紀(jì)偉， 劉曉梅， 蘇文英， 孫長勝， 閆文娟， 柴文波， 任立凱*

(1.連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 22200； 2.浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司，浙江 嘉興 314200)

蟬花(IsariacicadaeMiquel)在《本草綱目》《圖經(jīng)本草》和《經(jīng)史證類備急本草》等古代經(jīng)典醫(yī)學(xué)論著均有記載，具有豐富的營養(yǎng)價值[1-5]。別稱金蟬花、胡蟬、蟬蛹草等，是麥角菌科真菌蟬棒束孢寄生在蟬科竹蟬、螻蛄、山蟬及黑蚱等的若蟲[6-7]，氣候環(huán)境適宜時，吸收蟲體的營養(yǎng)轉(zhuǎn)化成菌絲體，頂端分枝“發(fā)芽”，形似花冠，故而稱為蟬花[4,8-9]。蟬花菌質(zhì)是將蟬花子實(shí)體采收后剩余的培養(yǎng)基，在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基大部被分解轉(zhuǎn)化，里面含有部分蟬花蟲草菌絲體，故命名為蟬花菌質(zhì)[5]。根據(jù)文獻(xiàn)記載，蟬花經(jīng)人工培育，其菌絲體不僅含有腺苷、多糖等活性成分，還含有豐富的氨基酸、微量元素、D-甘露醇和核苷類、維生素類、蕈糖和硬脂酸等物質(zhì)[3,10]。開發(fā)應(yīng)用這部分資源，不僅為蟬花子實(shí)體收獲后的培養(yǎng)基解決了出路問題，而且變廢為寶，大大提高了蟬花培養(yǎng)物的附加值[11]。依據(jù)《新食品原料安全性審查管理辦法》和《食品安全法》的規(guī)定，蟬花子實(shí)體(人工培植)已通過國家食品安全風(fēng)險評估中心專家評審委員會技術(shù)審查，并于2021年1月7日被國家衛(wèi)生健康委員會批準(zhǔn)為“新食品原料”，成為我國100余種新食品原料的新晉成員[12-13]。所使用的蟬花菌株和蟬花子實(shí)體(人工培植)的安全性已得到認(rèn)可，關(guān)于蟬花菌質(zhì)的安全性研究還未有公開報道。本研究通過蟬花菌質(zhì)小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)、雌性小鼠和雄性小鼠的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠的精子畸形試驗(yàn)開展蟬花菌質(zhì)的安全性評價工作，為蟬花菌質(zhì)納入飼料原料目錄和應(yīng)用于飼料行業(yè)提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟬花菌質(zhì)

蟬花菌質(zhì)為蟬花人工培育完成后，采收完蟬花子實(shí)體的小麥培養(yǎng)基。在發(fā)酵過程中，小麥培養(yǎng)基大部分被分解轉(zhuǎn)化，里面含有部分蟬花蟲草菌絲體，該樣品為浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司制備提供。

1.2 供試材料

小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)：SPF級ICR小鼠購買50只，雌雄各半，分2次購入，試驗(yàn)動物為5～6周齡，體重18～22 g；小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)：SPF級ICR小鼠100只，雌雄各半，試驗(yàn)動物為7～12周齡，體重25～30 g；小鼠精子畸形試驗(yàn)：SPF級雄性ICR小鼠50只，試驗(yàn)動物為6～8周齡，體重25～35 g。以上試驗(yàn)動物均購自北京為通利華動物科技有限公司，試驗(yàn)動物合格證號為SCXK(京)2016-0011。

1.3 主要試劑和儀器

環(huán)磷酰胺(Beijing Giant-Carrier Co.Ltd)；吐溫-80(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸二氫鉀(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸氫二鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；小牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)；甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；羧甲基纖維素鈉(北京化學(xué)試劑公司)；丙三醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；吉姆薩染料(北京華博源科技開發(fā)中心)；伊紅(曙Y，北京化學(xué)試劑公司)；香柏油(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；中性樹脂膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇醫(yī)療儀器廠)；生物顯微鏡(日本Olympus公司)；酸度計(意大利HANN公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)：設(shè)置高劑量組為5 000 mg·kg-1體重，以3.125倍遞減設(shè)置高、中、低3個劑量組，即分別以5 000、1 600、512 mg·kg-1為高、中、低劑量組開展預(yù)試驗(yàn)，以期找到0/4致死劑量和4/4致死劑量。預(yù)試驗(yàn)各劑量組的小鼠數(shù)量均為4只(雌雄各半)，按灌胃體積為0.02 mL·g-1體重，將受試物用1%的羧甲基纖維素鈉配置成混懸液，依次將高、中、低劑量組經(jīng)口灌胃染毒。染毒后觀察小鼠的情況，包括一般表現(xiàn)、中毒癥狀和死亡情況，觀察周期為1～2周，并對死亡小鼠剖檢處理，做好試驗(yàn)記錄。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)試驗(yàn)各劑量組小鼠(雌雄各半)均未出現(xiàn)死亡情況。

