代 錦，楊天兵，陳良委，鄧思蔚，曹 穎，郝軍莉，虞國棋，王 丹

(1.成都醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610500; 2.紹興文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，浙江 紹興 312000)

0 引 言

腸道菌群是腸道微生態(tài)中所有腸道微生物的總稱，其種類豐富、數(shù)量巨大。雖這些菌群自人們出生起便定植于腸道內(nèi)，但這些微生物的種類和數(shù)量也會受到飲食、心情、藥物等多種因素的影響[1]。一旦健康腸道菌群的穩(wěn)態(tài)平衡被打破，機(jī)體內(nèi)代謝和免疫系統(tǒng)或?qū)l(fā)生紊亂，甚至引起疾病[2-3]。已有文獻(xiàn)[4]證明，高脂血癥的動物模型和肥胖人群的腸道菌群中，擬桿菌的豐度明顯增加。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道了[5]高脂血癥大鼠腸道出現(xiàn)了菌群失調(diào)，乳酸桿菌和腸球菌數(shù)量明顯減少，腸桿菌數(shù)量相對增多，腸道菌群失調(diào)可加重脂質(zhì)代謝紊亂，且乳酸桿菌和腸球菌數(shù)量的減少削弱了血中膽固醇的轉(zhuǎn)化利用，從而血脂升高。由此可見，腸道菌群影響宿主的脂肪代謝以及能量平衡，是高脂血癥等相關(guān)代謝疾病發(fā)生的一個重要中間環(huán)節(jié)。

人們對天然降脂化合物的使用越來越廣泛，這些天然化合物可以成為一種膳食補(bǔ)充劑[6]。藏茶作為少數(shù)民族中近三百萬藏族同胞的主要生活飲品，素有“寧可三日無糧、不可一日無茶”，“腥肉之食非茶不消、青稞之熱非茶不解”的深切感悟[7]。前期研究和少量文獻(xiàn)也報(bào)告了藏茶具有降脂活性[8]，但尚未見到有關(guān)雅安藏茶對高脂血癥腸道菌群影響的相關(guān)研究。

因此，本研究擬從微生態(tài)學(xué)角度揭示雅安藏茶對飲食誘導(dǎo)的高脂血癥小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，為以腸道菌群為靶點(diǎn)進(jìn)行的膳食營養(yǎng)干預(yù)提供部分理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

18只購自四川達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司的6周齡SPF級雄性昆明小鼠，體重30～35 g。

1.2 藥品與試劑

基礎(chǔ)飼料(成都達(dá)碩）；高糖脂飼料，配方為膽固醇2.0%，豬油10%，蛋黃粉5%，尿嘧啶0.2%，白砂糖10%，基礎(chǔ)飼料72.8%；TG/TC/LDL-C/HDL-C試劑盒(南京建成：A110-1-1/A111-1-1/A113-1-1/A 112-1-1)；E.Z.N.A.?土壤 DNA 提取試劑盒 (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)；雅安藏茶 (雅安兄弟友誼茶廠)；血糖試紙(廣州睿博醫(yī)療科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Xmark型酶標(biāo)儀(Bio-RAD公司)；SC-3 610型低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；電子天平(上海精科稱量儀器廠)；血糖儀(廣州睿博醫(yī)療科技有限公司)；酶標(biāo)板(JET BIOFIL潔特生物公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藏茶水提物的配置

稱取5 g藏茶，加入煮沸蒸餾水150 mL，靜置30 s后將茶水與茶渣分離收集茶水。此后4次以相同方式獲取茶水，每次將150 mL煮沸蒸餾水加入茶渣，收集茶水，但靜置時(shí)間依次為40 s、50 s、60 s和80 s，最后將5次收集的茶水混合。

2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理

18只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、干預(yù)組，每組6只。在菌群分析的分組中C、G、Z分別代表對照組、模型組、干預(yù)組。S代表灌胃開始后第7周糞便取樣，F(xiàn)代表灌胃開始后第14周糞便取樣。動物分組完成后，對照組小鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，模型組和干預(yù)組小鼠飼喂高糖脂飼料。飼喂12周后，干預(yù)組按照0.2 mL/10 (g·bw·d)的劑量灌胃藏茶水提取物，模型組和對照組同時(shí)灌胃相同體積的生理鹽水，灌胃時(shí)長14周，各組飼喂方式不變。

