，與RFQ、CP、LA、LA/AA和BA呈正相關.乳酸桿菌屬為厚壁菌門下的一類異養(yǎng)厭氧型微生物，在飼料發(fā)酵的厭氧階段能將底物中的可溶性碳水化合物快速轉化為有機酸，降低微生態(tài)環(huán)境中的pH，以抑制其他致腐微生物分解底物的營養(yǎng)物質[33].這表明較高乳酸桿菌屬含量的CSP3和CSP4飼料中的pH較低，纖維物質含量明顯降低，飼料品質較優(yōu).在真菌中較重要的兩個菌屬是Naganishia和Meyerozyma;Naganishia與pH、NDF、ADF呈負相關，與RFQ、CP、LA和LA/AA呈正相關；而Meyerozyma與NH3-N/TN呈負相關.Naganishia屬于擔子菌門，表現出較好的纖維素酶和蛋白酶活性[34]，能將植物蛋白水解產生肽，有利于動物對營養(yǎng)的吸收，進而改善腸道健康[35].Meyerozyma屬于子囊菌門，能產生錳過氧化物酶，可有效降解木質纖維素，但銨類氮源或氮豐富的情況下會抑制酶的合成，產生“氨代謝物抑制”現象，不利于木質纖維素的降解[36].這很好地解釋了CSP3和CSP4飼料中ADF、NDF和NH3-N/TN較低的原因.

飼料發(fā)酵是多種微生物共同作用的過程，本研究中傳代富集的優(yōu)勢菌大多是厭氧或兼性厭氧菌，好氧真菌則集中在發(fā)酵前期，發(fā)酵后期并未被富集.綜上，傳代至第4代的菌群較穩(wěn)定且發(fā)酵的飼料營養(yǎng)品質皆優(yōu).

4 結論

(1)由單因素和響應面試驗優(yōu)化獲最佳發(fā)酵工藝：發(fā)酵溫度28 ℃、含水量60%、接種量2.6%.(2)傳代后的發(fā)酵巨菌草飼料的營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質得到明顯提高，第4代菌群較穩(wěn)定，且優(yōu)于響應面試驗結果.其NDF含量62.24%、ADF含量37.02%、RFQ 89.76%、CP含量10.41%、NH3-N/TN 為2.54%、pH 4.28、LA含量9.55%、LA/AA0.85、BA含量5.40%.(3)經富集巨菌草中飼料菌群的優(yōu)勢菌門是變形菌門、厚壁菌門和子囊菌門，飼料還增加了乳酸桿菌屬、泛菌屬、Naganishia、Khuskia和Meyerozyma等有益菌的相對豐度，進一步改善飼料營養(yǎng)和品質.

綜上，菌群傳至第4代的巨菌飼料營養(yǎng)品質、菌群結構和豐度較穩(wěn)定且最佳，則表明第4代菌群可作為巨菌草飼料的專用發(fā)酵菌群.