王尊憲 陳慧穎 竇鵬揮

免疫腫瘤學(xué)（IO）是腫瘤治療的基石。目前檢查點(diǎn)抑制劑（CI）是多種轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤的一線治療方式，其在輔助和新輔助治療中的應(yīng)用價值正逐步增大。然而，現(xiàn)有的全身免疫治療存在局限性，療效很大程度上取決于抗原特異性效應(yīng)T 細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，而效應(yīng)T 細(xì)胞必須克服物理和生化障礙以發(fā)揮其效應(yīng)功能。致密的腫瘤基質(zhì)、抑制性趨化因子、細(xì)胞因子譜以及多種免疫抑制細(xì)胞類型的存在形成免疫抑制腫瘤微環(huán)境（TME），而CI 單藥治療無法克服免疫抑制的TME。目前，研究者已經(jīng)開展了將免疫抑制TME 轉(zhuǎn)化為免疫原性TME 的新的治療模式的研究。

人瘤內(nèi)免疫治療（HIT-IT）是一種很有前途的治療策略，其在克服全身免疫治療缺陷的同時直接解決免疫抑制TME[1，2]。HIT-IT 代表了一個廣泛的治療類別，盡管所有的治療藥物都是通過局部注射進(jìn)入腫瘤[3]，但其作用機(jī)制各不相同。這種治療方法的優(yōu)點(diǎn)為：首先，HIT-IT 不受藥代動力學(xué)的影響，局部注射藥物的濃度比全身可耐受的濃度高許多倍，并且能夠降低全身毒性，而局部注射也為一些無法進(jìn)行全身治療的患者提供新選擇。其次，HITIT 可以誘導(dǎo)抗原呈遞和免疫細(xì)胞啟動，在免疫原性差的腫瘤中尤為重要。與CI 的機(jī)制不同，后者一般依賴于激活預(yù)先存在的抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞。再者，HIT-IT 可以規(guī)避TME 誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞運(yùn)輸和遷移的錯亂機(jī)制。此外，還可以設(shè)計(jì)出誘導(dǎo)免疫細(xì)胞募集到TME 的治療方法。局部療法的主要目標(biāo)是在非注射腫瘤中誘導(dǎo)免疫介導(dǎo)效應(yīng)，或所謂的無內(nèi)源性（如體外）效應(yīng)[1，3]。目前研究最充分的HIT-IT 只有FDA 批準(zhǔn)的Talimogene laherparepvec（T-VEC），誘導(dǎo)注射的黑色素瘤病變快速消退，但對于非注射部位的療效并不明顯[4]，但因需要反復(fù)注射限制了其在常見腫瘤中的應(yīng)用。

腫瘤消融是目前腫瘤治療的新技術(shù)，并且有潛在的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤消融技術(shù)的機(jī)制各不相同，但其治療效果主要是通過破壞局部腫瘤來實(shí)現(xiàn)的。消融后的腫瘤組織留在原位，炎癥介質(zhì)、損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）和其他免疫調(diào)節(jié)因子被釋放[5]。大量的腫瘤抗原可供抗原提呈細(xì)胞處理[6]。雖然在某些類型的腫瘤如肝細(xì)胞癌[7]中消融能夠誘導(dǎo)微弱的免疫作用，但單純消融的免疫刺激作用通常不足以產(chǎn)生持久的抗腫瘤免疫反應(yīng)。目前消融與IO[8]聯(lián)合使用增強(qiáng)免疫治療已進(jìn)入了臨床前研究階段。隨著腫瘤消融的免疫調(diào)節(jié)作用得到更好的定義和新型HIT-IT 的開發(fā)，聯(lián)合治療模式可能具有獨(dú)特的協(xié)同潛力。

