劉 宇

（云南醫(yī)藥健康職業(yè)學院，云南·昆明 650000）

據(jù)報道，2019 年，全球估算新發(fā)結核病例996萬，其中141萬死亡病例，排名前三位的結核病新發(fā)患者高負擔國家分別是，印度（264 萬），印度尼西亞（84.5 萬），中國（83.3 萬）[1]。由于艾滋病、吸毒、免疫抑制劑、酗酒與貧困等原因，結核病的發(fā)病率又呈上升趨勢。結核病已成為艾滋病病人死亡的首要原因。結核桿菌可通過呼吸道、消化道及損傷的皮膚粘膜等多種途經(jīng)侵入易感機體，2019年報道的新發(fā)結核病例中，合并艾滋病的病例占比為8.2%[1]。結核病可引起多種組織器官的感染。結核桿菌在在與宿主的長期作用中，進化出了一系列獨特的抗壓力反應功能，使其能夠抵御巨噬細胞的吞噬和裂解而存活下來。結核桿菌既可以在細胞外存活，也可以在細胞內寄生。結核桿菌主要感染人體的巨噬細胞，其分泌的多種蛋白質成分在阻止巨噬細胞與溶酶體融合中起到重要作用。結核桿菌分泌的蛋白成分還可以干擾巨噬細胞的免疫反應，引起巨噬細胞的凋亡或壞死，從而使菌體自身得以生存[2]。在宿主免疫功能強大時，結核桿菌通過引起脂質成分的聚集，將自身包裝成一種潛伏狀態(tài)，從而避免機體巨噬細胞更強烈的免疫反應[3]。當宿主免疫功能低下時，處于休眠狀態(tài)的結核桿菌迅速被調動起來，進入激活狀態(tài)，繼續(xù)繁殖和感染機體。因此，研究菌體分泌蛋白的抗壓力反應機制，不僅有助于鑒定結核桿菌的致病基因，也為結核病的診斷和治療提供新的技術手段和思路。還可以闡明結核桿菌潛伏感染的作用機理，為研制新型抗結核藥物提供理論基礎。結核桿菌表面蛋白RbpA、Cas2和PPE19是近年來研究比較熱門的幾種菌體表面蛋白。

一、結核桿菌表面蛋白RbpA

利福平作為重要的一線抗結核藥物之一，其作用的靶點是結核桿菌負責基因轉錄的RNA 聚合酶。Paget 等在分離純化天藍鏈霉菌RNA 聚合酶時分離出一種新的RNA聚合酶結合蛋白，并將其命名為RbpA(RNAP binding protein)，并根據(jù)序列分析結果顯示，該蛋白僅存在于放線菌中[4]。Rb?pA是能夠與RNA聚合酶結合的蛋白質。

RbpA 與結核桿菌對利福平耐藥之間存在密切關系，RNA 聚合酶的高表達與結核桿菌對利福平的耐藥成正向相關。而RNA聚合酶的缺失或者基因突變則會導致菌體對利福平的敏感性增加。Chatterji 等對恥垢分枝桿菌的RbpA 蛋白的序列進行研究表明，過表達RbpA蛋白能明顯增加其對利福平的耐藥性，還利用Cross—link 方法證實RbpA 蛋白結合于RNA 聚合酶的D 亞基[5]。RbpA的蛋白序列結合位點與利福平的結合位點十分靠近。菌體對利福平的耐藥機制可能的解釋為RbpA是作為利福平的一種競爭結合蛋白而存在的[6]。而利福平與細菌的作用位點在空間結構上并不完全重合。因此推測，RbpA在利福平耐藥中的作用，并不是通過與利福平作用位點直接結合的形式。

