謝文輝，趙文武，王雷挺，趙麗麗*，王普昶

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

百脈根(Lotuscorniculatus)是豆科百脈根屬多年生草本植物，原產(chǎn)于歐亞大陸溫帶地區(qū)[1]，在我國(guó)廣泛分布于華東、華中、西南和西北地區(qū)[2]。百脈根具有很高的經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效益，它的莖葉營(yíng)養(yǎng)含量豐富、粗蛋白含量高、富含縮合單寧、適口性好，是牛、馬、兔等家畜的優(yōu)良牧草，也是人工草地建植和放牧草地改良的優(yōu)良草種[3]。百脈根中的縮合單寧能夠促進(jìn)反芻動(dòng)物的消化[4-5]，這使得其與多數(shù)豆科牧草不同，不易造成家畜患膨脹病[6]。此外，百脈根根系發(fā)達(dá)，側(cè)根眾多，莖枝匍匐生長(zhǎng)，枝葉茂密，覆蓋度大，具有改土肥田、防止水土流失，美化環(huán)境的作用[7]。

自上世紀(jì)80年代以來(lái)，我國(guó)陸續(xù)從國(guó)外引進(jìn)了一些百脈根栽培品種[8]，生產(chǎn)試驗(yàn)表明這些品種有較強(qiáng)的適應(yīng)性和較高的生產(chǎn)性能，廣泛種植于我國(guó)西北河西走廊灌溉地區(qū)和新疆沙漠綠洲[9]。在我國(guó)西南巖溶地區(qū)，目前關(guān)于百脈根的品種選育研究還不系統(tǒng)，百脈根新品種較少。通過(guò)引進(jìn)新的優(yōu)良百脈根種質(zhì)資源，培育適宜不同生態(tài)區(qū)和用途的百脈根品種，這對(duì)百脈根在我國(guó)西南巖溶山區(qū)的規(guī)?；N植及當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)畜牧業(yè)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析是新品種選育的基礎(chǔ)，通過(guò)表型性狀檢測(cè)遺傳多樣性是最直接且最簡(jiǎn)易的方法[10]。表型性狀是作物基因和外部環(huán)境綜合作用的結(jié)果，張本瑜等人[11]將69份俄羅斯百脈根種質(zhì)資源劃分為3大類群，并發(fā)現(xiàn)這69份材料各具特點(diǎn)，差異明顯，類型廣泛。郝裕輝等人[12]分析了參試的29份無(wú)芒雀麥(Bromusinermis)種質(zhì)資源表型性狀差異，發(fā)現(xiàn)無(wú)芒雀麥種質(zhì)間遺傳變異較大，是環(huán)境因子和遺傳物質(zhì)共同作用的結(jié)果，育種潛力巨大。此外，前人對(duì)箭筈豌豆(Viciasativa)[13]、苜蓿(Medicagosativa)[14]、胡枝子(Lespedeza)[15]等作物表型性狀存在的變異也進(jìn)行了廣泛深入研究，為不同牧草種質(zhì)資源的收集、保護(hù)和遺傳改良提供了參考。本研究基于表型性狀對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)外的22份百脈根種質(zhì)材料的遺傳多樣性進(jìn)行分析和比較，擬為優(yōu)異百脈根種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用和新品種選育提供初步參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為22份百脈根種質(zhì)種子(表1)，其中21份由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所國(guó)家種質(zhì)資源牧草中期庫(kù)提供，1份由貴州眾志恒生態(tài)科技有限公司提供。

表1 材料名稱及來(lái)源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)與種植 測(cè)定完種子表型性狀后，先在培養(yǎng)皿上育苗，出苗10 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽至花盆(高30 cm，長(zhǎng)35 cm，寬20 cm)，每份種質(zhì)種植3盆，每盆5株。溫室適應(yīng)生長(zhǎng)2周后(光照16 h，黑暗8 h，生長(zhǎng)溫度(22±2)℃)，移至室外培養(yǎng)，定期澆水并除草，所有材料均可以完成全部生育期并開(kāi)花結(jié)種。種子形態(tài)性狀測(cè)定包括種莢長(zhǎng)，種莢寬，種莢厚，種子周長(zhǎng)，種子寬，種子長(zhǎng)和種子長(zhǎng)寬比；植株表型性狀測(cè)定包括分枝數(shù)，莖長(zhǎng)，株高和冠幅，共11個(gè)指標(biāo)。