1 HIT-IT 聯(lián)合腫瘤消融治療策略

1.1 病毒介導(dǎo)的治療策略一個多世紀(jì)以來，溶瘤病毒一直處于研究其直接溶瘤的潛力，但最近的研究集中于其誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的能力。T-VEC 是一種轉(zhuǎn)基因單純性皰疹1 型病毒，是首個獲得FDA 批準(zhǔn)（2015 年）的溶瘤病毒，并應(yīng)用于治療晚期黑色素瘤。研究者提出了多種增強(qiáng)T-VEC 免疫效果的策略，包括聯(lián)合應(yīng)用CI，但Ⅱ期臨床試驗(yàn)的結(jié)果并不理想[9]。已發(fā)表的臨床前研究已經(jīng)證實(shí)了溶瘤病毒和腫瘤消融的潛在協(xié)同作用。Sun 等[10]在胰腺癌小鼠模型中研究了Alphavirus M1 與不可逆電穿孔（IRE）聯(lián)合使用，結(jié)果表明，該病毒增強(qiáng)了IRE 的治療效果，并誘導(dǎo)了全身T 細(xì)胞免疫反應(yīng)。主要機(jī)制是IRE 誘導(dǎo)的細(xì)胞膜孔隙度增強(qiáng)了病毒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的能力，并且具有基質(zhì)修飾效應(yīng)，可使病毒能夠更好地進(jìn)入TME 內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。雖然這種特殊的溶瘤病毒在臨床應(yīng)用上存在局限性，但這項(xiàng)研究表明IRE 憑借其獨(dú)特的作用機(jī)制，使TME 產(chǎn)生變化，增強(qiáng)腫瘤的病毒感染。

溶瘤病毒和腫瘤消融在治療機(jī)制上是相悖的，因消融治療的目的是摧毀腫瘤細(xì)胞，而溶瘤病毒需要宿主腫瘤細(xì)胞存活才能復(fù)制。Yamada 等[11]使用了新輔助治療方法，首先用溶瘤性皰疹病毒G47delta 治療腫瘤，然后再進(jìn)行射頻消融。他們在肝細(xì)胞癌小鼠模型中使用了該方法，結(jié)果表明聯(lián)合治療在原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤中都產(chǎn)生了強(qiáng)大的CD8+T 細(xì)胞依賴性免疫反應(yīng)。接受聯(lián)合治療的小鼠也能夠抵抗腫瘤的復(fù)發(fā)，表明具有持久的腫瘤特異性免疫。

1.2 細(xì)胞介導(dǎo)的治療策略過繼細(xì)胞免疫療法（ACT）在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤方面已顯示出卓越的臨床療效，在實(shí)體瘤中的應(yīng)用也在進(jìn)行中。評估轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞療法（TILS）的多個Ⅲ～Ⅳ期的臨床實(shí)驗(yàn)也在進(jìn)行中，其他基于細(xì)胞的免疫療法也在早期試驗(yàn)中。

局限過繼細(xì)胞免疫療法（ACT）治療實(shí)體瘤是通過瘤內(nèi)注射免疫細(xì)胞與腫瘤消融相結(jié)合。靜脈注射免疫細(xì)胞必須運(yùn)輸并滲透到腫瘤組織中，才能發(fā)揮其效應(yīng)因子功能，但這一過程往往被免疫原性差的腫瘤所抑制。腫瘤內(nèi)遞送的免疫細(xì)胞可以繞過致密腫瘤基質(zhì)形成的物理屏障，不需要通過血液運(yùn)輸，并且克服TME[12]中的免疫抑制信號。瘤內(nèi)注射免疫細(xì)胞與腫瘤消融相結(jié)合可以增強(qiáng)ACT 的瘤內(nèi)浸潤。在治療細(xì)胞被輸送前，分解腫瘤基質(zhì)并摧毀TME 中的免疫抑制細(xì)胞。許多免疫原性差的腫瘤不能產(chǎn)生足夠的抗原來產(chǎn)生強(qiáng)大的原發(fā)免疫反應(yīng)，而腫瘤消融可用于產(chǎn)生大量的抗原，這些抗原可立即通過瘤內(nèi)注射的APCs[13]進(jìn)行處理。

瘤內(nèi)ACT 和腫瘤消融的聯(lián)合治療策略已經(jīng)進(jìn)行了臨床前研究。Machlenkin 等[14]在肺癌和黑色素瘤的小鼠模型中使用冷凍治療和注射樹突細(xì)胞，雖然單獨(dú)的樹突狀細(xì)胞治療增加了CD8+T 細(xì)胞的增殖，但只有聯(lián)合治療產(chǎn)生效應(yīng)記憶細(xì)胞。接受聯(lián)合治療的小鼠存活時間更長，對隨后的腫瘤復(fù)發(fā)具有更強(qiáng)的抵抗力，表明聯(lián)合治療具有持久的免疫反應(yīng)。該研究主要優(yōu)勢是使用了未成熟的未負(fù)載樹突狀細(xì)胞。目前的樹突狀細(xì)胞ACT 大多采用裝載腫瘤抗原或體外轉(zhuǎn)基因的成熟樹突狀細(xì)胞，增加了研究的復(fù)雜性。相比之下，該研究中使用的樹突狀細(xì)胞不需要裝載抗原，可操作性高，可節(jié)省大量的時間和成本。此外，成熟的、裝載抗原的樹突狀細(xì)胞交叉呈現(xiàn)抗原和誘導(dǎo)抗原擴(kuò)散的能力可能較弱，而這對持久的免疫介導(dǎo)反應(yīng)[15]至關(guān)重要。

