【作 者】 姜曉路，杜明秋，羊蘭翠 ，范晨霞 ，鄭明

1 浙江省醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，杭州市，310018

2 杭州協(xié)合醫(yī)療用品有限公司，杭州市，310018

0 引言

2019年末，由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome corona virus 2,SARS-CoV-2）導(dǎo)致引發(fā)的新型冠狀病毒感染（corona virus disease 2019,COVID-19）疫情席卷全球，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）報(bào)道，截至2022年8月3日，全球已有575887049確診病例，其中6398412例死亡[1]。SARS-CoV-2是一種單鏈正義、有包膜、顆粒呈圓形或橢圓形、直徑為60～140 nm的線(xiàn)性RNA病毒[2]。測(cè)序顯示其全基因組長(zhǎng)度約為30 kb（GenBank,MN908947.3），能編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，包括刺突蛋白S、包膜蛋白E、基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N[3-4]。N-蛋白在冠狀病毒中含量豐富，是一種高度免疫原性蛋白，參與基因組復(fù)制和細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)，具有高特異性等特點(diǎn)。作為SARS-CoV-2的核心蛋白，N-蛋白對(duì)新冠病毒的診斷和排查具有重要價(jià)值，也是其最重要的標(biāo)志[5-6]。

目前商業(yè)使用的COVID-19診斷方法主要分為兩大類(lèi)：一類(lèi)為基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）的分子診斷技術(shù)；另一類(lèi)是檢測(cè)患者感染新冠病毒后體內(nèi)產(chǎn)生的抗原或抗體的免疫診斷技術(shù)[7]。分子診斷技術(shù)是新冠病毒檢測(cè)的 金標(biāo)準(zhǔn)”，具有早期診斷、靈敏度高和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但其操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，需要專(zhuān)業(yè)人士進(jìn)行。免疫層析技術(shù)由于操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用。目前已有多種不同形式的免疫層析試紙被用于不同新冠感染相關(guān)標(biāo)志物的檢測(cè)，包括抗體、蛋白等，并有一些免疫層析試紙已經(jīng)獲批上市[8-11]。

雖然COVID-19 IgM抗體可反映近期感染，但病毒感染后COVID-19 IgM抗體的產(chǎn)生有滯后性（一般認(rèn)為須在感染后7 d產(chǎn)生）[12]。新冠抗原檢測(cè)兼具方便、快速和低價(jià)這3項(xiàng)優(yōu)勢(shì)，而相較抗體檢測(cè)，抗原檢測(cè)可對(duì)剛出現(xiàn)感染癥狀的患者及時(shí)檢測(cè)，可對(duì)疑似人群早期分流和快速管理，同時(shí)也可以滿(mǎn)足大規(guī)模人群篩查和欠發(fā)達(dá)地區(qū)應(yīng)用的需求[13]。本研究對(duì)基于膠體金免疫層析法研制的新冠檢測(cè)試劑盒進(jìn)行系統(tǒng)性的驗(yàn)證，以評(píng)估試劑盒在快速診斷COVID-19的價(jià)值，以便能提供準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，為及時(shí)防控疫情提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究設(shè)計(jì)與樣本采集

根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》[14]，該研究感染后出現(xiàn)癥狀的時(shí)間分布于多個(gè)時(shí)期（0～3 d（40%）、4～7 d（40%）、>7 d（20%）），共采集陽(yáng)性樣本209份，在病毒核酸RT-PCR檢測(cè)中的Ct值分布為10≤Ct＜20有61例，20≤Ct＜25有40例，25≤Ct＜30有56例，30≤Ct＜38有52例；另采集健康對(duì)照人群的401份陰性樣本。

1.2 主要材料和試劑

評(píng)估試劑新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）為杭州協(xié)合醫(yī)療用品有限公司自制；對(duì)照試劑新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）購(gòu)于華大生物科技（武漢）有限公司和深圳華大基因股份有限公司；復(fù)核試劑新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）購(gòu)于南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司；新冠滅活病毒培養(yǎng)物外購(gòu)于常州歐吉生物科技有限公司，初始濃度為7.8h 107TCID50/mL（TCID50即50%組織培養(yǎng)感染劑量，median tissue culture infective dose）。