1.2.2表型數(shù)量性狀的測(cè)定方法 種子形態(tài)：使用光學(xué)平板掃描儀(V800 PHOTO，Epson，日本)對(duì)每份種質(zhì)種子(每份種子100粒，3次重復(fù))進(jìn)行掃描，獲得種質(zhì)的種子圖像，圖像分辨率為300 dpi，像素為1024×1024。使用數(shù)字圖像分析系統(tǒng)(WinFOLIA 2014，加拿大)對(duì)種子圖像進(jìn)行分析，得到種子長(zhǎng)、種子寬、長(zhǎng)寬比、種子周長(zhǎng)。

種莢形態(tài)：使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺(AIRAI SR44，精度0.01 mm，山東青島)測(cè)量種莢長(zhǎng)度、種莢寬度、種莢厚度。

在利用直尺(量程為30 cm)測(cè)量同一時(shí)間不同種質(zhì)百脈根的莖長(zhǎng)、冠幅、株高及記錄百脈根的分枝數(shù)。其中，莖長(zhǎng)：用直尺測(cè)量莖頂端至基部的總長(zhǎng)度。冠幅：分枝直徑的最大值。株高：用直尺測(cè)量從地上莖部分到植株花序頂端的自然高度；分枝數(shù)：初花期統(tǒng)計(jì)并記錄百脈根根頸部的一級(jí)分枝數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并基于單因素(One-Way ANONA)方差分析的最小顯著差(LSD)多重比較法。利用Origin2021軟件的模式分析，包括聚類和主成分分析(Principal component analysis，PCA)，控制數(shù)據(jù)質(zhì)量并以圖像方式直觀展示本試驗(yàn)研究中22份種質(zhì)表型數(shù)量性狀的差異變化情況，選用基于平方歐氏距離的最長(zhǎng)距離法對(duì)22份種質(zhì)的植株表型及種子表型性狀指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，為了消除量綱對(duì)聚類關(guān)系的影響，種質(zhì)性狀數(shù)據(jù)通過(guò)z值標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行聚類，其中，z值標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算公式如下：

各表型數(shù)量性狀之間的相關(guān)性和主成分分析在IBM SPSS Statistics 21中分析，其中，基于主成分提取結(jié)果，我們構(gòu)建了1個(gè)新的變量y(y1，y2，y3，y4)，通過(guò)因子分析來(lái)反映主成分分析提取到的主成分的得分：

y=∑cx

(1)

公式(1)中，c為特征向量，特征向量為(相應(yīng)載荷因子/特征根的開(kāi)方)，x為標(biāo)準(zhǔn)化后的種質(zhì)表型性狀值。隨后，將提取到的主成分的方差貢獻(xiàn)率C作為系數(shù)，結(jié)合公式(1)構(gòu)建綜合評(píng)價(jià)模型：

F=C1y1+C2y2+C3y3+C4y4

(2)

最終以評(píng)價(jià)得分F為基準(zhǔn)對(duì)各百脈根種質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 百脈根種質(zhì)資源形態(tài)特征多樣性

22份百脈根種質(zhì)表型性狀結(jié)果表明(表2)，除種寬外，22份百脈根種質(zhì)間各性狀均存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)差異。其中，株高、莖長(zhǎng)、分枝數(shù)及冠幅等百脈根形態(tài)指標(biāo)的變異系數(shù)均超過(guò)50%，株高變異幅度最大，為69.48%，種子和種莢性狀(種子長(zhǎng)、種子寬、種長(zhǎng)寬比、種子周長(zhǎng)、種莢長(zhǎng)、種莢寬、種莢厚)的變異系數(shù)較小，在12.11%和20.81%之間。此外，除種子寬外，22份百脈根種質(zhì)間的種長(zhǎng)寬比和種子周長(zhǎng)性狀存在顯著差異(P<0.05)，其余各性狀(株高、莖長(zhǎng)、分枝數(shù)、冠幅、種子長(zhǎng)、種莢長(zhǎng)、種莢寬、種莢厚)均存在極顯著差異(P<0.01)。