Udagawa 等[16]在瘤內(nèi)注射小鼠轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌模型之前用卡介苗細(xì)胞壁骨架（BCG-CWS）短暫培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞。與未成熟的樹突狀細(xì)胞相比，培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞治療的小鼠腫瘤浸潤性CD8+T 細(xì)胞增加。此外，腫瘤的消退和對腫瘤再復(fù)發(fā)的抵抗力也顯著增強(qiáng)。該研究表明存在原始抗原的樹突狀細(xì)胞更適合用于瘤內(nèi)免疫治療聯(lián)合消融。Nakagawa 等[17]在這一領(lǐng)域進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)了一種從A 族鏈球菌中提取的新型制劑OK432，通過TLR3、TLR4 和B2 整合素刺激樹突狀細(xì)胞，基于早期使用經(jīng)肝動脈靶向治療的研究，使用OK432 刺激的樹突狀細(xì)胞聯(lián)合消融治療肝細(xì)胞癌（HCC）。臨床前研究中OK432 刺激的樹突狀細(xì)胞的療效顯著，隨后進(jìn)行了第一項(xiàng)人體隨機(jī)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)[18]。在這項(xiàng)試驗(yàn)中，30 例患者在RFA時隨機(jī)接受未成熟樹突狀細(xì)胞或OK432 刺激樹突狀細(xì)胞的瘤內(nèi)注射，接受刺激樹突狀細(xì)胞治療的患者無復(fù)發(fā)生存期明顯更長，但總生存期沒有顯著差異。關(guān)于乳腺癌消融研究[19]中直接注射OK432 也有類似的抗腫瘤免疫反應(yīng)，OK432 在體直流電刺激是否與體外刺激一樣有效還有待確定，但已有發(fā)現(xiàn)其具有進(jìn)一步研究的價值。

雖然有明確的理論基礎(chǔ)將消融和抗原提呈細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療相結(jié)合，但很少有研究評估非抗原提呈免疫細(xì)胞聯(lián)合消融治療的效果。Lin 等[20]研究了異體NK 細(xì)胞聯(lián)合不可逆電穿孔治療局部晚期胰腺癌，12 例中有6 例在聯(lián)合治療后無進(jìn)展和總生存期得到改善。Alnaggar 等[21]在Ⅳ期肝細(xì)胞癌患者中進(jìn)行了類似的Ⅰ期研究，顯示了相對適度的生存獲益。但非抗原提呈細(xì)胞介導(dǎo)的瘤內(nèi)細(xì)胞過繼療法和消融聯(lián)合治療并沒有實(shí)質(zhì)性的療效。

1.3 模式識別受體（PRR）激動劑PRR 主要由抗原提呈細(xì)胞表達(dá)，能夠調(diào)節(jié)病原體的炎癥反應(yīng)。PRR的作用是識別感染環(huán)境下的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），以及應(yīng)激或死亡細(xì)胞釋放的內(nèi)源性細(xì)胞DAMPs。瘤內(nèi)PRR 激動劑聯(lián)合消融具有明顯的協(xié)同作用潛力。通過將PRR 激動劑運(yùn)送到消融部位，可能起到原位疫苗佐劑的作用，增強(qiáng)消融部位釋放的抗原的免疫應(yīng)答作用。Behm 等[22]對于RFA 和瘤內(nèi)注射CpG-ODN 的研究證實(shí)經(jīng)RFA 和CpG-ODN治療的肝細(xì)胞癌的兔存活時間明顯更長，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移較少。但單獨(dú)使用CpG-ODN 治療會導(dǎo)致Th1 免疫刺激細(xì)胞因子（如IL-2 和IFNy）和免疫抑制細(xì)胞因子（如IL-10）的上調(diào)，會產(chǎn)生整體的耐藥免疫表型。消融治療誘導(dǎo)了DAMPs 的釋放，如熱休克蛋白，與CpG-ODN 相結(jié)合，促進(jìn)了強(qiáng)大的Th1 免疫反應(yīng)。den Brok 等[23]在小鼠黑色素瘤模型中使用冷凍消融和TLR9 激動劑產(chǎn)生了類似結(jié)果，并對協(xié)同作用機(jī)制做了詳細(xì)闡述。單獨(dú)消融導(dǎo)致腫瘤引流淋巴結(jié)中的樹突狀細(xì)胞成為抗原載體，但TLR9 激動劑的加入導(dǎo)致CD80 表達(dá)增加，提示樹突狀細(xì)胞成熟及增殖。此外，聯(lián)合治療組小鼠的樹突狀細(xì)胞能夠有效地將抗原交叉呈遞給MHC 限制的T 細(xì)胞亞群。