1.3 抗原檢測(cè)試劑的制備

分別將雞IgY、新冠抗體N-M1205與膠體金顆粒偶聯(lián)在一起，用金標(biāo)稀釋液稀釋膠體金-新冠抗體N-M1205和膠體金-雞IgY，體積占比分別為50%和25%，用噴金機(jī)按2.0 μL/cm將溶液點(diǎn)在載體上，45 ℃烘干；將NC膜粘在PVC底板上，用劃膜稀釋液將新冠抗體N-M1204和羊抗雞IgY分別配制成一定濃度的溶液，后用劃膜儀將溶液均勻地噴在粘好的硝酸纖維素膜（NC膜）上，45 ℃烘干12～24 h；用樣品墊處理液涂布處理玻璃纖維，37 ℃烘干12～24 h；將制備好的片材、金標(biāo)墊、樣品墊及吸水濾紙組裝，用切條機(jī)切割成相應(yīng)的寬度，裝入檢測(cè)卡，鋁箔袋密封包裝。

測(cè)試時(shí)將鼻拭子樣本或鼻咽拭子插入裝有抗原提取緩沖液的抗原提取管中，拭子頭應(yīng)在抗原提取緩沖液中旋轉(zhuǎn)并混勻至少30 s，同時(shí)用手隔著管外壁擠壓拭子頭，將拭子頭液體擠干，取出棄去拭子，加入3滴樣本提取物至加樣孔中，結(jié)果應(yīng)在15～20 min。具體操作，如圖1所示。

圖1 抗原檢測(cè)試劑操作示意Fig.1 Procedure for COVID-19 antigen test kit assay

1.4 檢測(cè)試劑分析性能評(píng)估

根據(jù)LI等[15]和TAKEUCHI等[16]的研究，對(duì)檢測(cè)試劑的分析靈敏度、分析特異性、精密度和鉤狀效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。

1.4.1 分析靈敏度（最低檢測(cè)限）評(píng)價(jià)

將滴度為7.8h 107TCID50/mL的滅活病毒培養(yǎng)液依次稀釋2萬(wàn)倍（3.90h 103TCID50/mL），4萬(wàn)倍（1.95h 103TCID50/mL）、8萬(wàn)倍（9.75h 102TCID50/mL）、16萬(wàn)倍（4.875h 102TCID50/mL）和32萬(wàn)倍（2.438h 102TCID50/mL）進(jìn)行最低檢出限檢測(cè)，每種稀釋度重復(fù)檢測(cè)20次。

1.4.2 精密度評(píng)價(jià)

使用企業(yè)質(zhì)控品測(cè)定3批產(chǎn)品，每個(gè)濃度質(zhì)控品重復(fù)檢測(cè)5次，連續(xù)檢測(cè)5 d，共得到25個(gè)結(jié)果，計(jì)算25次檢測(cè)結(jié)果的陰/陽(yáng)性檢出率。

企業(yè)質(zhì)控品組成：企業(yè)陽(yáng)性質(zhì)控品（將一級(jí)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品（COVID-19重組抗原）原液稀釋為100萬(wàn)倍、20萬(wàn)倍、1000倍，作為企業(yè)陽(yáng)性質(zhì)控品P1～P3）；企業(yè)檢測(cè)限質(zhì)控品L1～L3（將一級(jí)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品原液稀釋為2000萬(wàn)倍、200萬(wàn)倍、100萬(wàn)倍）；企業(yè)重復(fù)性質(zhì)控品（一級(jí)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品原液稀釋100萬(wàn)倍，作為企業(yè)重復(fù)性質(zhì)控品J）。

1.4.3 分析特異性評(píng)價(jià)

將不同干擾物質(zhì)用健康人鼻咽拭子洗脫液為陰性基質(zhì)稀釋相應(yīng)質(zhì)控品，得到3種不同干擾樣本：①陰性質(zhì)控加入不同干擾物質(zhì)；②陽(yáng)性質(zhì)控P3加入不同干擾物質(zhì)；③檢測(cè)限質(zhì)控L3加入不同的干擾物質(zhì)，檢測(cè)干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果是否有影響。