表2 22份百脈根種質(zhì)表型數(shù)量性狀變異

2.2 百脈根種質(zhì)材料不同性狀間的相關(guān)性分析

對(duì)22份百脈根種質(zhì)材料的11個(gè)表型性狀進(jìn)行相關(guān)性分析(圖1)，結(jié)果顯示分枝數(shù)與莖長(zhǎng)、株高和冠幅性狀之間呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，而分枝數(shù)與種莢長(zhǎng)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與種莢寬和種莢厚性狀之間呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。莖長(zhǎng)與種莢厚和種子長(zhǎng)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。種莢長(zhǎng)與種莢寬和種莢厚之間呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，種子長(zhǎng)，種子寬，種周長(zhǎng)之間呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。種子長(zhǎng)寬比和種子長(zhǎng)之間呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，而與種子寬之間呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。此外，種莢厚，種子長(zhǎng)均與莖長(zhǎng)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。總體而言，不同性狀間存在顯著相關(guān)性。

圖1 22份百脈根種質(zhì)不同性狀間的相關(guān)性分析

2.3 22份百脈根種質(zhì)資源的聚類分析

通過(guò)聚類分析，將22份百脈根種質(zhì)資源分成3個(gè)大的類群(圖2)。第I類群僅包含1份種質(zhì)，種質(zhì)編號(hào)為21，從熱圖可以看出，該野生百脈根種質(zhì)的莖分枝數(shù)、莖長(zhǎng)、株高和冠幅直徑高于其它類群種質(zhì)資源，但該類群種質(zhì)種子小也是一個(gè)主要表型特征，這表明類群I種質(zhì)的種子小但植株高大，地上生物量高。

圖2 基于表型性狀數(shù)據(jù)的22份百脈根種質(zhì)材料聚類分析熱圖

第II類群包含12份種質(zhì)，種質(zhì)編號(hào)為17，16，19，18，15，22，14，9，7，5，8和2，包含除眉縣的所有陜西種質(zhì)(14，15，16，17，18，19)以及部分國(guó)外種質(zhì)(5，7，22)，該類群種質(zhì)整體表現(xiàn)為種莢和種子小，植株矮小，地上生物量低。第Ⅲ類群包含9份種質(zhì)資源，種質(zhì)編號(hào)為13，12，10，11，6，3，20，4和1，包含來(lái)自甘肅的全部2份種質(zhì)(11，20)及部分國(guó)外種質(zhì)(12，6，3，4，1)。與I、II類群不同，雖然類群Ⅲ種質(zhì)的種莢及種子整體大于其它2個(gè)類群，但該類群種質(zhì)整體表現(xiàn)為植株矮小，地上生物量低。

2.4 主成分綜合分析及評(píng)價(jià)

本研究首先對(duì)22份百脈根種質(zhì)的11個(gè)性狀指標(biāo)進(jìn)行了KMO(Kaiser-Meyer-Olkin)檢驗(yàn)和Bartlett's球形檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，KMO值=0.519>0.5，Bartlett's檢驗(yàn)的P值小于0.001，拒絕零假設(shè)，因此可以進(jìn)行主成分分析。

以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn)，共提取到4個(gè)主成分(表3)，累積貢獻(xiàn)率達(dá)73.181%，這表明這4個(gè)主成分能夠代表11個(gè)表型性狀的大部分信息。其中，第1主成分特征值為2.590，貢獻(xiàn)率為23.549%，載荷較大的因子包括莖長(zhǎng)(-0.752)、株高(-0.581)、冠幅(-0.708)、種子周長(zhǎng)(0.516)及種子長(zhǎng)(0.554)。第2主成分特征值為2.304，貢獻(xiàn)率為20.946%，載荷較大的因子包括種子周長(zhǎng)(0.807)和種子寬(0.852)。第3主成分特征值為1.791，貢獻(xiàn)率為16.282%，載荷較大的因子包括種莢長(zhǎng)(0.500)、種莢寬(0.570)、種莢厚(0.505)及種子長(zhǎng)寬比(0.527)。第4主成分特征值為1.364，貢獻(xiàn)率為12.404%，載荷較大的因子包括種子長(zhǎng)寬比(0.732)。

