李海萍, 關(guān) 皓，賈志鋒，劉文輝, 陳仕勇, 徐美玲, 陳生翠, 嚴(yán)東海, 蔣永梅, 甘 麗，張珈敏, 周青平

(1.青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.西南民族大學(xué)四川若爾蓋高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站，四川 成都 610041；3.青海師范大學(xué)數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)院，青海 西寧 810016；4.海北州祁連縣林業(yè)和草原局，青海 祁連 810499；5.四川省草業(yè)技術(shù)研究推廣中心，四川 成都 610000)

川西北高寒區(qū)畜牧業(yè)以傳統(tǒng)天然草地放牧利用為主，受氣候變化和超載過牧等因素的影響，天然草地退化嚴(yán)重，生產(chǎn)力急劇降低，限制了該區(qū)域畜牧業(yè)轉(zhuǎn)型升級。該地區(qū)草產(chǎn)品單一、生產(chǎn)方式落后，冷季飼草不足一直是限制其草牧業(yè)發(fā)展的短板。因此，破解高寒區(qū)飼草季節(jié)性供應(yīng)不足、草畜矛盾突出、養(yǎng)殖效益低下、畜產(chǎn)品附加值低等難題，要從根本上提高飼草種植、加工利用技術(shù)水平，從而實(shí)現(xiàn)生態(tài)效益、社會效益和經(jīng)濟(jì)效益最大化，并與時俱進(jìn)發(fā)展高寒區(qū)草地生態(tài)畜牧業(yè)。

燕麥(Avenasativa)是禾本科一年生糧飼兼用作物，喜冷涼、耐貧瘠、營養(yǎng)價值高、緩沖能值低，是高寒地區(qū)牧民利用“圈窩子”生產(chǎn)“抗災(zāi)保畜”優(yōu)質(zhì)飼草的主導(dǎo)品種，在高寒地區(qū)畜牧業(yè)穩(wěn)定發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]。傳統(tǒng)上，農(nóng)牧民在夏末秋初刈割牧草，就地曬制青干草，但是燕麥干草制作過程中受不良天氣影響，容易出現(xiàn)霉菌滋生、腐爛等現(xiàn)象，造成燕麥營養(yǎng)成分的損失。青貯是以青綠飼草為原料，在厭氧條件下由乳酸菌發(fā)酵調(diào)制成的優(yōu)質(zhì)青粗飼料，可有效的保持原料的干物質(zhì)、粗蛋白、可溶性碳水化合物等營養(yǎng)成分，降低酸性洗滌纖維等不易被消化的成分，提高飼料的利用率[2]。燕麥本身附生的乳酸菌數(shù)量較少，且品種間差異明顯[3]，而乳酸菌的種類和數(shù)量是決定青貯發(fā)酵能否成功的關(guān)鍵因素[4]。加之川西北地區(qū)降雨量充沛[5]，燕麥?zhǔn)斋@時含水量較高、易滋生腐敗菌[6]，如何降低水分且快速啟動乳酸發(fā)酵是當(dāng)?shù)馗咂焚|(zhì)青貯生產(chǎn)亟待解決的問題。麥麩作為主要的小麥副產(chǎn)品，其干物質(zhì)、粗蛋白和灰分含量相對較高，粗纖維含量相對較低，與燕麥混合青貯過程中即可以增加蛋白質(zhì)來源，又可以調(diào)節(jié)水分，發(fā)揮雙重作用。隨著對優(yōu)質(zhì)低成本飼料需求的增加以及資源整合的倡導(dǎo)，農(nóng)副產(chǎn)品和食品加工副產(chǎn)品越來越受到重視，麥麩在青貯飼料的應(yīng)用將有效緩解“人畜爭糧”的問題[7]。