2.3 血脂和血糖檢測

末次給食后，小鼠禁食不禁水12 h，收集小鼠尾尖血，測量小鼠的空腹血糖水平。眼球取血后，頸椎脫臼處死小鼠。全血室溫靜置3 h，以3 000 r/min離心15 min，緩慢輕柔吸取上層血清樣品。利用試劑盒及酶標(biāo)儀分析血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量。

2.4 小鼠糞便菌群測序

收集各組小鼠灌胃開始第7周(S)和第14周(F)肛門口未污染糞便于無菌凍存管中,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩ｋS后，從各組兩個時(shí)期收集的糞便中隨機(jī)抽選4個糞便樣本，但保持兩個時(shí)期樣本編號對應(yīng)。共計(jì)24個樣本送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina Miseq測序。數(shù)據(jù)處理使用Trimmomatic 軟件原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，并使用FLASH軟件拼接。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 8.0.1(GraphPad Software,U.S.)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行血脂結(jié)果的分析，血脂結(jié)果檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，以p＜0.05表示為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。腸道菌群測序使用美吉公司isanger生信云系統(tǒng)分析，具體分析方法為：在OUT水平Shannon和Sobs稀釋曲線的分析、在OUT水平使用Wilcxon秩和檢驗(yàn)對組間Alpha多樣性指數(shù)chao1和Shannon進(jìn)行差異檢驗(yàn)、在OUT水平基于bray_curtics距離(置換次數(shù)為999)的 PCoA分析(組間差異檢驗(yàn)為ANOSIM)、從門到屬水平的LDA域值為2.0的Lefse分析(豐度同時(shí)均一化，多組比較策略為all-against-all)。

3 結(jié)果與分析

3.1 小鼠體重變化

利用高糖脂飲食誘導(dǎo)模型組和干預(yù)組小鼠12周，建立高脂模組小鼠。如圖1所示，與對照組相比，模型組和干預(yù)組小鼠體重在前12周明顯增加。第12周各組開始灌胃之后，和對照組和模型組相比，干預(yù)組小鼠體重持續(xù)下降。此時(shí)，模型組小鼠體重變化不大，且高于對照組和干預(yù)組。結(jié)果表明，雅安藏茶在一定程度上降低高糖脂飲食小鼠的體重。

圖1 各組小鼠體重變化

3.2 血脂和血糖水平分析

對各組血清進(jìn)行TG、TC、LDL-C和HDL-C的檢測，如圖2所示：與對照組相比，模型組小鼠血清中TC、LDL-C含量增高且具極顯著性差異（P＜0.01）；與模型組相比，干預(yù)組的TC、TG含量降低且有顯著性差異(P＜0.05)，而HDL-C、LDL-C含量具有下降趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)。血糖檢測結(jié)果如圖2，與對照組相比，模型組的血糖水平明顯增高且有極顯著性差異(P＜0.01)；干預(yù)組經(jīng)灌胃藏茶水提物后，血糖含量下降且具有顯著性差異(P＜0.01)。由此可見，藏茶水提取物可在一定程度上改善高糖脂飲食小鼠的糖脂水平。

圖2 各組血脂和血糖水平（## P＜0.01，＊ P＜0.05）

3.3 腸道糞便菌群分析

3.3.1 稀釋曲線分析

圖3為OUT水平的稀釋曲線分析，圖中每條線代表1個樣本。如圖3所示，Shannon和Sobs指數(shù)下的稀釋曲線均趨近平緩，兩者共同說明了本次測序?qū)Ω鹘M及各時(shí)期小鼠腸道微生物群落的檢測比率接近飽和，測序量覆蓋了樣本中的絕大部分物種,以下的分析結(jié)果能夠代表真實(shí)小鼠腸道環(huán)境。

