PHF5A通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路促進非小細胞肺癌的增殖和遷移

王厚慧 劉芳蕾 白春學 許諾

肺癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居前列[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占肺癌的85%左右。靶向治療以及免疫治療的出現(xiàn)給NSCLC的治療帶來了革命性變化。然而，對于晚期患者的預后仍然不理想，總體5年生存率仍在15%左右[2]。因此，進一步研究肺癌的分子機制，尋找新的潛在的癌癥治療靶點將為NSCLC診治提供新的思路。

PHD鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白5A（plant homodomain finger-like domain-containing protein 5A, PHF5A）在細胞核中廣泛表達，它編碼110個氨基酸，屬于一種高度保守的小轉(zhuǎn)錄啟始因子。主要參與調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄及選擇性剪接，對維持正常細胞的基本生物學功能起重要作用。PHF5A是參與可變剪接（alternative splicing, AS）的關(guān)鍵剪接因子，直接參與蛋白質(zhì)間的相互作用或通過RNA剪接途徑調(diào)控下游基因。如果將其敲除則破壞了多個必需基因的剪接，可導致細胞周期阻滯和活力喪失[3-5]。已有研究[6]發(fā)現(xiàn)PHF5A是肺鱗癌RNA結(jié)合蛋白網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)；并有研究[7,8]證明，它在大腸癌和胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。這些發(fā)現(xiàn)提示PHF5A在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能作為基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對細胞周期、促癌基因表達等過程發(fā)揮重要作用。但是它在肺癌尤其是NSCLC中的分子和生物學功能還不是很清楚。在本研究中，我們探討了PHF5A在NSCLC增殖和遷移中的作用，并探討了其發(fā)揮作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞增殖實驗 A549細胞在含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)0.25%胰酶消化后，于800 rpm離心5 min，然后用完全培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)，其中每孔接種1,000個細胞，于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)5 d。在96孔板的每個孔中加入10 μL MTT，于培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄去MTT和完全培養(yǎng)基，然后加入100 μL DMSO，于培養(yǎng)箱中孵育10 min，中間去除搖晃一次，然后酶標儀（TECAN Nanoquant,Switzerland）中檢測各孔在490 nm處的吸光光度值。上述培養(yǎng)條件均為37oC、5%CO2加濕培養(yǎng)箱。

1.2 細胞遷移實驗 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，在小室外加入含10%FBS完全培養(yǎng)液或1%FBS培養(yǎng)液（對照組），小室內(nèi)接種1×104個細胞，37oC、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育6 h，PBS漂洗后，Cooomassie Blue室溫染色適當時間。倒置顯微鏡下×10物鏡計數(shù)貼附于小室多孔膜上的總細胞數(shù)（N0），棉簽擦去小室多孔膜上方細胞，計數(shù)殘留在小室多孔膜下方的細胞數(shù)（N1），每一張膜隨機選取5個視野拍照并進行統(tǒng)計。按以下公式計算細胞遷移率：細胞遷移率=N1/N0×100%。

1.3 細胞克隆形成實驗 人NSCLC細胞A549過表達PHF5A基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系A(chǔ)549-PHF5A和相應的對照組細胞A549-vector分別經(jīng)0.25%含EDTA的胰酶消化后，用含10%FBS的完全培養(yǎng)基終止消化，于800 rpm離心5 min，然后用完全培養(yǎng)基將沉淀重懸成單個細胞并計數(shù)，在12孔板的每個孔中接種含600個細胞的1 mL完全培養(yǎng)基，置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，將12孔板中的培養(yǎng)液完全吸出后，在每個孔中加入1 mL 100%甲醇，室溫下固定10 min，固定完成后，用一定量的0.1%的結(jié)晶紫進行染色30 min（結(jié)晶紫染液用75%的乙醇配置）。染色結(jié)束后用水清洗殘余染料并拍照，并在鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)超過100個細胞的克隆形成的數(shù)量。

1.4 免疫印跡法 用Bradford方法測量蛋白含量。SDSPAGE電泳分離裂解液并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。TBST洗膜3次，封閉過的膜分別用一抗、二抗孵育。配制ECL顯色液，并在暗室X線曝光顯影。并用Image J分析軟件測量每個特異條帶的灰度值。抗體：PI3K（Cell Signaling Technology,#17366），AKT（Cell Signaling Technology, #4691），p-AKT（Cell Signaling Technology, #4060），c-Myc（Cell Signaling Technology, #18583），p21（Cell Signaling Technology,#2947）。

1.5 劃痕實驗 將H1299-NC及抑制PHF5A表達的H1299-PHF5A細胞，A549-vector和穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達細胞株A549-PHF5A細胞分別采用含10%FBS的1640培養(yǎng)基，于37oC、5%CO2、pH值7.2-7.4的無菌恒溫培養(yǎng)，待細胞長到80%融合度時分別用含EDTA的0.25%的胰酶消化，在6孔板的每孔接種細胞2×106個，24 h后劃線，劃線后的0 h和48 h拍照。使用Image J軟件打開圖片后，隨機劃取6條-8條水平線，計算細胞間距離的均值。