本研究擬明確自選乳酸菌株生長、產(chǎn)酸特性，通過燕麥裹包青貯評價添加自選乳酸菌和麥麩對燕麥青貯發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)的影響，為川西北高寒牧區(qū)高品質(zhì)燕麥青貯生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)的青貯原料為燕麥，于2021年7月28日收獲于四川省紅原縣瓦切鎮(zhèn)的唐日牦牛養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社(33°06′N，102°37′E，海拔3 492 m)，刈割時期為開花期。

供試的乳酸菌為植物乳桿菌160(LP160,Lactobacillusplantarum，CGMCCNo.23166，由團(tuán)隊(duì)前期篩選)、短乳桿菌248(LB248,Lactobacillusbrevis，CGMCCNo.23167，由團(tuán)隊(duì)前期篩選)和商業(yè)菌(Commercial inoculants，COM，臺灣亞芯生物科技有限公司，活性菌為植物乳桿菌，活菌數(shù)為1010cfu·g-1)。麥麩購買自佳惠飼料(河北石家莊)。

1.2 乳酸菌菌株特性測定

1.2.1乳酸菌菌株生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定 活化好的菌株按照5%(v∶v)的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，分別放置于37℃和20℃/-5℃兩個溫度條件下培養(yǎng)36 h，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每2 h取培養(yǎng)液用酶標(biāo)儀(賽默飛Multiskan Go，賽默飛世爾科技(中國)有限公司，中國上海)在600 nm下測吸光度值(Optical density,OD)并使用pH計(jì)(雷磁pHS-3C，上海儀電分析儀器有限公司，中國上海)測pH，連續(xù)測量36 h。

1.2.2乳酸菌菌株綠汁發(fā)酵液pH測定 將灌漿期燕麥榨汁，用無菌醫(yī)用紗布過濾后收集到50 mL滅菌離心管中，對于事先活化好的菌株按照5%(v∶v)接種量接種于綠汁發(fā)酵液中，分別放置在37℃和20℃/-5℃(先20℃,12 h后-5℃,12 h反復(fù)交替)的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)60 h，設(shè)置3個重復(fù)，分別在4,8,16,24,60 h時測量綠汁發(fā)酵液的pH。

1.3 燕麥裹包青貯調(diào)制

采用雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，A因素為麥麩，設(shè)2個水平，A0：0%麥麩；A1：30%麥麩。B因素為乳酸菌類型，設(shè)4個水平，B0：對照(噴施等量的滅菌蒸餾水)；B1：LP160植物乳桿菌；B2：LB248短乳桿菌；B3：青貯商業(yè)菌,共8個處理(表1所示)。

表1 試驗(yàn)處理編號

燕麥于開花期刈割，留茬高度10 cm，切短成2～3 cm左右。分別向單獨(dú)燕麥原料與燕麥和麥麩以7∶3混合原料上均勻噴灑植物乳桿菌160(LP160)、短乳桿菌248(LB248)和商業(yè)菌，按照活菌數(shù)為106cfu·mL-1，裝入噴壺，以每1 kg原料噴灑30 mL菌液為標(biāo)準(zhǔn)添加，對照添加等量的滅菌蒸餾水。將原料與乳酸菌添加劑充分混勻后放入全自動青貯打捆包膜一體機(jī)，制作成50 kg·個-1的裹包青貯，放置當(dāng)?shù)厥覂?nèi)(-8℃～20℃)發(fā)酵60 d，每個處理3個重復(fù)。待發(fā)酵完成后，打開裹包，每個裹包隨機(jī)取4個點(diǎn)樣品，混勻后取20 g青貯樣品與180 mL滅菌蒸餾水混合在4℃冰箱中靜置24 h制作浸提液用于測定pH、氨氮(NH3-N)、有機(jī)酸。取約300 g樣品在65℃烘箱(電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9053A，上海維菱)中烘干至恒重，粉碎機(jī)粉碎，過40目篩后測量相關(guān)指標(biāo)。