二、結核桿菌表面蛋白Cas2

噬菌體在自然界中廣泛存在，結核桿菌依靠不斷進化的抗壓力反應機制來對抗噬菌體的威脅。CRISPR 系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）也是這一抗壓力反應機制中的一員，它廣泛存在于90%以上的古生菌和40%以上的細菌基因序列中[7]。對于結核分枝菌屬而言，CRISPR 系統(tǒng)只存在于致病性結核分枝桿菌，屬于致病菌對抗噬菌體的獲得性免疫機制的一部分。而Cas2 基因則位于CRISPR 系統(tǒng)的前導序列，它不同于CRISPR系統(tǒng)中那些短的重復基因系列，它屬于CRISPR系統(tǒng)基因序列中獨特的一部分[8]。Cas2 基因表達蛋白包括解旋酶和核糖核酸酶等，表面蛋白Cas2 功能各不相同。結核桿菌表面蛋白Cas2廣泛存在于含有CRISPR序列的微生物基因組中。Cas2 蛋白對于結核桿菌逃避巨噬細胞的免疫監(jiān)視、抗壓力反應以及抗生素抗性起著重要的作用。使用抗生素等可引起結核桿菌壓力反應的試劑處理后，菌體內部的Cas2蛋白表達會發(fā)生明顯變化[9]。

經(jīng)過氨基酸序列的比對發(fā)現(xiàn)，Cas2 在致病性結核桿菌的的表達是高度保守的，說明Cas2可能對分枝桿菌的致病性是非常重要的。選擇恥垢分枝桿菌作為實驗菌株構建重組質粒，并將該重組質粒連接到恥垢分枝桿菌中，建立過表達Cas2的重組恥垢分枝桿菌模型[10]。并對重組恥垢分枝桿菌的Cas2 在壓力反應以及毒力等方面的功能進行研究。進一步表明，Cas 蛋白與實驗菌體的致病性高度相光。此研究為Cas 蛋白的機制提供了新方向，并為研究Cas2在結核分枝桿菌中的作用奠定了基礎。

三、結核桿菌表面蛋白PPE19

結核分枝桿菌PPE家族基因作為抗原變異的來源及診斷血清，主要參與結核桿菌的毒力及抗壓力反應中。結核分枝桿菌PPE 家族基因與宿主相互作用，發(fā)揮抗壓力反應的作用越來越受到重視。PPEl9 基因作為PPE 基因家族的重要一員，其作用是調控結核桿菌抗壓力反應因子SigB 的重要調控因子。實驗表明，缺失或突變PPEl9基因的菌株對于抗生素、低氧、氧化壓力等壓力反應均表現(xiàn)出更加敏感。因此，作為SigB 因子的一個調控子而言，PPEl9基因可能對其中的一種壓力因素或幾種壓力因素起到調控作用。

利用結核分枝桿菌基因組的PPEl9 基因構建重組質粒，將重組質粒轉接到恥垢分枝桿菌中，構建表達PPEl9重組蛋白的重組恥垢分枝桿菌[11]。實驗表明，PPEl9的過表達菌株也即菌體對抗壓力反應的耐受菌株。這些抗壓力反應包括，對抗饑餓條件，對抗酸性壓力，對抗表面壓力，對抗氧化壓力以及對抗結核藥物異煙肼的耐受。但是，PPEl9 基因僅在結核分枝桿菌的牛分枝桿菌中表達。而且，PPEl9基因對于恥垢分枝桿菌菌落形態(tài)，生物膜的形成等表面特性均未產(chǎn)生明顯的影響。此外，PPEl9對于抗生素諾氟沙星表現(xiàn)出高度敏感。對于寄生于機體巨噬細胞內的胞內菌而言，PPEl9明顯增強了恥垢分枝桿菌的存活，但是沒有明顯改變細胞內相關細胞因子的轉錄水平。

四、結語

肺結核是一種很古老的傳染病，俗稱是“癆病”，是一種對人類健康構成重大威脅的慢性傳染病[12]。人類對結核桿菌感染率很高，雖然各國為防治結核病做出了大量努力，但是結核病依然在全球特別是中低收入國家中蔓延。近年來，科學界發(fā)現(xiàn)了一系列結核桿菌效應蛋白調控宿主細胞功能從而逃逸免疫清除的機制，揭示了病原菌與宿主間相互博弈的動態(tài)過程及分子機理，為抗結核治療及藥物研究提供了新思路和特異靶點。