對(duì)臨床上能引起相同或相似癥狀的常見(jiàn)交叉反應(yīng)病原微生物，在其醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證，通過(guò)在COVID-19滅活病毒培養(yǎng)液（9.75h 102TCID50/mL）中加入病原微生物制成陽(yáng)性干擾，陰性樣本加入病原微生物制成陰性干擾，對(duì)常見(jiàn)呼吸道病原體高濃度毒株進(jìn)行測(cè)試，確認(rèn)常見(jiàn)的病原微生物是否存在交叉反應(yīng)。

1.4.4 鉤狀效應(yīng)評(píng)價(jià)

將原始滴度為7.8h 107TCID50/mL的滅活病毒培養(yǎng)液，依次稀釋400倍、4000倍、20萬(wàn)倍、200萬(wàn)倍，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷是否存在鉤狀效應(yīng)。

1.4.5 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將試劑打開(kāi)，取出其中的抗原提取緩沖液，打開(kāi)蓋子放置于室溫下，用該緩沖液將P3配制成L1～L3濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，分別放置0 h、24 h、48 h和72 h后檢測(cè)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，使用3批產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，將每個(gè)結(jié)果與0 h進(jìn)行比較。

1.5 臨床性能評(píng)價(jià)

用iPonatic快速核酸檢測(cè)系統(tǒng)及杭州協(xié)合醫(yī)療用品有限公司制備的抗原檢測(cè)試劑盒同時(shí)取鼻咽拭子樣本進(jìn)行臨床比對(duì)測(cè)試；按說(shuō)明書(shū)用檢驗(yàn)試劑檢驗(yàn)標(biāo)本，將檢驗(yàn)結(jié)果記錄在表中。將結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)比較，分析試劑臨床檢測(cè)的性能，包括靈敏度（包括不同Ct值的陽(yáng)性樣本的靈敏度）、特異性以及與RT-PCR的總符合率。

采用SPSS V23.0和Excel 2010對(duì)試劑盒的臨床檢測(cè)性能進(jìn)行分析，計(jì)算Kappa (K)值，K≥0.75，具有高度的一致性；0.40

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)試劑的分析性能評(píng)估結(jié)果

2.1.1 分析靈敏度（最低檢測(cè)限）

熱滅活的病毒培養(yǎng)液稀釋到滴度為9.75h 102T C I D50/m L 時(shí)，所有檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性；再稀釋至4.875h 102TCID50/mL時(shí)，僅有7次陽(yáng)性結(jié)果，計(jì)算出陽(yáng)性檢出率為35%，病毒培養(yǎng)液稀釋至滴度為2.438h 102TCID50/mL時(shí)，所有結(jié)果均為陰性（見(jiàn)表1）。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定試劑最低檢測(cè)限為9.75h 102TCID50/mL。

表1 分析靈敏度測(cè)試結(jié)果Tab.1 Results of analysis sensitivity test

2.1.2 精密度

表2顯示L1濃度時(shí)有部分檢測(cè)結(jié)果為陰性，數(shù)量不大于測(cè)試總數(shù)的1/3，其余為陽(yáng)性；檢出限參考品L2～L3、重復(fù)性質(zhì)控品J和陽(yáng)性參考品P1～P3的陽(yáng)性檢出率均為100%，且條帶結(jié)果顯色均一，表明抗原檢測(cè)試劑的精密度良好。

表2 精密度測(cè)試結(jié)果Tab.2 Results of precision test

2.1.3 藥物和血液中若干物質(zhì)的干擾試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，2 mg/mL的血紅蛋白和黏蛋白、5 mg/L人抗鼠抗體（HAMA）、10 mg/mL生物素、500 μg/mL黏液、120 μg/mL色甘酸鈉、60 μg/mL鹽酸羥甲唑啉、200 μg/mL的鹽酸去氧腎上腺素和N-乙酰對(duì)氨基苯酚、3 μg/mL的慶大霉素、阿司匹林、布洛芬、嗎啉鹽酸鹽、頭孢氨芐、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、萬(wàn)古霉素、萘啶酸、氫化可的松、人胰島素，以及30 μg/mL的β-丙內(nèi)酯均不會(huì)影響本品的檢測(cè)結(jié)果。