1.4 有氧穩(wěn)定性的測定

青貯60 d后，每個裹包隨機(jī)在4個點(diǎn)取樣，混勻后取1 kg于2 L滅菌燒杯中壓實(shí)，用兩層滅菌紗布覆蓋，每個處理3個重復(fù)，放置在室溫下，連接實(shí)時溫度記錄儀(MT-X，神華科技有限公司，中國深圳)，每5 min測量一次核心區(qū)域溫度，持續(xù)2 d，7 d后取20 g青貯樣品與180 mL滅菌蒸餾水混合靜置24 h制作浸提液用于測定pH。有氧穩(wěn)定性的計(jì)算基于有氧暴露后青貯飼料核心溫度超過基準(zhǔn)環(huán)境溫度2℃所持續(xù)的時間[8]。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1青貯飼料營養(yǎng)成分測定 干物質(zhì)(Dry matter,DM)含量采用65℃烘箱(電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9053A，上海維菱)烘干至恒重測定[9]；粗蛋白(Crude protein,CP)含量采用FOSS全自動凱氏定氮儀測定[10]；粗脂肪(Ether extract,EE)含量采用石油醚浸提通風(fēng)揮發(fā)后稱重的索氏提取法測定[11]；灰分(Ash)含量采用電爐低溫碳化后用馬弗爐灼燒測定[12]；中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)含量采用Van Soest法測定[13]；淀粉(Starch)含量采用植物淀粉含量試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，中國蘇州)測定。水溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrates，WSC)采用植物可溶性糖含量試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，中國蘇州)測定含量。

1.5.2青貯發(fā)酵特性測定 pH采用pH計(jì)(雷磁pHS-3C，上海儀電分析儀器有限公司，中國上海)測定；氨態(tài)氮(NH3-N)含量通過浸提液處理后采用苯酚-次氯酸鈉法測定[14]；有機(jī)酸包括乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)，采用超高效液相色譜儀(賽默飛UltiMate3000,美國)測定其含量，將浸提液通過0.22 μm濾頭過濾到進(jìn)樣瓶中，色譜條件為：RSpak KC-811色譜柱，流動相0.1% H3PO4，流速0.5 mL·min-1，柱溫55℃。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016和SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，先利用Excel2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，再利用SPSS 26.0進(jìn)行雙因素方差分析，再結(jié)合鄧肯氏(Duncan′s)方法進(jìn)行處理間多重比較，其中P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌株生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定

由圖1可見，恒溫37℃條件和反復(fù)凍融條件下，菌株的生長曲線呈現(xiàn)不同的變化趨勢。37℃條件下，菌株LP160和LB248快速生長，在14 h時進(jìn)入穩(wěn)定期而商業(yè)菌生長緩慢且OD值始終小于LP160和LB248。在凍融條件下菌株均生長緩慢且在-5℃時出現(xiàn)了明顯的停滯期，溫度重新升到20℃時菌株再次恢復(fù)生長，商業(yè)菌生長緩慢且OD值低于LP160和LB248。在兩個處理?xiàng)l件下LB248菌株表現(xiàn)出了較快的生長速度菌株的產(chǎn)酸曲線與生長曲線呈負(fù)相關(guān)(圖2)，菌株LP160和LB248表現(xiàn)出相似的變化趨勢。37℃條件下，菌株LP160和LB248的pH迅速下降，在14 h時降到最低，商業(yè)菌pH下降緩慢且pH始終高于LP160和LB248，LP160、LB248和商業(yè)菌的最終pH分別是3.45，3.55和3.79。凍融條件下，pH下降較緩慢，在-5℃階段出現(xiàn)了停滯期，溫度切換到20℃階段時pH繼續(xù)下降，商業(yè)菌的pH始終高于LP160和LB248，LB248，LP160，LB248和商業(yè)菌的最終pH分別是3.90，3.84和4.38。

