鄧 麗，文振華，田 鋒，姚芳玲

株洲市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，湖南株洲 412000

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一類以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變以及繼發(fā)性骨質(zhì)增生、骨贅形成為特征的慢性骨關(guān)節(jié)疾病，主要的臨床癥狀是關(guān)節(jié)疼痛和活動(dòng)受限，嚴(yán)重者會(huì)發(fā)展為關(guān)節(jié)畸形。目前，OA主要的保守治療方法是使用非甾體類藥物進(jìn)行抗炎和鎮(zhèn)痛，尚缺乏逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)軟骨損害的特異性手段[1-2]。艾拉莫德是一種新型的抗風(fēng)濕小分子藥物，具有抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫的生物學(xué)功能，臨床上用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療能夠有效抑制關(guān)節(jié)滑膜中炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的激活[3]。在OA的發(fā)病過程中，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的異常激活是造成軟骨退行性改變重要的生物學(xué)因素[4]，國(guó)內(nèi)一項(xiàng)基礎(chǔ)研究報(bào)道艾拉莫德對(duì)白細(xì)胞介素(IL)-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)水解具有改善作用[5]，但該藥物是否直接改善OA發(fā)病過程中關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡尚不清楚。因此，本研究將以IL-1β刺激關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的方式建立OA細(xì)胞模型，具體觀察艾拉莫德對(duì)OA細(xì)胞模型凋亡及炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用及分子機(jī)制，旨在為發(fā)現(xiàn)OA治療的新藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 小鼠軟骨細(xì)胞株ATDC5購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.2儀器與試劑 細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自英國(guó)Herocell公司，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品，凝膠電泳儀及成像儀均為上海天能公司產(chǎn)品。達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)及胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，艾拉莫德片購(gòu)自海南先聲藥業(yè)有限公司，CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)MCE公司，IL-1β購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，pcDNA質(zhì)粒、pcDNA-TLR4質(zhì)粒購(gòu)自上海生工公司，TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，細(xì)胞因子的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購(gòu)自上海西唐公司，兔抗小鼠裂解型caspase-3(Cleaved caspase-3)、Toll樣受體4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)p-p65、β-actin特異性一抗及山羊抗兔辣根過氧化物酶二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) ATDC5細(xì)胞在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)進(jìn)行胰蛋白酶消化并按照1∶3的比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2細(xì)胞分組 傳代的ATDC5細(xì)胞接種在培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行分組，對(duì)照組用不含藥物的培養(yǎng)基處理，模型組用含有10 ng/mL IL-1β的培養(yǎng)基處理，不同濃度艾拉莫德組用含有10 ng/mL IL-1β及不同濃度(0.6、1.2、1.8 mg/L)艾拉莫德處理；pcDNA對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA質(zhì)粒，pcDNA模型組在含有10 ng/mL IL-1β的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染pcDNA質(zhì)粒，pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組在含有10 ng/mL IL-1β及1.8 mg/L艾拉莫德的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染pcDNA質(zhì)粒，pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組在含有10 ng/mL IL-1β及1.8 mg/L艾拉莫德的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染pcDNA-TLR4質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染均采用脂質(zhì)體法。每組做4個(gè)復(fù)孔，均連續(xù)給藥或轉(zhuǎn)染48 h。

1.3.3CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 收集細(xì)胞，采用CCK8法進(jìn)行細(xì)胞增殖的檢測(cè)，每孔加入10 μL試劑盒檢測(cè)液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)A490，并以A490表示細(xì)胞增殖活力。

1.3.4TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定后進(jìn)行TUNEL法檢測(cè)，先加入TUNEL染液進(jìn)行染色，漂洗后加入DAPI染液進(jìn)行染色，最后用抗熒光猝滅封片液封片后在顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，對(duì)TUNEL陽性細(xì)胞和DAPI陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.5ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子水平 收集細(xì)胞培養(yǎng)基，采用ELISA試劑盒檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-8的水平。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 收集細(xì)胞，加入裂解液、裂解細(xì)胞、提取蛋白，檢測(cè)蛋白濃度后將含有20 μg蛋白的樣本加入聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行垂直電泳及水平電轉(zhuǎn)膜；取電轉(zhuǎn)后的硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后Cleaved caspase-3、TLR4、NF-κB p-p65特異性一抗4 ℃孵育過夜；次日孵育二抗后在凝膠成像儀中進(jìn)行ECL顯影，得到蛋白條帶并掃描灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算Cleaved caspase-3、TLR4、NF-κB p-p65的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1艾拉莫德對(duì)OA軟骨細(xì)胞模型凋亡水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組A490降低、凋亡率增加(P<0.05)；與模型組比較，不同濃度艾拉莫德組A490升高、凋亡率降低(P<0.05)且艾拉莫德調(diào)節(jié)增殖活力凋亡的作用呈濃度依賴。TUNEL染色見圖1，A490及凋亡率的比較見表1。