盡管Toll 樣受體（TLR）激動劑有望與腫瘤消融聯(lián)合使用，但可能會引起明顯的脫靶效應(yīng)。TLR激動劑在某些腫瘤類型和T 細(xì)胞亞群上有表達(dá)，通過這些細(xì)胞受體發(fā)出信號可以促進(jìn)腫瘤增殖和免疫逃避。下游免疫效應(yīng)取決于靶向TLR 激動劑的類型，如TLR4 激動劑增強(qiáng)免疫抑制調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的增殖和活性，而TLR1/2 和TLR8 激動劑降低Tregs[24]的抑制作用。平衡TLR 激動劑復(fù)雜的下游效應(yīng)是影響其臨床潛力的主要因素。

相關(guān)研究正在評估其他PRR 途徑的治療潛力。干擾素基因激動劑（STING）是一種細(xì)胞內(nèi)PRR，可識別胞質(zhì)DNA 并刺激1 型干擾素的產(chǎn)生。STING途徑主要通過宿主免疫細(xì)胞攝取和對腫瘤源性DNA 的識別，在內(nèi)源性抗腫瘤先天免疫中發(fā)揮核心作用。激活該通路可誘導(dǎo)產(chǎn)生1 型干擾素，并通過1 型干擾素調(diào)節(jié)廣泛的局部和全身免疫功能，包括DC 成熟、T 細(xì)胞啟動、趨化性和進(jìn)一步的細(xì)胞因子產(chǎn)生[25]。STING 激動劑在臨床前研究中顯示出抗腫瘤作用[26]；由于這些藥物的免疫刺激作用最初發(fā)生在腫瘤微環(huán)境中的樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，增強(qiáng)其效果的一種新方法是與不可逆性電穿孔結(jié)合，這種結(jié)合理論基礎(chǔ)是不可逆性電穿孔可滲透細(xì)胞膜，并允許陰離子STING 激動劑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞吞噬裝載STING 激動劑的瀕死腫瘤細(xì)胞，此時通路受到刺激。有研究評估了STING/IRE 的聯(lián)合治療療效并證實(shí)了其強(qiáng)大的協(xié)同作用。Go 等[27]使用小鼠肺癌模型證明，聯(lián)合STING/IRE 導(dǎo)致TME中活化的DC、CD4+和CD8+T 細(xì)胞和M1 巨噬細(xì)胞增加，而M2 免疫抑制巨噬細(xì)胞減少。Lasarte-Cia等[28]在黑色素瘤和肝細(xì)胞癌模型中也顯示了類似的結(jié)果?；谶@些研究的初步數(shù)據(jù)和協(xié)同作用的明確機(jī)制基礎(chǔ)，STING 和不可逆性電穿孔值得進(jìn)一步研究。

1.4 生物材料越來越多的研究將合成生物材料用作免疫調(diào)節(jié)劑，其中許多新型材料適合局部給藥。Zhou 等[29]開發(fā)了一種甘露糖衍生的碳點(diǎn)納米顆粒，可促進(jìn)腫瘤抗原向抗原提呈細(xì)胞的遞送，并且表明納米顆粒在肝細(xì)胞癌小鼠模型中有效地捕獲了微波消融后釋放的抗原和DAMP，在捕獲抗原和損傷信號后，納米顆粒靶向樹突狀細(xì)胞，刺激其成熟，并導(dǎo)致T 細(xì)胞活化增強(qiáng)，聯(lián)合治療后腫瘤消退顯著和對腫瘤復(fù)發(fā)的抵抗力增強(qiáng)。使用裝載有吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）抑制劑的磁性納米簇，在注射納米團(tuán)簇后遞送時會誘導(dǎo)局部磁場，從而增強(qiáng)直接腫瘤破壞并觸發(fā)IDO 抑制劑的釋放，誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞增加和浸潤腫瘤的Treg 減少。先進(jìn)生物材料能夠在腫瘤治療中發(fā)揮作用，并且可以設(shè)計(jì)用于增強(qiáng)現(xiàn)有的消融療法的合成生物材料。