2.1.4 呼吸道疾病病原體干擾試驗(yàn)結(jié)果（分析特異性）

COVID-19是一種由冠狀病毒引起的呼吸道疾病，它的癥狀類(lèi)似其他類(lèi)型的呼吸道疾病和流感。為了確認(rèn)產(chǎn)品特異性，使用29種常見(jiàn)交叉反應(yīng)病原微生物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示對(duì)下述的病原微生物無(wú)交叉反應(yīng)（見(jiàn)表3），證明試劑特異性較好。

表3 常見(jiàn)病原微生物的干擾Tab.3 Interference from common pathogenic microorganisms

2.1.5 試劑穩(wěn)定性

表4顯示，抗原提取緩沖液室溫放置24 h、48 h和72 h后三個(gè)濃度的參考品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，與0 h相比無(wú)明顯差異。

表4 試劑穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Results of reagent stability verification

2.1.6 鉤狀效應(yīng)

當(dāng)病毒培養(yǎng)液滴度達(dá)到7.8h 107TCID50/mL時(shí)，未觀(guān)察到高劑量鉤狀效應(yīng)。相比初始濃度，原液稀釋20萬(wàn)倍后條帶顏色變?nèi)?；直至原液濃度稀?00萬(wàn)倍，試紙條帶十分微弱，甚至無(wú)明顯條帶顯現(xiàn)。高劑量鉤狀效應(yīng)驗(yàn)證如圖2所示。

圖2 高劑量鉤狀效應(yīng)驗(yàn)證Fig.2 High-dose hook effect validation

2.2 臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)

2.2.1 試劑盒的臨床檢測(cè)靈敏度、特異性及與RT-PCR結(jié)果的總符合率

本研究試劑盒臨床檢測(cè)的靈敏度和特異性樣本總數(shù)為610個(gè)，其中209個(gè)為陽(yáng)性，401個(gè)為陰性。與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果相比，本抗原檢測(cè)有3例漏檢樣本和4例假陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果，臨床統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5所示，該產(chǎn)品的靈敏度為98.56%（置信區(qū)間為95.87%～99.51%），特異性為99.00 %（置信區(qū)間為97.46%～99.61%），與RT-PCR結(jié)果的總符合率為98.85%（置信區(qū)間為97.65%～99.44%）。K值為0.9745，大于0.75，試驗(yàn)結(jié)果顯示，本產(chǎn)品與新型冠狀病毒核酸檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性?；谀z體金法建立的新冠抗原檢測(cè)試劑盒與核酸檢測(cè)結(jié)果基本一致，臨床評(píng)價(jià)良好，達(dá)到了預(yù)期的研究目的。

表5 臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)Tab.5 Results of clinical performance evaluation

2.2.2 不同Ct值陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)靈敏度

對(duì)不同C t 值陽(yáng)性樣本進(jìn)行分層分析，顯示10≤Ct＜20有61例，占全部陽(yáng)性樣本的29.19%，試劑檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，檢測(cè)靈敏度為100.00%；20≤Ct＜25有40例，占總陽(yáng)性樣本的19.14%，其中1例結(jié)果為陰性，檢測(cè)靈敏度為97.50%；25≤Ct＜30有56例，占總陽(yáng)性樣本的26.79%，其中2例結(jié)果為陰性，檢測(cè)靈敏度為96.43%；30≤Ct＜38有52例，占總陽(yáng)性樣本的24.88%，結(jié)果均為陽(yáng)性，檢測(cè)靈敏度為100%，結(jié)果表明該抗原檢測(cè)試劑性能優(yōu)越（見(jiàn)表6）。對(duì)抗原檢測(cè)結(jié)果與核酸檢測(cè)結(jié)果不一致的病例，用已上市的抗原試劑進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果與本公司試劑的檢測(cè)結(jié)果一致。

表6 不同Ct值陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)靈敏度Tab.6 Results of detection sensitivity of positive specimens with different Ct values