表1 對(duì)照組、模型組、不同濃度艾拉莫德組A490及凋亡率的比較

注：A為對(duì)照組；B為模型組：C為0.6 mg/L艾拉莫德組；D為1.2 mg/L艾拉莫德組；E為1.8 mg/L艾拉莫德組。

2.2艾拉莫德對(duì)OA軟骨細(xì)胞模型凋亡基因表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組Cleaved caspase-3的表達(dá)水平增加(P<0.05)；與模型組比較，不同濃度艾拉莫德組Cleaved caspase-3的表達(dá)水平降低(P<0.05)且艾拉莫德調(diào)節(jié)Cleaved caspase-3表達(dá)的作用呈濃度依賴,見圖2。

注：A為對(duì)照組；B為模型組；C為0.6 mg/L艾拉莫德組；D為1.2 mg/L艾拉莫德組；E為1.8 mg/L艾拉莫德組。與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.3艾拉莫德對(duì)OA軟骨細(xì)胞模型炎癥反應(yīng)的影響 與對(duì)照組比較，OA模型組TNF-α、IL-6、IL-8水平增加(P<0.05)；與OA組比較，不同濃度艾拉莫德組組TNF-α、IL-6、IL-8水平降低(P<0.05)且艾拉莫德調(diào)節(jié)組TNF-α、IL-6、IL-8水平的作用呈濃度依賴。見表2。

表2 對(duì)照組、模型組、不同濃度艾拉莫德組TNF-α、IL-6、IL-8水平比較

2.4艾拉莫德對(duì)OA軟骨細(xì)胞模型TLR4、NF-κB p-p65表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組TLR4、NF-κB p-p65的表達(dá)水平增加(P<0.05)；與OA組比較，不同濃度艾拉莫德組TLR4、NF-κB p-p65的表達(dá)水平降低(P<0.05)且艾拉莫德調(diào)節(jié)TLR4、NF-κB p-p65表達(dá)的作用呈濃度依賴。見圖3。

注：A為對(duì)照組；B為模型組；C為0.6 mg/L艾拉莫德組；D為1.2 mg/L艾拉莫德組；E為1.8 mg/L艾拉莫德組；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.5過表達(dá)TLR4對(duì)艾拉莫德抑制OA軟骨細(xì)胞模型TLR4、NF-κB p-p65表達(dá)的影響 與pcDNA對(duì)照組比較，pcDNA模型組中TLR4、NF-κB p-p65的表達(dá)水平增加(P<0.05)；與pcDNA模型組比較，pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組中TLR4、NF-κB p-p65的表達(dá)水平降低(P<0.05)；與pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組比較，pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組中TLR4、NF-κB p-p65的表達(dá)水平增加(P<0.05)。見圖4。

注：A為pcDNA對(duì)照組；B為pcDNA模型組；C為pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組；D為pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組；與pcDNA對(duì)照組比較，*P<0.05；與pcDNA模型組比較，#P<0.05；與pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組比較，△P<0.05。

2.6過表達(dá)TLR4對(duì)艾拉莫德降低OA軟骨細(xì)胞模型凋亡水平的影響 與pcDNA對(duì)照組比較，pcDNA模型組A490降低、凋亡率增加(P<0.05)；與pcDNA模型組比較，pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組增殖活力A490增加、凋亡率降低(P<0.05)；與pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組比較，pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組增殖活力A490降低、凋亡率增加(P<0.05)。TUNEL染色見圖5，A490及凋亡率的比較見表3。

注：A為pcDNA對(duì)照組；B為pcDNA模型組；C為pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組；D為pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組。

表3 各組細(xì)胞A490及凋亡率的比較

2.7過表達(dá)TLR4對(duì)艾拉莫德抑制OA軟骨細(xì)胞模型凋亡基因表達(dá)的影響 與pcDNA對(duì)照組比較，pcDNA模型組中cleaved caspase-3的表達(dá)水平增加(P<0.05)；與pcDNA模型組比較，pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組中cleaved caspase-3的表達(dá)水平降低(P<0.05)；與pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組比較，pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組中cleaved caspase-3的表達(dá)水平增加(P<0.05)。見圖6。

注：A為pcDNA對(duì)照組；B為pcDNA模型組；C為pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組；D為pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組。與pcDNA對(duì)照組比較，*P<0.05；與pcDNA模型組比較，#P<0.05；與pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組比較，△P<0.05。

2.8過表達(dá)TLR4對(duì)艾拉莫德抑制OA軟骨細(xì)胞模型炎癥反應(yīng)的影響 與pcDNA對(duì)照組比較，pcDNA模型組TNF-α、IL-6、IL-8的水平增加(P<0.05)；與pcDNA模型組比較，pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組TNF-α、IL-6、IL-8的水平增加降低(P<0.05)；與pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組比較，pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組TNF-α、IL-6、IL-8的水平增加(P<0.05)。見表4。