表3 主成分分析結(jié)果

隨后，我們將提取的4個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率作為系數(shù)，結(jié)合公式(1)構(gòu)建了綜合評(píng)價(jià)模型：F=0.23549y1+0.20946y2+0.16282y3+0.12404y4，并以評(píng)價(jià)得分為基準(zhǔn)對(duì)各百脈根種質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果顯示(表4)，11和12號(hào)種質(zhì)的得分最高，綜合表現(xiàn)整體優(yōu)良。

表4 基于主成分分析的22份百脈根種質(zhì)資源綜合得分

3 討論

種質(zhì)資源表型性狀是植物基因型和環(huán)境互相影響的綜合體現(xiàn)[17]，因此具有相對(duì)穩(wěn)定且豐富的表型變異特征[18]。對(duì)優(yōu)質(zhì)牧草百脈根種質(zhì)資源的表型性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析，是百脈根種質(zhì)資源研究的重要工作[19]，也是篩選特異牧草資源作為育種材料的前提[20]。本研究結(jié)果表明，除種寬外，22份百脈根種質(zhì)間各性狀均存在顯著(P<0.05)的表型性狀差異，這些表型性狀的變異表明在各種質(zhì)內(nèi)存在潛在可用的遺傳變異。變異系數(shù)(Coefficient of variation，CV)反映不同種質(zhì)特征性狀的變異程度，CV值越大，說(shuō)明不同種質(zhì)間相應(yīng)的特征性狀的差異越大，之前的研究表明，當(dāng)CV達(dá)到10%以上時(shí)，表明所選種質(zhì)材料間有顯著差異[21-22]，這與本研究結(jié)果一致。此外，本研究中的22份百脈根種質(zhì)的CV值均大于50%，可能是因?yàn)?2份種質(zhì)來(lái)自全球不同國(guó)家和地區(qū)，海拔，氣候等環(huán)境差別較大，而環(huán)境條件是種質(zhì)資源遺傳變異的重要因素之一[23]。

22份百脈根種質(zhì)表型性狀相關(guān)性分析表明，種子長(zhǎng)寬比與種子周長(zhǎng)間無(wú)顯著相關(guān)性，這與對(duì)小麥(Triticumaestivum)、青稞(Hordeumvulgare)的研究結(jié)果相似[24]。之前的研究表明，種子長(zhǎng)寬比主要用來(lái)描述種子形狀，而與種子大小性狀無(wú)關(guān)[15]，結(jié)合本研究，百脈根的種子大小與種子形狀這兩個(gè)數(shù)量性狀可能也為獨(dú)立遺傳。百脈根種質(zhì)的分枝數(shù)與莖長(zhǎng)，株高和冠幅性狀間呈正相關(guān)，而這些表型性狀都是構(gòu)成株型的重要因素，本世紀(jì)以來(lái)，包括玉米、水稻和小麥在內(nèi)的眾多作物在株型育種中已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展[25-27]。對(duì)于牧草而言，合理的株型能保證牧草在生長(zhǎng)過(guò)程中利用良好的生長(zhǎng)姿勢(shì)進(jìn)行光合作用，進(jìn)而提升產(chǎn)量[28]。本研究中，百脈根的株型性狀如株高、分枝數(shù)，都屬于數(shù)量性狀，應(yīng)考慮各株型性狀間的相關(guān)性從而更全面的研究株型形成的機(jī)制，來(lái)改良百脈根株型性狀以提高其產(chǎn)量和品質(zhì)。