正式試驗(yàn)：依據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，將染毒劑量確定為5 000 mg·kg-1體重作為正式試驗(yàn)的染毒劑量。將30只試驗(yàn)用小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只(雌雄各半)，將受試物用1%的羧甲基纖維素鈉配置成混懸液，經(jīng)口灌胃染毒。染毒后觀察小鼠的情況，包括小鼠的一般表現(xiàn)中毒癥狀和死亡情況，連續(xù)觀察7 d，若4 d后繼續(xù)有死亡的情況，觀察時間需要14 d，必要時可以延長至28 d，并對死亡的小鼠剖檢處理，做好詳細(xì)記錄。如果所有試驗(yàn)小鼠均未出現(xiàn)死亡情況，則需要在試驗(yàn)結(jié)束時每組隨機(jī)挑選2只小鼠進(jìn)行大體剖檢并做好詳細(xì)記錄[14]。

1.4.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

染毒劑量與分組。依據(jù)農(nóng)業(yè)部公告第1247號-12獸藥小鼠精子畸形試驗(yàn)指導(dǎo)原則，在受試物L(fēng)D50大于5 000 mg·kg-1體重時，試驗(yàn)組高劑量設(shè)為5 000 mg·kg-1體重，將2 500和1 250 mg·kg-1體重設(shè)為中劑量組和低劑量組，另設(shè)1個陰性(溶劑)對照組和1個陽性對照組。陽性對照物選用環(huán)磷酰胺，按40 mg·kg-1體重劑量給予。分別將小鼠按每組20只(雌雄各半)，分為5組進(jìn)行試驗(yàn)[15]。

受試物的配制與染毒。將受試物按各測試濃度用1%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液，染毒方式采用經(jīng)口灌胃法，用1%羧甲基纖維素鈉對陰性對照組進(jìn)行灌胃；按2 mg·mL-1濃度配制對陽性對照組小鼠進(jìn)行經(jīng)口灌胃染毒，小鼠灌胃體積為每克體重0.02 mL。每日1次，連續(xù)2 d給藥。

標(biāo)本制備。選取在第二次給予受試物6小時后的小鼠，隨機(jī)選取雌性和雄性小鼠各5只，使用頸椎脫臼法隨機(jī)處死，將每只小鼠的兩側(cè)股骨取下，剔除肌肉，去除表面血污，將股骨兩端剪去。用移液槍吸取小牛血清0.2 mL沖洗骨髓腔數(shù)次，在相應(yīng)編號的載玻片上滴上沖洗物；將骨髓腔沖洗物在玻片上涂勻后，推片，每只小鼠2張，快速干燥；將干燥的涂片固定于甲醇中，10 min后取出晾干；吉姆薩應(yīng)用液20 min染色后，使用蒸餾水沖洗，晾干，待查；閱片。用雙盲法鏡閱片，選擇著色濃淡適中區(qū)域分散均勻、完整的細(xì)胞，用油鏡觀察。每只小鼠涂片計數(shù)1 000個以上嗜多染紅細(xì)胞(PCE)數(shù)，觀察并計數(shù)其中有核的PCE數(shù)。同時在同一視野下觀察計數(shù)成熟紅細(xì)胞(RBC)數(shù)，并記錄每只小鼠RBC數(shù)、含微核PCE細(xì)胞數(shù)、PCE檢查數(shù)[16]。

1.4.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

染毒劑量與分組。依據(jù)農(nóng)業(yè)部公告第1247號-11獸藥小鼠精子畸形試驗(yàn)指導(dǎo)原則，當(dāng)受試物半數(shù)致死量(LD50)>5 000 mg·kg-1時，試驗(yàn)組高劑量設(shè)為5 000 mg·kg-1，將2 500和1 250 mg·kg-1體重設(shè)為中和低劑量組，另設(shè)1個陰性(溶劑)對照組和1個陽性對照組。選用環(huán)磷酰胺作為陽性對照組，按40 mg·kg-1體重劑量給予。將雄性ICR小鼠隨機(jī)分組，每組10只，分為5組進(jìn)行試驗(yàn)。

受試物的配制與染毒方法。將受試物按各測試濃度用1%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液，染毒方式采用經(jīng)口灌胃法，用1%羧甲基纖維素鈉對陰性對照組進(jìn)行灌胃；按2 mg·mL-1濃度配制對陽性對照組小鼠進(jìn)行經(jīng)口灌胃染毒，小鼠灌胃體積為每克體重0.02 mL。每日1次，連續(xù)5 d給藥。