表4 各組細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-8水平比較

3 討 論

軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)合成軟骨基質(zhì)的唯一細(xì)胞，對(duì)于維持軟骨正常的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。軟骨細(xì)胞在慢性炎癥、機(jī)械應(yīng)力的刺激下發(fā)生損傷會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解并逐步出現(xiàn)軟骨退行性改變、繼發(fā)性骨質(zhì)增生和骨贅形成等OA特征性改變。因此，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是治療OA的關(guān)鍵。但目前常用的非甾體類藥物、氨基葡萄糖、硫酸軟骨素等藥物雖然能夠起到抗炎鎮(zhèn)痛、促進(jìn)軟骨基質(zhì)修復(fù)的作用，但無法直接保護(hù)軟骨細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)軟骨退行性變的作用，尋找新的OA治療藥物及手段具有迫切的臨床需求。

艾拉莫德是一種新型的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療藥物，具有抑制炎癥及免疫調(diào)節(jié)活性，相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)該藥物用于處理類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞能夠抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[6-7]。近些年，陸續(xù)有學(xué)者報(bào)道了艾拉莫德用于OA治療的價(jià)值。雖然該藥品目前未獲得治療OA的適應(yīng)證，但國(guó)內(nèi)一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究將艾拉莫德用于OA治療，結(jié)果證實(shí)艾拉莫德顯著減輕疼痛、改善關(guān)節(jié)功能、抑制炎癥反應(yīng)[8]；另一項(xiàng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)艾拉莫德對(duì)OA軟骨細(xì)胞模型的細(xì)胞基質(zhì)降解具有抑制作用[5]，提示艾拉莫德可能通過延緩或逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的途徑發(fā)揮OA治療價(jià)值，但目前關(guān)于艾拉莫德對(duì)OA發(fā)病過程中軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用尚缺乏直接證據(jù)，這也使艾拉莫德用于OA治療缺乏足夠的基礎(chǔ)研究證據(jù)。

本研究設(shè)計(jì)了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，采用與既往其他學(xué)者相同的10 ng/mL IL-1β刺激的方式建立OA軟骨細(xì)胞模型并給予艾拉莫德干預(yù)[9-10]。OA軟骨細(xì)胞模型出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的激活，表現(xiàn)為增殖活力降低，凋亡率及凋亡基因Cleaved caspase-3表達(dá)水平、多種炎癥細(xì)胞因子水平增加，符合OA的特征。經(jīng)艾拉莫德干預(yù)后，OA軟骨細(xì)胞模型的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)均受到抑制，細(xì)胞的增殖活力增加，凋亡率及凋亡基因Cleaved caspase-3表達(dá)水平、多種炎癥細(xì)胞因子水平均降低。以上結(jié)果表明艾拉莫德對(duì)OA軟骨細(xì)胞模型的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡具有抑制作用，這也為艾拉莫德治療OA發(fā)揮軟骨保護(hù)作用提供了直接的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證據(jù)，也為今后使用艾拉莫德治療OA積累了基礎(chǔ)研究資料。

艾拉莫德目前的適應(yīng)證是用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療，多項(xiàng)相關(guān)的基礎(chǔ)研究證實(shí)艾拉莫德減輕滑膜組織炎癥反應(yīng)的作用與抑制TLR4/NF-κB通路的激活有關(guān)[11-12]。OA的發(fā)生、發(fā)展同樣涉及TLR4/NF-κB通路的激活，該通路的激活顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡及炎癥反應(yīng)[13-15]。本研究使用艾拉莫德對(duì)OA軟骨細(xì)胞模型進(jìn)行干預(yù)后TLR4及NF-κB p-p65的表達(dá)水平均明顯降低，提示艾拉莫德在OA治療過程中可能抑制軟骨細(xì)胞的TLR4/NF-κB通路。進(jìn)一步設(shè)計(jì)拯救實(shí)驗(yàn)，在艾拉莫德處理的同時(shí)通過轉(zhuǎn)染pcDNA-TLR4質(zhì)粒的方式增加TLR4及NF-κB p-p65的表達(dá)后，艾拉莫德減輕OA軟骨細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用被逆轉(zhuǎn)，表明艾拉莫德通過抑制TLR4/NF-κB通路減輕OA軟骨細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，這為深入認(rèn)識(shí)艾拉莫德發(fā)揮OA治療價(jià)值的分子機(jī)制積累了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

綜上所述，在10 ng/mL IL-1β刺激所建立的OA軟骨細(xì)胞模型中，給予艾拉莫德干預(yù)能夠減輕凋亡及炎癥反應(yīng)，這一作用與抑制TLR4/NF-κB通路有關(guān)，這為今后使用艾拉莫德治療OA、研究艾拉莫德的分子藥理機(jī)制積累了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。TLR4下游包括MyD88依賴途徑和非MyD88依賴途徑，本文初步揭示了艾拉莫德抗炎及抗凋亡的作用與抑制TLR4/NF-κB通路有關(guān)，但具體對(duì)MyD88依賴途徑和非MyD88依賴途徑調(diào)控作用尚不清楚，今后應(yīng)進(jìn)一步探討TLR4下游不同途徑在艾拉莫德抗炎及抗凋亡中的作用。