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      代用茶茶湯中功能性成分組成及含量分析

      2023-02-14 00:57:24趙珊楊飛洋秦琳李曦黃世群鄭幸果雷欣宇仲伶俐
      食品研究與開發(fā) 2023年2期
      關鍵詞:代用茶湯總酚

      趙珊,楊飛洋,秦琳,李曦,黃世群,鄭幸果,雷欣宇,仲伶俐*

      (1.四川省農業(yè)科學院 農業(yè)質量標準與檢測技術研究所,四川 成都 610066;2.西南科技大學 生命科學與工程學院,四川 綿陽 621010)

      代用茶指除茶以外,以國家行政主管部門公布的可用于食品的植物花及花蕾、芽葉、果(實)、根莖等為原料,經加工制作,采用沖泡(浸泡或煮)的方式,供人們飲用的產品[1]。根據原料的不同,代用茶可分為葉類、花類、果(實)類、根莖類和混合類[1]。目前市場上代用茶的產品種類已超過100種,銷量占到傳統茶的30%左右[2],較為常見的代用茶有苦蕎、菊花、玫瑰花、枸杞、大棗、金銀花、蒲公英、桑葉、決明子、牛蒡根、陳皮、山楂等。代用茶現今較為普遍,主要是由于它們大都富含酚酸、黃酮、氨基酸等功能性成分,具有抗氧化、抗衰老、調節(jié)心血管類疾病等功效[3-6],而且攝入方式也較簡單,沖泡即可。目前針對各種代用茶功能性成分的研究較多[7-12],但綜合全面比較多種代用茶的相關研究較少。此外,針對像多酚、黃酮、花青素這類功能性成分的分析多是采用一定比例的有機溶劑進行提取,比如標準GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測方法》、NY/T 1295—2007《蕎麥及其制品中總黃酮含量的測定》和NY/T 2640—2014《植物源性食品中花青素的測定高效液相色譜法》,然而人們日常飲茶都用水沖泡,有機試劑提取測定的含量并不能真實反映從茶湯中攝入的含量,關于代用茶茶湯中功能性成分的含量情況也鮮有研究。本研究以18種代用茶為研究對象,分析其茶湯中的游離氨基酸、多酚、黃酮、花青素、糖類等功能性成分的組成和含量,探究各種代用茶的功能成分差異和食用價值,并探討兩種提取方法對總酚、總黃酮和花青素浸出的影響,為產品開發(fā)和消費選擇提供新的思路和科學依據。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      代用茶(1.蒲公英;2.黑苦蕎;3.黃金苦蕎;4.全株苦蕎;5.桑葉茶;6.茉莉花;7.胎菊;8.金盞菊;9.玫瑰花;10.決明子;11.荷葉;12.金銀花;13.紅棗片;14.黑枸杞;15.山楂片;16.陳皮;17.紅枸杞;18.牛蒡根):市售。

      標準品(純度均大于 97%):丙氨酸(alanine,Ala)、精氨酸(arginine,Arg)、天冬酰胺(asparagine,Asn),天冬氨酸(aspartic acid,Asp)、胱氨酸(cysteine,Cys)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,Gaba)、谷氨酰胺(glutamine,Gln)、谷氨酸 (glutamic acid,Glu)、 甘氨酸(glycine,Gly)、組氨酸 (histidine,His)、 異 亮 氨 酸(isoleucine,Ile)、亮氨酸(leucine,Leu)、賴氨酸(lysine,Lys)、蛋氨酸(methionine,Met)、苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)、脯氨酸(proline,Pro)、絲氨酸(serine,Ser)、茶氨酸(theanine,The)、蘇氨酸(threonine,Thr)、酪氨酸(tyrosine,Tyr)、纈氨酸(valine,Val):美國 A chemtek 公司;沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、2-羥基肉桂酸、3-羥基肉桂酸、反式肉桂酸、水楊酸、3,5-二羥基苯甲酸、2,3,4-三羥基苯甲酸、龍膽酸、焦兒茶酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異阿魏酸、芥子酸、果糖、葡萄糖、蔗糖:美國Sigma-Aldrich公司;綠原酸:德國Dr.Ehrenstorfer公司;新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C:武漢天植生物技術有限公司;1-咖啡酰奎寧酸、1,3-雙咖啡??鼘幩帷?,5-雙咖啡??鼘幩幔撼啥计杖鸱萍奸_發(fā)有限公司;蘆丁:日本和光純藥公司;飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、芍藥素、錦葵色素:美國ChromaDex公司;福林酚試劑:國藥集團化學試劑有限公司;乙腈、甲醇、無水乙醇、甲酸(均為色譜純):上海安譜科技股份有限公司;碳酸鈉、乙酸鉀、三氯化鋁、鹽酸、乙酸(均為分析純):廣東西隴化工股份有限公司。