采樣和制片。每個劑量組選取5只小鼠采樣、制片，一般選擇在第一次染毒后35 d后的小鼠。處死小鼠的方法采用頸椎脫臼法，剪開腹腔，將摘取的兩側(cè)附睪放入盛有2 mL生理鹽水的平皿中；將附睪縱向剪1刀，用吸管吸取其中的生理鹽水吹打數(shù)次，凈置5 min；使用4層擦鏡紙過濾，除去組織碎片，在載玻片上滴濾液2滴，推片，樣片制片4張/只小鼠；采用自然干燥后，用甲醇固定10 min，干燥；使用2%的伊紅染色50 min，用水沖洗染液，自然晾干。

閱片。先在低倍鏡下找到精子重疊較少、背景清晰的區(qū)域，再在高倍鏡下觀察精子形態(tài)。精子明顯是人為剪碎、頭部與其他精子及碎片重疊或有頭無尾(輪廓不清)者均不計數(shù)。每個劑量組分別檢查精子1 000條，對在同一視野中的畸形精子進(jìn)行分類計數(shù)，包括雙尾、尾折疊、分無鉤、胖頭、香蕉形、雙頭、無定形，做好詳細(xì)記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

正式試驗(yàn)中所有受試ICR小鼠在試驗(yàn)觀察期內(nèi)均未出現(xiàn)中毒癥狀，亦未見死亡，且試驗(yàn)結(jié)束后大體剖檢小鼠的腎臟、肺臟、脾臟、肝臟、胃腸道、心臟等組織器官，均未發(fā)現(xiàn)異常變化。

經(jīng)口染毒劑量按5 000 mg·kg-1體重，經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)3次，在試驗(yàn)觀察期內(nèi)ICR小鼠死亡率詳見表1，結(jié)果均為0，可判定蟬花菌質(zhì)對ICR小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)的LD50大于每公斤體重5 000 mg。

表1 動物死亡結(jié)果

2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表2、3可知，陽性對照組2種性別小鼠骨髓細(xì)胞中含微核嗜多染紅細(xì)胞率顯著高于陰性對照組相應(yīng)性別，而蟬花菌質(zhì)各劑量組雌、雄小鼠骨髓含微核嗜多染紅細(xì)胞率與陰性對照組之間比較無顯著性差異，且各試驗(yàn)組嗜多染紅細(xì)胞(PCE)與成熟紅細(xì)胞(RBC)比值(PCE/RBC)在正常范圍內(nèi)，表明蟬花菌質(zhì)在1 250～5 000 mg·kg-1體重劑量對雌、雄小鼠骨髓中嗜多染紅細(xì)胞(PCE)的微核率無顯著影響，可判定蟬花菌質(zhì)的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

表2 蟬花菌質(zhì)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果(雌性小鼠)

表3 蟬花菌質(zhì)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果(雄性小鼠)

2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

從表4可以看出，陽性對照組精子畸形率極顯著高于陰性對照組，蟬花菌質(zhì)在1 250～5 000 mg·kg-1體重劑量范圍內(nèi)小鼠精子畸形率與陰性對照組比較無顯著性差異，可判定蟬花菌質(zhì)小鼠精子畸形

表4 蟬花菌質(zhì)小鼠精子畸形情況

試驗(yàn)結(jié)果為陰性。從表5可以看出，蟬花菌質(zhì)在1 250～5 000 mg·kg-1體重劑量小鼠各類精子畸形百分率中“無鉤”占百分比最高，其次是“無定形”，各類畸形精子百分率中“雙尾”占百分比最低。

表5 蟬花菌質(zhì)小鼠精子畸形比例

3 討論

本研究包括蟬花菌質(zhì)小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)(LD50測定)、雌性小鼠和雄性小鼠的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠的精子畸形試驗(yàn)，以期通過以上試驗(yàn)開展蟬花菌質(zhì)在飼料中應(yīng)用的安全性評價工作。研究結(jié)果表明，受試的所有ICR小鼠在試驗(yàn)觀察期內(nèi)均未見中毒癥狀和死亡情況，在試驗(yàn)結(jié)束后大體剖檢小鼠的腎臟、肺臟、脾臟、肝臟、胃腸道、心臟等組織器官，均未發(fā)現(xiàn)異常變化。根據(jù)本試驗(yàn)判定，蟬花菌質(zhì)對ICR小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)的LD50大于5 000 mg·kg-1體重。蟬花菌質(zhì)在1 250～5 000 mg·kg-1體重劑量經(jīng)口染毒后，各小鼠骨髓細(xì)胞中含微核嗜多染紅細(xì)胞(PCE)率和小鼠精子畸形率與陰性對照組比較均無顯著性差異，說明小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果和小鼠精畸形試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。以上試驗(yàn)表明，蟬花菌質(zhì)具有很好的安全性，為蟬花菌質(zhì)應(yīng)用于飼料工業(yè)等領(lǐng)域提供科學(xué)理論依據(jù)。