3 討論

免疫層析法能夠快速檢測(cè)人體是否含有抗原或抗體，是現(xiàn)有核酸檢測(cè)法良好的補(bǔ)充手段，該方法對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室的操作要求更低，在基層實(shí)驗(yàn)室即可完成，而且對(duì)檢驗(yàn)人員的要求也沒(méi)有核酸檢測(cè)那么高，簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可操作[17-18]。由于低病毒載量可能導(dǎo)致假陰性，因此抗原檢測(cè)試劑的分析性能評(píng)估是十分重要的步驟，試劑的精確度、靈敏度和特異性是基礎(chǔ)[19]。本研究的目的是評(píng)估生產(chǎn)的抗原檢測(cè)試劑盒診斷SARS-CoV-2感染（包括變異株）的分析敏感性和特異性。數(shù)據(jù)顯示該抗原檢測(cè)試劑的檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果基本一致，臨床評(píng)價(jià)良好。

分析特異性是指試劑盒對(duì)樣品中的非特異性物質(zhì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)的可能性，有時(shí)也指與應(yīng)該反應(yīng)的物質(zhì)不發(fā)生反應(yīng)的可能性，即假陰性。同時(shí)，要識(shí)別可能引起類(lèi)似臨床癥狀的其他病毒的交叉干擾[20-21]。試驗(yàn)結(jié)果證明研究建立的抗原檢測(cè)試劑性能良好，與29種常見(jiàn)呼吸道病原微生物均無(wú)交叉反應(yīng)，分析敏感性和特異性表現(xiàn)優(yōu)異。經(jīng)驗(yàn)證，本抗原檢測(cè)試劑提取液在開(kāi)封三天內(nèi)使用無(wú)差異，但考慮到使用時(shí)所處環(huán)境可能更加惡劣，特別是在室溫高于30 ℃或高度潮濕的環(huán)境中，應(yīng)盡快使用?？傮w來(lái)看，新型冠狀病毒（2019-nCoV）檢測(cè)試劑盒（膠體金法）與核酸檢測(cè)結(jié)果一致性較高，按照Ct值分層，靈敏度相對(duì)較高；有一部分核酸檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，而抗原檢測(cè)結(jié)果為陰性，分析其可能原因是用抗原檢測(cè)試劑檢測(cè)時(shí)，在檢出限范圍內(nèi)檢測(cè)結(jié)果呈陰性，是因?yàn)楹怂岜鹊鞍捉到饪?，或者是核酸轉(zhuǎn)錄到一半時(shí)細(xì)胞破裂，此時(shí)蛋白組裝未完成，其含量未達(dá)到檢測(cè)試劑的檢出限要求，因此核酸檢測(cè)試劑能檢測(cè)到，而抗原檢測(cè)試劑無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)。我們同時(shí)用已上市的抗原檢測(cè)試劑檢測(cè)樣本，復(fù)檢結(jié)果仍為陽(yáng)性，也能說(shuō)明其原因。

根據(jù)評(píng)估其檢測(cè)結(jié)果具有指導(dǎo)意義[22]，總體上能滿(mǎn)足臨床需求?？乖瓩z測(cè)的主要優(yōu)點(diǎn)是快速、易于解釋、可居家自行操作。但本試劑也存在一些缺陷，只能進(jìn)行定性檢測(cè)且結(jié)果存在一定誤差，有待今后進(jìn)一步完善。

4 結(jié)論

通過(guò)分析性能評(píng)估，本試劑的最低檢出限為9.75h 102TCID50/mL；測(cè)試29種常見(jiàn)呼吸道病原體均無(wú)交叉反應(yīng)。臨床鼻咽拭子樣本及健康人群鼻拭子樣本測(cè)試，分析靈敏度為98.56%（置信區(qū)間95.87%～99.51%），分析特異性為99.00%（置信區(qū)間97.46%～99.61%），準(zhǔn)確度為98.85%（置信區(qū)間97.65%～99.44%）；一致性檢驗(yàn)K值為0.9745。對(duì)不同Ct值陽(yáng)性樣本進(jìn)行分層分析，各個(gè)層級(jí)內(nèi)檢測(cè)靈敏度優(yōu)良。結(jié)果表明COVID-19抗原檢測(cè)試劑檢測(cè)靈敏度和特異性高，檢測(cè)速度快，操作便攜，可作為現(xiàn)有核酸檢測(cè)法的補(bǔ)充手段，用于新型冠狀病毒感染的早期篩查。