1.6 體內(nèi)成瘤實驗 使用SPF級環(huán)境中喂養(yǎng)的4周齡-5周齡的雄性BALB/CA裸鼠（購于中國科學院上海分院）。取5×106個PHF5A高表達A549細胞和對照組細胞，分別皮下注射到裸鼠右側(cè)皮膚處，每組6只。5周后，收獲瘤體并進行統(tǒng)計分析。

瘤體體積（V）=長×寬×寬/2

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0用于數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，組間比較采用方差分析（ANOVA）法檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 減少NSCLC細胞中PHF5A表達可以抑制細胞體外增殖 為了研究PHF5A在NSCLC增殖中的作用，利用siRNA技術(shù)抑制NSCLC H292和H1299中PHF5A的表達。與對照組相比，抑制組細胞中PHF5A表達明顯降低（圖1A）。H292-NC組細胞在24 h、48 h、72 h的增殖率分別為30.2%、47.3%、99.3%，H292-siPHF5A組細胞的增殖率分別為11.5%、18.2%、43.1%；H1299-NC組細胞在24 h、48 h、72 h的增殖率分別為47.8%、77.4%、98.6%，H1299-siPHF5A組細胞的增殖率分別為41.2%、51.4%、60.8%。上述結(jié)果說明PHF5A抑制組的各個時間的細胞增殖率均比相對應的對照組的增殖率明顯減少（P＜0.05，圖1B）。因此下調(diào)PHF5A的表達，可以明顯抑制NSCLC H292和H1299細胞的增殖。同時，流式細胞檢測結(jié)果顯示，抑制PHF5A的表達可以使更多的細胞停留在G1期/S期（圖1C、圖1D）。

圖1 減少NSCLC細胞中PHF5A表達降低細胞體外增殖。A：siRNA技術(shù)抑制NSCLC H292和H1299中PHF5A的表達，Western blot法檢測各組細胞中PHF5A的表達水平；B：減少PHF5A表達后各組H292和H1299的細胞增殖率明顯降低；C：利用流式細胞學技術(shù)檢測細胞周期變化；D：細胞周期定量分析。與NC組比較，抑制PHF5A的表達可以使細胞停留在G1期/S期。*P＜0.05，**P＜0.01。Fig 1 Decreased expression of PHF5A in NSCLC cells reduced the proliferation in vitro. A: PHF5A expression was inhibited using siRNA in H292 and H1299 cell lines. Western blot analysis was used to examine the expression level of PHF5A; B: The proliferation rate of H292 and H1299 was reduced significantly when PHF5A was decreased in H292 and H1299 cell lines; C: The cell cycle was detected by flow cytometry; D: Quantification of the results of the cell cycle analysis. Compared with NC group, decrease of PHF5A expression arrested the cell cycle at G1/S stage in H292 and H1299 cells. *P＜0.05, **P＜0.01. PHF5A: plant homodomain finger-like domain-containing protein 5A; NSCLC: non-small cell lung cancer.

2.2 增加NSCLC細胞中PHF5A表達可以促進細胞體外增殖 利用A549和PC-9細胞構(gòu)建PHF5A過表達細胞株，PHF5A在過表達組中的表達比對照組明顯增加（圖2A）。與對照組相比，A549和PC-9過表達組細胞克隆形成能力明顯增加（圖2B、圖2C），利用MTT法檢測細胞增殖率，PC-9-vector組細胞24 h、48 h、72 h的增殖率分別為41.1%、64.4%、72.8%，PC-9-PHF5A組細胞的增殖率分別為61.4%、94.1%、115.0%；A549-vector組細胞24 h、48 h、72 h的增殖率分別為14.0%、20.7%、40.1%，A549-PHF5A組細胞的增殖率分別為21.1%、28.1%、58.6%。上述結(jié)果提示PHF5A過表達組的各個時間的細胞增殖率均比相對應的對照組的增殖率明顯增加（P＜0.05，圖2D）。因此，PHF5A表達增加可以促進NSCLC細胞A549和PC-9細胞的增殖。

