陳皮心血管藥理作用的網(wǎng)絡(luò)解析

郭 杰

(鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，河南 鶴壁 458030)

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是心臟及外周動(dòng)脈、靜脈、微血管等血液循環(huán)系統(tǒng)疾病的統(tǒng)稱.臨床上常見(jiàn)的CVD有高血壓、心肌病、心肌炎、冠心病、心臟瓣膜疾病等，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高等特點(diǎn)，已成為人類死亡的頭號(hào)病因[1].由于CVD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，單靶點(diǎn)藥物難以統(tǒng)籌兼顧，患者往往要服用抗凝、降壓、調(diào)脂等多種藥物.

中藥具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)和整體調(diào)節(jié)等特點(diǎn)，在CVD的預(yù)防和治療中具有很大潛力.陳皮(CitriReticulataePericarpium)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮，性溫，味辛、苦，歸脾經(jīng)、肺經(jīng)，具有理氣健脾、燥濕化痰等功效，主要用于治療消化系統(tǒng)脾胃氣滯、嘔吐、呃逆[3]，以及呼吸系統(tǒng)濕痰、寒痰所致的咳嗽[4].近年研究[5-7]發(fā)現(xiàn)陳皮的很多化學(xué)成分，特別是黃酮類，具有調(diào)血脂、抑制血小板聚集、抗凝、抗炎、抗氧化等多種心血管藥理效應(yīng)，但具體機(jī)制仍不清晰.本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探究陳皮治療心血管疾病的藥效物質(zhì)、作用靶點(diǎn)、生物過(guò)程及信號(hào)通路，以期系統(tǒng)闡釋陳皮治療CVD的科學(xué)內(nèi)涵，為其臨床應(yīng)用拓展提供證據(jù).

1 資料與方法

1.1 陳皮活性成分及成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.Php)收集陳皮的主要化學(xué)成分，根據(jù)OB≥30% 和 DL≥0.18初篩候選化學(xué)成分，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充活性成分.以陳皮活性成分為研究對(duì)象，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索活性成分已知靶點(diǎn)，利用Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找活性成分的3D分子結(jié)構(gòu)式，將.SDF格式導(dǎo)入DTPS靶點(diǎn)預(yù)測(cè)系統(tǒng)(http://demo.dtps.iprexmed.com/#/index)找出活性成分潛在靶點(diǎn)；再運(yùn)用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)將靶點(diǎn)統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為基因名稱.將上述兩個(gè)來(lái)源的基因合并，構(gòu)建陳皮靶基因集合，最后利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建陳皮活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò).

1.2 陳皮治療CVD相關(guān)基因庫(kù)的構(gòu)建

運(yùn)用GeneCards、DisGeNET、OpenTargets數(shù)據(jù)庫(kù)獲取CVD相關(guān)基因；將獲取的CVD基因按照相關(guān)性分值依次取排名前100的基因，篩除重復(fù)后合并，構(gòu)建CVD基因庫(kù).利用Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對(duì)CVD相關(guān)靶點(diǎn)與陳皮活性成分靶點(diǎn)映射取交集，確定陳皮治療CVD的靶點(diǎn).

1.3 靶蛋白相互作用研究

利用String平臺(tái)(https://string-db.org/)研究陳皮治療CVD靶蛋白間的相互作用(protein-protein interaction，PPI)，將蛋白種類設(shè)置“Homo Sapiens”進(jìn)行操作，最低相互作用閥值設(shè)為“medium confidence =0.4”，其余參數(shù)保持默認(rèn)，結(jié)果保存為.TSV格式并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，再利用“Network Analysis” 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?，設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小反映度值(degree)變化，邊的粗細(xì)反映介度值(betweenness)大小，建立靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò).

1.4 基因本體(Gene Ontology，GO)分析

運(yùn)用 Cytoscape 3.7.2 軟件中“ClueGO”插件對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，探討關(guān)鍵靶點(diǎn)在體內(nèi)可能實(shí)現(xiàn)的生物分子過(guò)程.設(shè)置：定義來(lái)源為“Homo sapiens”(智人)，P值≤0.05，Interval Min Level =2，Max Level =3；選擇生物過(guò)程(biological process)模塊對(duì)基因進(jìn)行生物功能注釋.

1.5 KEGG通路研究

通路分析能顯示蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中不同信號(hào)通路的重要性程度，本研究利用DAVID平臺(tái)(Version 6.8)結(jié)合Omicshare數(shù)據(jù)庫(kù)篩選核心通路，將結(jié)果以氣泡圖形式呈現(xiàn)，并根據(jù)富集因子值分析核心通路富集程度，以探究陳皮治療CVD可能的作用機(jī)制.其中，節(jié)點(diǎn)大小表示富集的靶點(diǎn)數(shù)量.