小分子合成生物材料在與消融結(jié)合的治療策略的療效也在研究中。Chen 等[30]將刺激樹突狀細(xì)胞吞噬的rho-associated kinase（ROCK）抑制劑與消融治療后捕獲腫瘤抗原的水凝膠聚合物結(jié)合。該聚合物導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞抗原攝取增加，并在細(xì)胞質(zhì)中逐漸釋放ROCK 抑制劑，從而導(dǎo)致小鼠黑色素瘤模型中的腫瘤消退和小鼠存活率增加。Yang等[31]設(shè)計(jì)了一種基于雙乳化脂氧化酶和Hemin 的治療方法，在消融治療后注射時，不斷產(chǎn)生細(xì)胞毒性脂自由基，同時使用腫瘤碎片作為燃料。腫瘤殺傷、腫瘤燃料納米反應(yīng)器產(chǎn)生了更有效的殘余局部腫瘤破壞，誘導(dǎo)多個小鼠細(xì)胞系的抗腫瘤免疫。Korbelik 等[32]將N-二氫半乳糖殼聚糖的變體在瘤周注射并與消融相結(jié)合，已被證明可通過多種機(jī)制誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。該聚合物引起抗原隔離、APCs 的募集和刺激，從而誘導(dǎo)Th1 T 細(xì)胞免疫反應(yīng)。

1.5 細(xì)胞因子瘤內(nèi)細(xì)胞因子注射聯(lián)合腫瘤消融也有相關(guān)研究報道。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）可激活A(yù)PCs，并觸發(fā)全身抗腫瘤反應(yīng)。T-VEC 的潛在機(jī)制依賴于直接的病毒腫瘤溶解以及GM-CSF 介導(dǎo)的APC 刺激。將GM-CSF 或其他細(xì)胞因子與腫瘤消融結(jié)合的研究通過類似的機(jī)制產(chǎn)生抗腫瘤免疫效應(yīng)。Chen 等[33]將腫瘤內(nèi)GMCSF 微球與微波消融和CTLA-4 阻斷相結(jié)合，證明了由CD4+、CD8+和NK 細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。其他研究中提到的IL-2[34]、IL-7和IL-15[35]聯(lián)合消融在動物模型中顯示出了一定效果，這種治療在小鼠結(jié)腸癌模型中誘導(dǎo)了腫瘤消退和免疫記憶。

2 機(jī)遇和挑戰(zhàn)

瘤內(nèi)免疫治療聯(lián)合腫瘤消融給腫瘤治療帶來了獨(dú)特的機(jī)遇和挑戰(zhàn)，聯(lián)合治療策略在臨床前研究的療效方面取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，雖已完成的轉(zhuǎn)化研究很少，但成果顯著。聯(lián)合治療模式在日益復(fù)雜和有效的免疫治療模式中發(fā)揮的作用仍然存在疑問。隨著新的免疫治療藥物的開發(fā)，在無法耐受全身給藥的情況下，研究瘤內(nèi)免疫治療及腫瘤消融治療是目前研究的熱點(diǎn)。

CI 已被證實(shí)在免疫原性差的腫瘤中療效有限，特別是免疫沙漠表型[36]的腫瘤。這些腫瘤的特點(diǎn)是腫瘤突變低，抗原數(shù)量少，T 細(xì)胞啟動差，導(dǎo)致腫瘤浸潤效應(yīng)T 細(xì)胞（TIL）總體缺乏。在免疫原性較差的腫瘤中，利用瘤內(nèi)免疫和消融聯(lián)合促進(jìn)TIL 浸潤的方法可能有益于CI 的聯(lián)合應(yīng)用[37]。很少有臨床試驗(yàn)同時研究瘤內(nèi)免疫治療和消融聯(lián)合全身治療。荷蘭研究者聯(lián)合使用IRE、nivolumab 和一種瘤內(nèi)TLR9 激動劑，目前正在招募（PANFIRE-3）中[38]。更復(fù)雜的多模式療法，雖然實(shí)施起來具有挑戰(zhàn)性，但在理論上是可行的。

目前需要有效的、潛在的影像學(xué)方法來評估這種情況下的治療反應(yīng)（如ctDNA），盡管存在挑戰(zhàn)，轉(zhuǎn)移性疾病患者尤其有可能受益于HIT-IT 和消融聯(lián)合誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。