聚類分析是植物育種的必要手段之一[29]，應(yīng)用聚類熱圖分析可以直觀呈現(xiàn)多個(gè)種質(zhì)的多個(gè)表型性狀值的全局大小變化，同時(shí)反映不同種質(zhì)資源間的遺傳差異和各類群的特點(diǎn)。本研究中。通過(guò)聚類熱圖分析，將22份百脈根種質(zhì)劃分為3個(gè)具有明顯差異的類群，第I類群包含的21號(hào)種質(zhì)資源，與其它種質(zhì)資源具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，該種質(zhì)株高和冠幅均大于其它種質(zhì)。第II類群包含了除眉縣外的所有來(lái)自陜西省的種質(zhì)及部分國(guó)外種質(zhì)，表明來(lái)自同一生態(tài)區(qū)的百脈根種質(zhì)表型性狀的差異不明顯，這也表明，盡管不同種質(zhì)間的性狀特征和地理來(lái)源間可能存在一定的相關(guān)性，但地理來(lái)源并不對(duì)表型性狀起決定作用[12]。類群Ⅲ種質(zhì)的種莢及種子隨整體大于其它2個(gè)類群，但該類群種質(zhì)整體表現(xiàn)為植株矮小，之前的研究表明，大粒種子的萌發(fā)率高于小粒種子，因?yàn)橄啾刃×７N子，大粒種子能夠儲(chǔ)存豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及更完整的酶系統(tǒng)，進(jìn)而促進(jìn)種子更快萌發(fā)[30]，但種子大小對(duì)植株形態(tài)特征的影響較小，可能是因?yàn)橛酌缟L(zhǎng)至營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累階段時(shí)，大粒種子的優(yōu)勢(shì)不再顯著[31-32]。

由于百脈根種質(zhì)材料表性狀指標(biāo)眾多，且各指標(biāo)間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。因此，需要通過(guò)提取主成分，以降維的方法將指標(biāo)重新組合，將多個(gè)性狀指標(biāo)轉(zhuǎn)化為較少的幾個(gè)相關(guān)性不強(qiáng)的綜合指標(biāo)，從而達(dá)到綜合和簡(jiǎn)化的目的[33]，該方法在燕麥(Avenasativa)[34]，披堿草(Elymusdahuricus)[35]等植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性評(píng)價(jià)中廣泛運(yùn)用。本研究中，11個(gè)聯(lián)系相關(guān)的指標(biāo)經(jīng)主成分分析，轉(zhuǎn)化為4個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到73.181%，包含了大部分性狀信息，莖長(zhǎng)、株高、冠幅、種子周長(zhǎng)、種子長(zhǎng)、種子寬和種子長(zhǎng)寬比的主成分載荷較高，是造成百脈根種質(zhì)資源表型差異的主要因素。在牧草育種研究中應(yīng)充分利用主成分因子，有效選擇育種材料，以縮短育種周期[36]?；谥鞒煞址治龅木C合評(píng)價(jià)顯示，聚類分析后的第Ⅲ類群的11和12號(hào)種質(zhì)主成分綜合得分最高，是2份綜合表現(xiàn)整體優(yōu)良的種質(zhì)材料，依據(jù)這些信息，在育種工作中，可根據(jù)實(shí)際用途或育種目標(biāo)從中再進(jìn)一步選擇，為選擇優(yōu)良的育種親本或栽培材料提供參考，提高育種效率[37]。

4 結(jié)論

本研究已初步證明，參試的22份百脈根種質(zhì)資源遺傳變異較大，11個(gè)表型數(shù)量性狀間具有廣泛相關(guān)性，各指標(biāo)在各種質(zhì)之間多樣性較豐富，通過(guò)聚類分析將22份種質(zhì)分為3類，基于主成分綜合得分篩選出2份綜合表現(xiàn)優(yōu)良的材料11和12號(hào)，并且這2份材料均聚類為同一類，具有較大的種莢和種子，可作為選育種子高產(chǎn)品種的目標(biāo)親本加以利用。本研究可為百脈根的實(shí)際應(yīng)用提供理論參考。