      1.2 儀器與設備

      ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-XS超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀:美國Waters公司;1100高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器和示差折光檢測器:美國Agilent公司;UV2550紫外分光光度計、AUY220型電子天平:日本島津公司;SFG-02B電熱鼓風干燥箱:黃石市恒豐醫(yī)療器械公司;SHA-CA恒溫水浴振蕩器:常州榮華儀器制造有限公司;KQ5200DE超聲波清洗機:昆明市超聲儀器有限公司;UPH-1-20L實驗室超純水儀:四川優(yōu)普超純科技有限公司。

      1.3 方法

      1.3.1 提取液的制備

      1.3.1.1 茶湯的制備

      準確稱取1.0 g粉碎樣品于200 mL三角瓶中,加入90 mL的沸水,立即移入沸水浴中浸提30 min,浸提完后冷卻至室溫,轉移至100 mL容量瓶并用水定容,過濾后即為待測茶湯。

      1.3.1.2 醇提取物的制備

      準確稱取1.0g樣品于200mL三角瓶中,加入90mL 70%甲醇水溶液于60℃超聲輔助浸提30 min,定容至100 mL,過濾后待測。

      1.3.2 成分指標測定

      1.3.2.1 游離氨基酸的測定

      參照GB/T 30987—2020《植物中游離氨基酸的測定》,采用超高效液相色譜-串聯質譜(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法進行測定,并加以改進和優(yōu)化。移取1.0 mL茶湯于10 mL容量瓶中,用50%乙腈水溶液稀釋并定容至刻度,混勻后過0.22 μm微孔過濾膜待測,結果以干基(mg/g DW)表示,重復3次。

      色譜條件:色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);柱溫:25 ℃;進樣量:1.0 μL;流動相 A:10 mmol/L 甲酸銨-水溶液;流動相B:10 mmol/L 甲酸銨-乙腈溶液;流速:0.2 mL/min;梯度洗脫程序:0~10.5 min,95%~70%B;10.5 min~11 min,70%~40%B;11 min~12 min,40%B;12 min~12.5 min,40%~95%B;后運行 2.5 min。

      質譜條件:離子源為電噴霧電離源(electrospray ionization,ESI);掃描方式:正離子模式;監(jiān)測模式:多重反應監(jiān)測模式(multiple response monitoring,MRM);毛細管電壓2.50 kV;離子源溫度150℃;脫溶劑氣溫度500℃;脫溶劑氣流量1 000 L/h;碰撞氣流速0.15 mL/min;錐孔氣流速150 L/h。

      標準溶液的配制:稱取21種氨基酸標準品各10 mg,分別用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定容至10 mL,貯存于棕色玻璃瓶中,0℃~4℃保存。氨基酸混合標準工作液采用梯度稀釋法現配現用。

      1.3.2.2 總酚和總黃酮的測定

      總酚含量的測定參照文獻[13],以沒食子酸為標準品,采用福林酚法測定上述茶湯和醇提取物中總多酚含量,結果以干基樣品中沒食子酸當量(gallic acid equivalent,GAE)表示(單位為mgGAE/gDW),重復3次。

      總黃酮含量的測定參照文獻[14],以蘆丁為標準品,采用三氯化鋁比色法測定上述茶湯和醇提取物中總黃酮含量,結果以干基樣品中蘆丁當量(rutin equivalent,RE)表示(單位為 mg RE/g DW),重復 3次。