圖1 乳酸菌菌株不同溫度下的生長曲線

圖2 乳酸菌菌株不同溫度下的產(chǎn)酸曲線

2.2 乳酸菌菌株在凍融條件下的綠汁發(fā)酵液測定

如圖3所示，在凍融條件下將菌株接種到燕麥綠汁發(fā)酵液后，各菌株表現(xiàn)不同，LB248和商業(yè)菌的pH在前24 h下降極少，而LP160下降較快，經(jīng)過24 h發(fā)酵后，接種LP160的綠汁發(fā)酵液pH已降低到4.13，而LB248和商業(yè)菌接種的綠汁發(fā)酵液pH分別是5.64和5.83。60 h后，接種LP160LB248和商業(yè)菌的綠汁發(fā)酵液的pH分別是3.91,4.04和4.38，商業(yè)菌的pH高于LP160和LB248的pH。

圖3 接種乳酸菌菌株后燕麥綠汁發(fā)酵液pH曲線

2.3 青貯原料特性

青貯前新鮮燕麥的干物質(zhì)含量為23.69%鮮重(Fresh weight,FW)，粗蛋白為10.02% DM，中性洗滌纖維為52.17% DM，酸性洗滌纖維為30.69%，水溶性碳水化合物為7.89% DM。附生的乳酸菌、腸桿菌、酵母菌和霉菌分別為3.45，3.19，2.56，3.29 log cfu·g-1FW(表2)。

表2 燕麥青貯原料特性

2.4 麥麩和乳酸菌協(xié)同作用對燕麥青貯品質(zhì)的影響

表3可知，A0B0的pH極顯著高于其他處理組(P<0.01)，A1B0的pH極顯著高于A1B1，A1B2，A1B3(P<0.01)，說明接種乳酸菌顯著降低了燕麥青貯的pH。A0B1，A0B2，A0B3的pH均低于A1B1，A1B2，A1B3，可見添加麥麩后，接種乳酸菌pH降低較少。A0B1，A0B2，A0B3的NH3-N/TN含量均極顯著低于A1B1，A1B2、A1B3(P<0.01)，其中A0B1的NH3-N/TN含量均極顯著低于其他處理組(P<0.01)。A0B1的乳酸含量極顯著高于其他處理，A1B0的乙酸含量均極顯著高于其他處理(P<0.01)。因此,A0B1的發(fā)酵特性最優(yōu)。由雙因素方差分析可見，pH，NH3-N/TN和乙酸的含量與麥麩和乳酸菌及其交互作用均顯著相關(guān)(P<0.05)，而乳酸含量與麥麩無相關(guān)性。

表3 麥麩和乳酸菌互作對燕麥青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

表4可知，A1B0，A1B1，A1B2和A1B3的DM，CP含量均極顯著高于A0B0，A0B1，A0B2和A0B3(P<0.01)，其中A1B1的DM、CP和淀粉含量最高，極顯著高于其他處理(P<0.01)。A0B0的WSC含量低于其他處理組，而A0B1的WSC含量最高。A1B1的NDF、ADF均低于其他處理，而A1B2的ADF和NDF最高；由此可見，麥麩和乳酸菌共同作用對燕麥青貯營養(yǎng)品質(zhì)影響大，添加麥麩后干物質(zhì)和粗蛋白含量顯著增加(P<0.01)，其中A1B1提高燕麥青貯營養(yǎng)品質(zhì)效果最為明顯。根據(jù)方差分析可知，除灰分、粗脂肪、可溶性碳水化合物外，其余營養(yǎng)指標(biāo)與麥麩、乳酸菌及麥麩和乳酸菌互作都顯著相關(guān)(P<0.05)，可溶性碳水化合物與乳酸菌極顯著相關(guān)(P<0.01)，與麥麩和乳酸菌互作顯著相關(guān)(P<0.05)。