圖3 Shannon和Sobs指數(shù)下的稀釋曲線

3.3.2 Alpha多樣性分析

圖4表示兩個時(shí)期的各組小鼠腸道菌群在OUT水平下的Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)。結(jié)果所示，第7周時(shí)，模型組和干預(yù)組相較于對照組的Chao指數(shù)雖有下降的趨勢，但組間并無顯著差異性。第14周時(shí)，干預(yù)組的Chao指數(shù)呈現(xiàn)回升。第7周的Shannon指數(shù)在各組間也無顯著差異性。第14周時(shí)，干預(yù)組的Shannon指數(shù)呈現(xiàn)回升。由此說明高糖脂飲食小鼠的腸道菌群豐富度和多樣性遭到一定程度的破壞，而藏茶水提物對干預(yù)組小鼠腸道菌群多樣性和豐度紊亂調(diào)節(jié)作用顯示出了一定的趨勢，但無顯著性，分析其原因可能在于干預(yù)時(shí)間較短或灌胃劑量不足。

圖4 各組鼠腸道菌群多樣指數(shù)Chao和shannon差異檢驗(yàn)

3.3.3 樣本比較分析

雖然各組的Chao指數(shù)與Shannon指數(shù)無顯著性變化，但進(jìn)行PCoA分析時(shí)，藏茶水提物的干預(yù)作用有所體現(xiàn)。圖5為兩個時(shí)期的PCoA分析，第7周的分析結(jié)果表明，高糖脂飲食兩組與對照組之間存在明顯的差異，但高糖脂飲食兩組之間的樣本發(fā)生重合。第14周時(shí)，3組樣本間群落組成已存在明顯的差異性，模型組與干預(yù)組之間分組橢圓已無重合區(qū)域。表1表示ANOSIM分析。第7周的組間 Statistic值為 0.224 5，P值為 0.077(P＞0.05)，表明組間無顯著性差異。第14周的組間Statistic為0.714 1，P值為0.001(P＜0.05)，表明組間具有顯著性差異，說明3組樣本的菌落組成結(jié)構(gòu)已顯著不同，表明藏茶水提物對于高糖脂飲食小鼠腸道菌群的干預(yù)作用明顯。具體變化的菌屬或菌門則需群落組成分析和LEfSe多級物種差異判別分析確定。

圖5 基于 Bray-Curtis 距離算法的 PCoA分析

表1 ANOSIM分析數(shù)據(jù)

3.3.4 物種VENN圖分析

圖6 Venn圖表示兩個時(shí)期在屬水平各組中所共有和獨(dú)有的物種數(shù)目。第7周各組菌屬數(shù)量對照組為122，模型組為95，干預(yù)組為122。第14周時(shí)各組的菌屬數(shù)量發(fā)生變化，對照組為105，模型組為108，干預(yù)組為98。相較于第7周，對照組和干預(yù)組菌屬數(shù)量有所降低，模型組菌屬數(shù)量上升。

圖6 屬水平Venn分析

3組小鼠腸道菌群在第7周和第14周共有的菌屬分別為89和81，表明不同時(shí)期3組小鼠的腸道菌群組成相似。但仍有部分菌屬為各組在各時(shí)期獨(dú)有的菌屬。各組的獨(dú)有菌屬名稱，詳見表2、表3。分析第7周的腸道菌群組成，模型組獨(dú)有的菌屬僅為與肥胖相關(guān)的Anaerofilum[9]。干預(yù)組中不動桿菌屬(Acinetobacter)是獨(dú)有的菌屬之一，該菌屬的出現(xiàn)可能與高糖飲食直接相關(guān)[10]。第14周時(shí)模型組獨(dú)有的菌屬數(shù)量為8，與第7周相比新增加的菌屬Deinococcus在干預(yù)組中的豐度極低。模型組增加了糞孢桿菌（Faecalitalea），正如Ho J等[11]報(bào)道Faecalitalea在安慰劑治療的T1D兒童中豐度相較于干預(yù)組更高，提示Faecalitalea可能與糖尿病、高脂血癥相關(guān)。干預(yù)組中出現(xiàn)了與肥胖相關(guān)的菌屬Anaerofilum、產(chǎn)SCFAs的抗炎瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium)[12]，以及茶褐素促進(jìn)豐度增加的Prevotellaceae_NK3B31_group[13]，茶褐素是藏茶的有效活性成分之一[14]。實(shí)驗(yàn)證明藏茶水提物對高糖脂飲食小鼠的腸道菌群有一定的改善作用。

表2 第7周屬水平各組小鼠腸道獨(dú)有菌屬

表3 第14周屬水平各組小鼠腸道獨(dú)有菌屬1)