      1.3.2.3 游離酚酸的UPLC-MS/MS分析

      將1.3.1茶湯稀釋合適的倍數進行UPLC-MS/MS分析,參照文獻[15]進行測定,結果以干基(mg/g DW)表示,重復3次。

      標準溶液的配制:分別稱取酚酸標準品各10mg,用甲醇溶解并定容至10 mL,貯存于棕色玻璃瓶中,-20℃保存。酚酸混合標準工作液采用梯度稀釋法現配現用。

      1.3.2.4 花青素的測定

      移取1.3.1玫瑰花和黑枸杞樣品的茶湯20 mL于磨口錐形瓶中,加入6 mol/L鹽酸溶液20 mL,混勻后在沸水浴中回流水解1 h,轉移至100 mL容量瓶并定容,取上清液過0.22 μm微孔過濾膜后上機測定飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素和錦葵色素的含量。采用溶劑為無水乙醇:濃鹽酸:水=2:1:1(體積比)對玫瑰花和黑枸杞進行花青素的提取和水解并測定花青素的含量,具體參照標準NY/T 2640—2014《植物源性食品中花青素的測定高效液相色譜法》。色譜柱:采用Waters Sunfire C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),上機條件參照標準 NY/T 2640—2014。

      1.3.2.5 可溶性糖和多糖的測定

      將1.3.1.1茶湯過0.22 μm微孔過濾膜后上機測定果糖、葡萄糖和蔗糖的含量,具體參照GB 5009.8—2016《食品安全國家標準食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》,檢測器:示差折光檢測器;色譜柱:Agilent Polarls NH2(4.6 mm×250 mm,5 μm),;流動相:90%乙腈水溶液;流速1.0 mL/min。

      多糖的測定參照SN/T 4260—2015《出口植物食品中粗多糖的測定苯酚-硫酸法》并稍加改動,稱取樣品0.2 g于50 mL具塞離心管中,加入80%乙醇溶液超聲30 min、離心后去掉上清液,重復1次。將沉淀用80 mL水轉移至具塞三角瓶中,沸水浴30 min后轉移至100 mL容量瓶并定容,過濾后待測定,顯色方法同SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測定苯酚-硫酸法》。

      1.3.2.6 水分和水浸出物的測定

      水分采用直接干燥法,參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》;水浸出物參照《中國藥典》2020年版通則2201中水溶性浸出物測定法。

      1.4 數據處理

      采用Excel 2010和SPSS 22.0軟件進行數據分析和統計分析,采用Origin 2019軟件進行圖表的繪制。采用單因素方差分析評估不同樣品或方法間的統計差異,然后進行LSD檢驗。

      2 結果與分析

      2.1 UPLC-MS/MS測定代用茶中游離氨基酸方法的建立與優(yōu)化

      通過優(yōu)化液相條件和質譜參數,21種氨基酸得到了較好的峰形和分離度。在正離子模式下,分別對21種氨基酸進行掃描,確定特征離子對,進一步優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量、駐留時間等參數,使分子離子與特征碎片離子產生的離子對強度達到最大,確定豐度較高的兩個子離子作為定性離子,并選擇其中豐度最高的作為定量離子,具體質譜參數見表1。

      表1 目標化合物的質譜分析參數Table 1 UPLC-MS/MS parameters for target compounds

      2.2 不同代用茶茶湯中的游離氨基酸含量分析

      不同代用茶茶湯中游離氨基酸組成與含量見圖1。

      圖1 不同代用茶茶湯中游離氨基酸組成與含量Fig.1 Composition and content of free amino acids in different substitute tea soups

      本研究選取的18種代用茶游離氨基酸組成和含量各不相同,其中最多檢測出18種,包括Ala、Arg、Asn、Asp、GABA、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、Val(圖1A),其中含量較高的氨基酸包括Arg、Asn和 Pro,其次是 Gaba、Gln和 Glu。 游離氨基酸總量在大部分代用茶樣品中含量差異顯著(P<0.05),含量最高的樣品是玫瑰花(42.8 mg/g DW),其次是牛蒡根(38.4 mg/g DW),含量在10 mg/g DW~30 mg/g DW范圍的樣品有蒲公英、桑葉茶、金盞菊、金銀花和紅枸杞,含量在5 mg/g DW~10 mg/g DW范圍的樣品有茉莉花、胎菊、荷葉、紅棗片、黑枸杞和陳皮,其余含量低于5 mg/g DW,金盞菊的必需氨基酸組成比例較高(圖1B)。