表4 麥麩和乳酸菌互作對燕麥青貯營養(yǎng)品質(zhì)的影響

2.5 添加麥麩和乳酸菌對燕麥青貯有氧穩(wěn)定性的影響

經(jīng)有氧暴露兩天后，各個處理的pH如圖4所示，A1B2處理的pH最高，A0B1處理的pH最低，添加麥麩后燕麥青貯的pH顯著降低(P<0.05)。在不添加麥麩條件下，接種LP160和LB248顯著降低燕麥青貯pH；添加麥麩后LP160和商業(yè)菌顯著降低pH(P<0.05)。因此，無論添加麥麩與否，接種LP160的燕麥青貯有氧暴露階段的pH都顯著低于對照。

圖4 麥麩和乳酸菌互作對燕麥青貯有氧暴露兩天后pH的影響

如圖5所示，通過有氧暴露實(shí)驗(yàn)確定了有氧穩(wěn)定性時間，接種乳酸菌和麥麩后有氧穩(wěn)定性顯著增加(P<0.05)，A0B1>A1B1>A0B2>A1B3>A1B0>A0B0>A0B3>A1B2，其中LP160 效果最優(yōu)，是對照的近2倍。LB248在不加和添加麥麩后有氧穩(wěn)定性時間分別是127.33 h和55.67 h。所有處理的有氧穩(wěn)定性均超過了2 d。

圖5 麥麩和乳酸菌互作對燕麥青貯有氧穩(wěn)定性的影響

3 討論

3.1 乳酸菌對燕麥青貯和有氧穩(wěn)定性的影響

乳酸菌是有利于青貯保存的微生物，它在厭氧條件下發(fā)酵水溶性碳水化合物并產(chǎn)生乳酸，降低pH，從而抑制其他有害微生物的生長[15]。本研究單獨(dú)接種自選乳酸菌明顯改善發(fā)酵品質(zhì)，且有氧暴露兩天后，pH仍維持在5.0以下，尤其LP160效果最優(yōu)，有氧穩(wěn)定性顯著高于其他處理，自選乳酸菌效果均優(yōu)于商業(yè)菌，這就說明雖然乳酸菌具有革蘭氏陽性，不產(chǎn)生孢子，過氧化氫酶陰性，耐酸，喜歡在厭氧條件下生長等共同點(diǎn)[16]，但是由于環(huán)境的不同，附生植物的不同，不同的菌株有不同的特性[17-19]，而因地制宜篩選出的乳酸菌作用更優(yōu)，這與張紅梅等[20]的研究結(jié)果一致。根據(jù)乳酸菌對碳水化合物的代謝，將其分為同型發(fā)酵乳酸菌和異型發(fā)酵乳酸菌，前人研究發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)處理的對照相比，接種植物乳桿菌和布氏乳桿菌提高了乳酸菌和乳酸的含量，降低了pH值和丁酸、2，3-丁二醇及乙醇的水平，提高了發(fā)酵品質(zhì)且抑制了有氧變敗的發(fā)生[21-22]，這與本研究結(jié)果一致。但是，有氧暴露兩天后，LP160處理的pH顯著低于LB248處理，這與前人[21,23]研究的異型發(fā)酵乳酸菌更有利于有氧穩(wěn)定性的結(jié)果不一致，且LB248與麥麩混合作用時，有氧穩(wěn)定性反而降低，這可能與菌株特性有關(guān)，有待進(jìn)一步探究。另外，高原上晝夜溫差大，青貯期間還會遇到凍融情況[24]，自選菌株LP160和LB248即使在20℃/-5℃條件下也能快速生長且產(chǎn)酸，能夠在高寒區(qū)燕麥青貯中發(fā)揮重要作用。