3.3.5 群落組成分析

各組在第7周和第14周豐度前20的屬水平菌落組成和優(yōu)勢菌屬組成情況如圖7所示。

圖7 屬水平Heatmap分析

第7周，致病菌Alistipes、Anaerotruncus、Turicibacter和螺桿菌屬(Helicobacter)在模型組中增加，一些產(chǎn)短鏈脂肪酸菌屬在該組中降低，包括乳桿菌屬 (Lactobacillus)、Allobaculum、擬桿菌屬(Bacteroides)，而這些菌屬的豐度被藏茶水提物的干預(yù)作用所逆轉(zhuǎn)。第14周，與模型組相比，干預(yù)組中Turicibacter有所增加，Lactobacillus、Bacteroides有所減少，這可能是小鼠的周齡和藏茶水提物干預(yù)共同作用的結(jié)果。此外干預(yù)組中有益菌屬-擬普雷沃菌屬 (Alloprevotella)、norank_f__erysipelotricaceae、Ruminococcaceae_UCG-014、Clostridium_sensu_stricto_1、Lachnospiraceae_NK4A136_group有所增加，并減少了可能與炎癥相關(guān)菌屬[Ruminococcus]_torques_group的豐度[15]，此時(shí)，干預(yù)組菌屬結(jié)構(gòu)已趨向于對照組。

總之，第7周和第14周兩個時(shí)期的菌屬組成雖有所不同，但在藏茶水提物的干預(yù)下，高糖脂飲食誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群中有益菌屬增加，在一定程度上改善了小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)。

3.3.6 LEfSe多級物種差異判別分析

圖8為 LEfSe分析。第7周時(shí)，模型組的Turicibacter、Clostridium_sensu_stricto_1、梭菌科(Clostridiaceae_1)豐度顯著富集。而Zheng B[16]等人利用油酸復(fù)合物干預(yù)高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)的“Turicibacter豐度與HDL-c水平呈正相關(guān)”。但第14周時(shí)Turicibacter已不是模型組中具有顯著豐度差異的物種，同時(shí)有益菌Clostridium_sensu_stricto_1在第7周模型組中富集，但在14周時(shí)其豐度也已不具有顯著性，這說明小鼠受高糖脂飲食誘導(dǎo)時(shí)間越長，其腸道菌群的紊亂程度越高。此外第7周時(shí)，模型組中還富集了Clostridiaceae_1，該菌屬被報(bào)道顯著富集在部分2型糖尿病患者腸道中[17]。第14周時(shí)芽孢桿菌綱(Bacilli)、乳桿菌目(Lactobacillales)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、Lactobacillus均在正常組中富集，而高糖脂飲食降低了乳桿菌在模型組和干預(yù)組的豐度。在干預(yù)組中出現(xiàn)了唯一富集的短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌norank_f__erysipelotricaceae[18]。在模型組中Faecalibaculum和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)顯著富集，結(jié)合Heatmap豐度結(jié)果分析，模型組中Faecalibaculum的豐度是對照組的17.19倍和干預(yù)組的2.13倍，模型組中Bifidobacterium的豐度是對照組的296倍和干預(yù)組的2.60倍，這兩種菌屬是能夠在腸道產(chǎn)生大量的乳酸[19-20]，二者在肥胖/糖尿病的發(fā)生中雖多被報(bào)道為有益菌屬，但在高糖飲食的作用下可導(dǎo)致腸道微生物群產(chǎn)生過量的D-乳酸，并由此引起D-乳酸酸中毒[21]。

圖8 LEfse-LDA判別柱形圖

4 結(jié)束語

本文研究表明，雅安藏茶水提物不僅在一定程度上降低了高糖脂飲食小鼠的血脂和血糖水平，而且還有效改善了腸道菌群的結(jié)構(gòu)，增加有益菌屬如norank_f__erysipelotricaceae、Lactobacillus等的豐度。同時(shí)，降低有害菌屬 [Ruminococcus]_torques_group、Clostridiaceae_1等的豐度。根據(jù)LEfSe分析提示，雅安藏茶水提物可能具有潛在的治療有腸道微生物群引起的D-乳酸酸中毒的活性。后續(xù)在本文研究的基礎(chǔ)上，擬對雅安藏茶的降糖脂活性與調(diào)節(jié)菌群紊亂的確切機(jī)制進(jìn)行深入研究。