      2.3 代用茶茶湯中酚酸、黃酮的含量

      18種代用茶茶湯中總酚和總黃酮的含量情況見圖2。采用高效液相色譜法測定了玫瑰花和黑枸杞中的6種花青素,結果見表2。

      表2 代用茶中花青素的組成與含量Table 2 Composition and content of anthocyanins in substitute teas mg/g DW

      圖2 不同代用茶茶湯游離酚酸組成與含量Fig.2 Composition and content of free phenolic acids in different substitute tea soups

      采用UPLC-MS/MS測定了代用茶茶湯中27種酚酸類成分,發(fā)現18種代用茶中主要檢測出14種游離酚酸(圖2A),包括新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、1,3-雙咖啡??鼘幩?、1,5-雙咖啡??鼘幩帷惥G原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、沒食子酸、對香豆酸和阿魏酸。含量較高的酚酸有新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、1,5-雙咖啡??鼘幩?;大部分代用茶間游離酚酸總量差異顯著(P<0.05),含量較高的樣品有胎菊(53.7 mg/g DW)和金銀花(54.7 mg/g DW),其次是玫瑰花、桑葉茶、牛蒡根和金盞菊(圖2B)。

      由表2可知,花青素含量為2.0 mg/g DW~9.3 mg/g DW,天竺葵色素在這兩個樣品中都未檢出,玫瑰花的花青素組成是矢車菊色素和芍藥素,黑枸杞的花青素組成是矮牽牛色素、錦葵色素和飛燕草色素。

      2.4 提取方式對代用茶中總酚、總黃酮和花青素含量的影響

      不同提取方式對代用茶樣品中總酚、總黃酮和花青素含量的影響見圖3。

      圖3 不同提取方式對代用茶樣品中總酚、總黃酮和花青素含量的影響Fig.3 Effects of different extraction methods on the contents of total phenols,total flavonoids and anthocyanins in substitute teas

      總酚的含量為 7.66 mg GAE/g DW~181.05 mg GAE/g DW,含量最高的是玫瑰花,最低的是茉莉花。總酚含量超過30 mg GAE/g DW的樣品有胎菊、玫瑰花、荷葉、金銀花、黑枸杞、山楂片和牛蒡根。茶湯中總黃酮含量為1.27 mg RE/g DW~41.03 mg RE/g DW,含量最高和最低的分別是荷葉和紅棗片??傸S酮含量超過20 mg RE/g DW的樣品有茉莉花、胎菊和荷葉,含量在10 mg RE/g DW~20 mg RE/g DW的樣品有黑苦蕎、黃金苦蕎、桑葉茶、玫瑰花和金銀花。

      醇提總酚含量為13.7mgGAE/gDW~182.0mgGAE/g DW,醇提總黃酮含量為2.0 mg RE/g DW~53.5 mg RE/g DW,醇提花青素含量為2.2 mg/g DW~10.5 mg/g DW。通過結果對比發(fā)現,醇提取的總酚、總黃酮和花青素含量大都高于茶湯,且不同樣品間差異不同。兩種提取方式下,蒲公英、桑葉茶、胎菊、玫瑰花、金銀花、山楂片和紅枸杞的總酚含量間差異不顯著(P>0.05),其余代用茶樣品差異顯著(P<0.05),全株苦蕎和茉莉花茶湯總酚分別占醇提總酚的29.0%和36.2%,其余樣品中茶湯總酚占醇提總酚的64.1%以上;除玫瑰花以外,兩種提取方式在不同代用茶樣品的總黃酮含量間差異顯著(P<0.05),蒲公英、全株苦蕎、黑枸杞和山楂片的茶湯總黃酮分別占醇提總黃酮的37.2%、50.1%、38.8%和34.7%,其余樣品茶湯總黃酮占醇提總黃酮的61.2%以上。兩種提取方式下的花青素含量差異顯著(P<0.05),玫瑰花和黑枸杞茶湯花青素總量分別占醇提花青素總量的94.7%和88.4%。