2 結(jié)果

2.1 陳皮活性成分及活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

按照OB≥30%和DL≥0.18篩選活性成分，雖然橙皮苷、柚皮苷、檸檬烯和辛弗林等陳皮成分的OB值或DL值較低，但它們含量較高且文獻(xiàn)[8-10]證實(shí)它們確有藥理活性，故最終納入11個(gè)活性成分，見(jiàn)表1.根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，11個(gè)活性成分可分為黃酮類(柚皮素、橙皮素、米橘素、川陳皮素、橙皮苷、桔皮素、柚皮苷)、揮發(fā)油類(檸檬烯、α-蒎烯)和生物堿類(辛弗林、N-甲基酪胺).

表1 陳皮活性成分及其信息

圖1系活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，共有223個(gè)節(jié)點(diǎn)和275條邊.其中7個(gè)箭頭節(jié)點(diǎn)代表黃酮類成分，2個(gè)八邊形節(jié)點(diǎn)代表?yè)]發(fā)油類成分，2個(gè)菱形節(jié)點(diǎn)代表生物堿類成分，212個(gè)圓形節(jié)點(diǎn)代表陳皮的作用靶點(diǎn)，275條邊代表陳皮活性成分對(duì)靶點(diǎn)的作用.

圖1 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.2 陳皮活性成分治療CVD靶點(diǎn)分析

從TCMSP平臺(tái)和DTPS靶點(diǎn)預(yù)測(cè)系統(tǒng)獲得212個(gè)活性成分作用靶點(diǎn)；綜合GeneCards、DisGeNET、OpenTargets數(shù)據(jù)庫(kù)篩得232個(gè)CVD靶點(diǎn).如圖2所示，應(yīng)用Venny 2.1將兩者映射取交集得到陳皮治療CVD靶點(diǎn)32個(gè)，依據(jù)靶點(diǎn)功效可分為炎癥反應(yīng)類、血壓調(diào)節(jié)類、糖脂代謝類、凝血纖溶類以及離子通道類等，均與心血管系統(tǒng)主要病理機(jī)制密切相關(guān)，見(jiàn)表2.

圖2 成分-CVD靶點(diǎn)韋恩圖

表2 陳皮治療CVD靶點(diǎn)的歸類

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

如圖3所示，32個(gè)CVD治療靶點(diǎn)均參與了PPI網(wǎng)絡(luò)，248條連線代表了靶點(diǎn)間的相互作用，其中度值較大的靶點(diǎn)包括蛋白激酶B(degree=27)、一氧化氮合酶(degree=24)、腫瘤壞死因子(degree=23)、載脂蛋白E(degree=22)、內(nèi)皮素-1(degree=22)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(degree=22)、細(xì)胞腫瘤抗原p53(degree=21)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(degree=21)、瘦素(degree=21)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(degree=21)、白細(xì)胞介素-1β(degree=21)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(degree=21)、脂聯(lián)素基因(degree=20)、細(xì)胞間黏附分子1(degree=20)等，說(shuō)明上述靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中處于主要位置，可能是陳皮活性成分治療CVD的關(guān)鍵靶點(diǎn).

圖3 靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO富集注釋

32個(gè)靶點(diǎn)參與了113個(gè)GO條目，包含610條層級(jí)關(guān)系連線，可分為活性氧生物合成過(guò)程(34.74%)、脂質(zhì)代謝過(guò)程正向調(diào)控(14.74%)、小分子代謝過(guò)程正向調(diào)控(8.95%)、脂質(zhì)定位(8.95%)、血液凝固(6.84%)、平滑肌細(xì)胞增殖(5.26%)、平滑肌細(xì)胞增殖調(diào)控(3.68%)、肌肉適應(yīng)(3.16%)、活性氮代謝過(guò)程(3.16%)、氧化還原酶活性調(diào)控(2.63%)、平滑肌適應(yīng)性(2.63%)、平滑肌細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控(2.11%)、脂肪蓄積負(fù)調(diào)控(1.58%)、飲食過(guò)量的反應(yīng)(0.53%)、血壓調(diào)節(jié)(0.53%)、寒冷反應(yīng)(0.53%)等16大類，見(jiàn)圖4、圖5.

圖4 GO功能注釋網(wǎng)絡(luò)

圖5 GO功能注釋餅狀圖

2.5 KEGG信號(hào)通路分析

KEGG信號(hào)通路富集共篩出16條與CVD形成、發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)通路，結(jié)果見(jiàn)表3.其中富集因子(Richfactor，靶基因/該通路所有基因的數(shù)量)較大的包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)、cGMP-PKG信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、胰島素抵抗、MAPK信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞脂解的調(diào)控、mTOR 信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)等，見(jiàn)圖6.

表3 KEGG信號(hào)通路

圖6 KEGG信號(hào)通路點(diǎn)狀圖

3 討論

CVD是全球發(fā)病率最高的非傳染性疾病之一，也是人類致死、致殘的主要原因.據(jù)估算，中國(guó)現(xiàn)有2.9億CVD患者，CVD的患病率和死亡率持續(xù)上升，占居民疾病死因首位，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[11].臨床治療CVD的藥物主要有他汀類降脂藥、阿司匹林等抗血小板聚集藥，以及多種降壓藥等[12]，但這些藥物在使用中存在一定的不良反應(yīng)及耐藥現(xiàn)象[13].