3.2 麥麩對燕麥青貯和有氧穩(wěn)定性的影響

紅原地區(qū)燕麥?zhǔn)斋@季往往降雨量較大，使得青貯含水量較高，而干物質(zhì)含量是決定青貯能否成功的一個重要因素[25]，干物質(zhì)含量過低則容易引起梭菌發(fā)酵，產(chǎn)生大量丁酸，導(dǎo)致青貯失敗。麥麩作為小麥制粉的副產(chǎn)物，產(chǎn)量約占小麥制粉量的20%，且含有粗蛋白質(zhì)、淀粉、粗脂肪、粗纖維、以及維生素、阿拉伯木聚糖等營養(yǎng)物質(zhì)[26-27]。而CP,NDF,ADF是評價青貯飼料營養(yǎng)的主要指標(biāo)，飼料營養(yǎng)成分中粗蛋白含量相對越多，NDF、ADF含量相對越少，飼料營養(yǎng)品質(zhì)更好[28]。青貯飼料的發(fā)酵是否成功也與WSC含量密切相關(guān)，是保證青貯飼料發(fā)酵成功的必要條件之一[29]。杜昭昌等[30]發(fā)現(xiàn)麥麩和鮮玉米秸稈混合青貯的DM、CP、WSC含量比鮮玉米秸稈單獨(dú)青貯高。本試驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果一致，添加麥麩后DM、WSC和CP含量顯著增加，NDF和ADF降低，表明添加麥麩可以提高燕麥青貯營養(yǎng)品質(zhì)。另外，添加麥麩后，pH、氨態(tài)氮降低，乳酸和乙酸含量增加，說明麥麩在一定程度上改善了發(fā)酵品質(zhì)，可能是添加麥麩后含水量降低，抑制了雜菌生長，從而起到促進(jìn)發(fā)酵的作用。研究發(fā)現(xiàn)高干物質(zhì)青貯開窖后的有氧穩(wěn)定性要優(yōu)于低干物青貯，而本研究中通過添加麥麩降低了含水量，進(jìn)而增加了有氧穩(wěn)定性，本文與上述研究結(jié)果一致[31]。

3.3 乳酸菌與麥麩互作對燕麥青貯和有氧穩(wěn)定性的影響

麥麩中的總碳水化合物含量為50%～60%，主要包括淀粉多糖和非淀粉多糖。前者可被畜禽消化吸收以供能，后者作為麥麩中碳水化合物的主要成分，以高聚合態(tài)的半纖維素和纖維素形式存在，難以被畜禽消化利用[26]。Spaggiaria等[32]利用鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)菌株對小麥麩皮進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，并評估其對生物活性化合物(游離和結(jié)合酚酸)和抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)乳酸菌處理會改變其纖維結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)特性。本研究采用乳酸菌和麥麩互作，發(fā)現(xiàn)不同菌株的作用不同，LB248提升了發(fā)酵品質(zhì)增加但中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，而且有氧暴露兩天后pH更高，而LP160的效果更好，產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)，混合使用后營養(yǎng)品質(zhì)最優(yōu)，這一方面可能是因?yàn)長P160能夠分解纖維而LB248不具有這種特性，另一方面可能是不同菌株與麥麩混合有不同的適應(yīng)比例，而LB248與麥麩混合的比例失衡，造成營養(yǎng)流失。有氧暴露后各個處理的有氧暴露時間均超過了2 d，實(shí)踐中，裹包青貯從開包到飼喂完成通常最多需要1～2 d，所以添加麥麩和乳酸菌可以保證飼喂品質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究通過在燕麥青貯中添加麥麩和自選乳酸菌，發(fā)現(xiàn)添加麥麩和乳酸菌都能一定程度的提高燕麥青貯的營養(yǎng)品質(zhì)和發(fā)酵品質(zhì)，其中，添加LP160和麥麩的燕麥青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)最優(yōu)；添加LP160的燕麥青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)最優(yōu)且有氧穩(wěn)定性最好，因此，建議在生產(chǎn)實(shí)踐中，條件允許可混合添加麥麩和乳酸菌菌劑；條件有限可單獨(dú)添加乳酸菌菌劑。