      2.5 代用茶中水浸出物、可溶性糖和多糖含量

      不同代用茶中水浸出物、可溶性糖和多糖的含量見表3。

      表3 不同代用茶中水浸出物、可溶性糖和多糖的含量Table 3 Contents of water extract,soluble sugar and polysaccharide in different substitute teas %DW

      18種代用茶樣品中水浸出物的含量是13.1%DW~86.6%DW,其中3種苦蕎、決明子和荷葉的水浸出物含量低于30%,5種花類、蒲公英和桑葉茶含量范圍為30%~50%DW,果實類和牛蒡根的含量高于50%。其中糖含量占水浸出物的比例較高,為12.1%~98.0%。

      果實類中以果子為材料的代用茶中可溶性糖含量都較高,為32.7%DW~83.6%DW,果實類中以種子為材料的代用茶中未檢出可溶性糖,葉類和花類不同樣品間差異較大,含量為1.1%DW~21.2%DW。

      18種代用茶中有15種測定出不同含量的多糖,而3種苦蕎樣品溶液遇碘變藍,說明是可溶性淀粉。多糖的含量是1.2%DW~6.4%DW,可溶性淀粉含量是5.2%DW~9.5%DW,多糖含量較高的是金盞菊、決明子、金銀花、陳皮和紅枸杞,含量較低的是紅棗片和牛蒡根。

      3 結論與討論

      3.1 代用茶中功能性成分的組成與含量

      18種代用茶茶湯的主要成分有可溶性糖、多糖、游離氨基酸、酚酸、黃酮等,部分含有花青素。不同成分間含量差異較大,水浸出物含量為13.1%DW~86.6%DW;可溶性糖含量為1.1%DW~83.6%DW;多糖含量為1.2%DW~6.4%DW;總酚含量為7.7 mg GAE/g DW~181.1 mg GAE/g DW;總黃酮含量為1.3 mg RE/g DW~41.0 mg RE/g DW;游離氨基酸含量為1.0 mg/g DW~42.8 mg/g DW,共檢出18種,含量較高的有Arg、Asn和Pro;游離酚酸含量為0~54.7 mg/g DW,共檢出14種,大都是綠原酸類化合物;花青素含量為2.0 mg/g DW~9.3 mg/g DW。玫瑰花的游離氨基酸和總酚含量最高,荷葉總黃酮含量最高,金盞菊多糖含量最高,金銀花和胎菊中綠原酸類成分含量較高,黑枸杞中矮牽牛色素含量較高。此外,功能性成分的組成和含量還與品種、產地、生產方式等相關[16-18]。除了本研究測定的成分,不同的代用茶還有其特有的活性成分,如蒲公英有萜類和甾醇等[19-20],桑葉有生物堿等[21]。

      3.2 功能性成分在代用茶茶湯中的浸出情況

      不同的功能性成分有著不同的化學性質和溶解性,不同的代用茶中功能性成分也千差萬別,因此,采用水對代用茶進行沖泡浸出的大都是水溶性成分。水溶性的活性成分有糖類、有機酸、氨基酸、水溶性維生素、核苷類、皂苷等[22],黃酮、多酚類物質部分溶于水,主要取決于這部分物質的化學結構、酚羥基數量、結合糖苷情況等[23]。本研究中不同提取溶劑對代用茶樣品中總酚和總黃酮提取的結果表明,茶湯中總酚、總黃酮和花青素的含量除少數樣品外,大部分樣品為醇提取的60%以上。水提和醇提對代用茶中多酚和黃酮的提取差異與樣品本身有關,綜上認為水提和醇提的差異主要取決于樣品所含的多酚和黃酮類成分的差異及其水溶性。此外,沖泡方式和沖泡條件對代用茶活性成分的浸出有著較大的影響,不同的代用茶需根據具體情況選擇合適的沖泡方式和沖泡條件[24-27]。

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