陳皮具有調(diào)血脂[14]、抗血栓[15]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[16]、心肌保護(hù)[17]等多重心血管藥理作用，但具體藥效物質(zhì)和作用機(jī)制尚未系統(tǒng)明確.本研究發(fā)現(xiàn)陳皮作用于ESR1和NOS3等調(diào)節(jié)血壓；作用于APOB和PPARG等調(diào)節(jié)脂代謝；作用于F2和PLG等平衡凝血纖溶系統(tǒng)；作用于SCN5A、KCNQ1等離子通道抗心律失常.研究[18-19]表明ESR1可促進(jìn)NOS3的表達(dá)，進(jìn)而增加血管內(nèi)NO釋放來(lái)舒張血管；而NOS3的+G894T多態(tài)性位點(diǎn)則可能是高血壓繼發(fā)左室肥厚遺傳易感性的標(biāo)志之一.冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者血漿中APOB水平明顯升高[20]，PPARG缺乏的小鼠很容易發(fā)生嚴(yán)重的脂肪代謝異常[21].此外，SCN5A、KCNQ1基因突變均會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常[22-23].這些靶點(diǎn)涉及的活性成分主要包括柚皮苷、柚皮素、橙皮素、橙皮苷等，實(shí)驗(yàn)[24]證實(shí)橙皮苷可降低高血脂大鼠血清總膽固醇、低密度脂蛋白水平，升高高密度脂蛋白水平；抑制由膠原、花生四烯酸、ADP和凝血酶誘導(dǎo)的大鼠血小板凝聚，延長(zhǎng)小鼠尾靜脈出血時(shí)間.橙皮素可減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變[25]；促進(jìn)脂肪酸氧化和三羧酸循環(huán)，降低肝內(nèi)脂肪酸的量.劉正兵等[26]還發(fā)現(xiàn)橙皮苷、橙皮素及其衍生物可抗心肌凋亡、抑制血管平滑肌增殖、遷移，在心肌損傷、心臟重構(gòu)、心肌缺血、梗死等方面均有良好作用.柚皮苷主要通過(guò)抑制VCAM-1、MCP-1和ICAM-1表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞滲入、平滑肌細(xì)胞增殖、免疫細(xì)胞黏附、內(nèi)皮功能紊亂，減少高脂動(dòng)物血管斑塊的發(fā)展，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[27].與此同時(shí)，柚皮素、柚皮苷可使小鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊中SRA、LOX-1和ACAT1表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[28].

GO富集分析發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)主要富集在血脂調(diào)節(jié)方面的脂質(zhì)代謝過(guò)程正調(diào)控、脂質(zhì)定位、脂肪蓄積負(fù)調(diào)控，血管平滑肌方面的平滑肌細(xì)胞增殖、平滑肌細(xì)胞增殖調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控，氧化損傷方面的活性氧生物合成過(guò)程、氧化還原酶活性調(diào)控，以及血液凝固、血壓調(diào)節(jié)等.這些生物過(guò)程大都與CVD密切相關(guān)，如血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生具有重要作用[29]；活性氧(ROS)是體內(nèi)細(xì)胞重要的第二信使，研究[30]證實(shí)其在體內(nèi)的生物合成和抗氧化防御體系的不平衡會(huì)導(dǎo)致人體代謝性疾病和心血管疾病中的血管損傷.KEGG富集包括脂肪代謝相關(guān)的PPAR信號(hào)通路和脂肪細(xì)胞脂解調(diào)控；血凝調(diào)控的補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)；心血管調(diào)控的VEGF、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)通路；炎癥調(diào)控的TNF和NF-kB信號(hào)通路；以及雌激素、胰島素抵抗等內(nèi)分泌通路.這些KEGG通路與GO生物過(guò)程相互印證，顯示陳皮活性成分通過(guò)調(diào)血脂、抗炎、抗血栓、心肌保護(hù)等多個(gè)效應(yīng)治療CVD.如NF-κB信號(hào)通路的異常激活與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[31]，抑制NF-κB信號(hào)通路可減少ICAM-1、VCAM-1等基因的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮延緩動(dòng)脈粥樣硬化病變的作用[32].目前已證實(shí)，VEGF對(duì)維持正常血壓具有重要的作用，其可促使血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮和前列腺素等繼而使血管舒張、血壓降低[33].另外，經(jīng)研究[34]發(fā)現(xiàn)β腎上腺素受體與心衰的發(fā)生密切相關(guān)，其機(jī)制可能是通過(guò)腎上腺素能信號(hào)通路改變、交感神經(jīng)興奮等過(guò)程實(shí)現(xiàn).

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建陳皮活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，富集靶點(diǎn)GO生物過(guò)程及KEGG通路，進(jìn)而預(yù)測(cè)到陳皮抗炎、抗氧化、抗凝、保護(hù)心肌，以及調(diào)節(jié)血脂等心血管藥理作用，為陳皮治療CVD的實(shí)驗(yàn)研究提供了方向與線索.