圖2 增加NSCLC細胞中PHF5A表達促進細胞體外增殖和克隆形成能力。A：構(gòu)建NSCLC A549、PC-9 PHF5A穩(wěn)定高表達細胞株，Western blot法檢測各組細胞中PHF5A的表達水平；B：利用克隆形成實驗，比較PHF5A穩(wěn)定高表達和對照組細胞克隆形成能力（結(jié)晶紫染色）；C：染色后集落計數(shù)的定量分析。結(jié)果提示與對照組相比，A549和PC-9過表達組細胞克隆形成能力明顯增加；D：利用MTT法檢測細胞增殖率，與對照組相比，增加PHF5A表達后各組A549和PC-9的細胞增殖率明顯升高。*P＜0.05。Fig 2 PHF5A up-regulation promotes NSCLC cell proliferation and colony formation in vitro. A: PHF5A overexpression groups of A549 and PC-9 cell lines were constructed, and PHF5A expression levels were determined by Western blot analysis; B: Colony formation assay was used to evaluate A549 and PC-9 cell growth after PHF5A expression level was increased; C: Quantification of the colony formation. The results showed the colony formation was increased in PHF5A overexpression groups, compared with the vector groups of A549 and PC-9 cell lines; D: By using MTT assay, the up-regulation of PHF5A increase the proliferative ability in both A549 and PC-9 cell lines. *P＜0.05.

2.3 增加NSCLC細胞中PHF5A表達可以促進NSCLC細胞體外遷移 為了更好地研究PHF5A在NSCLC中的作用，我們利用A549和PC-9過表達細胞株進行了Transwell遷移檢測。A549-PHF5A組和PC-9-PHF5A組的細胞數(shù)分別為827.7±20.5和663.0±33.4，明顯多于相應對照組（A549-vector: 342.3±26.3; PC-9-vector: 239.3±25.8）（P＜0.05）。結(jié)果說明增加PHF5A的表達，可以顯著促進A549和PC-9細胞的遷移（圖3）。同時，我們利用A549過表達細胞株以及H1299低表達細胞株分別進行了劃痕實驗，并在48 h后比較兩組細胞與對照組之間的劃痕修復能力是否具有差異。結(jié)果提示與對照組相比，A549過表達組細胞遷移速度明顯增加，而H1299低表達組細胞的遷移速度明顯下降（P＜0.05）（圖4），說明PHF5A可以顯著促進NSCLC細胞的遷移能力。

圖3 增加NSCLC細胞中PHF5A表達可以增加NSCLC細胞遷移的能力。A：利用細胞遷移實驗，比較A549和PC-9過表達細胞株和對照組細胞遷移的能力（Cooomassie Blue染色，×100）；B：染色后細胞計數(shù)的定量分析。結(jié)果提示增加PHF5A的表達，可以顯著促進A549和PC-9細胞的遷移能力。***P＜0.001。Fig 3 Effect of PHF5A overexpression on migration of NSCLC cells. A: Transwell assay was preformed to measure the cell migratory ability of control or PHF5A overexpression groups of A549 and PC-9 cells (Cooomassie Blue staining, ×100); B: Quantitation of cell migration from control and PHF5A-overexpression cells. The results showed PHF5A up-regulation promotes the migratory ability of A549 and PC-9 cells. ***P＜0.001.

圖4 NSCLC細胞中PHF5A表達變化可以影響NSCLC細胞遷移的速度。A：利用細胞劃痕實驗，比較A549過表達細胞組、H1299低表達細胞組和對照組細胞在0 h、48 h的劃痕愈合狀態(tài)（×100）；B：遷移細胞計數(shù)的定量分析。結(jié)果提示PHF5A的表達變化可以影響NSCLC細胞的遷移能力。*P＜0.05。Fig 4 The effect of PHF5A on the migratory ability of NSCLC cells. A: Wound healing assay was performed to assess the migratory potential of control, PHF5A down-regulation and overexpression cells at indicated time points (×100); B: Quantitation of wound healing assay. The results showed that PHF5A could play a role in migratory ability of NSCLC cells. *P＜0.05.

2.4 增加NSCLC細胞中PHF5A表達可以促進腫瘤細胞體內(nèi)增殖 利用A549-PHF5A過表達細胞株進行體內(nèi)成瘤實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PHF5A過表達組成瘤體積［A549-PHF5A:(0.98±0.39) mm3］明顯大于對照組［A549-vector: (0.42±0.21) mm3］（P＜0.05），同時成瘤速度也明顯增加（圖5）。因此，PHF5A過表達可以促進NSCLC A549細胞體內(nèi)增殖。

圖5 增加NSCLC細胞A549細胞中PHF5A表達可以促進在體腫瘤細胞的增長。A：切除下來的小鼠腫瘤；B：特定時間腫瘤體積。與對照組比較，過表達組瘤體體積明顯增加，增殖速度加快。*P＜0.05，**P＜0.01。Fig 5 PHF5A overexpression promotes tumor growth in vivo. A: Representative images of xenografts harbored from mice in each group; B: Tumor volumes were measured at the indicated times. Compared with the control group, the tumor growth and size of the overexpression group were significantly increased.*P＜0.05, **P＜0.01.

2.5 PHF5A可以通過激活PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)細胞增殖和轉(zhuǎn)移 為了進一步探討PHF5A促進NSCLC增殖的機制，前期我們利用基因芯片對下游通路進行了分析，發(fā)現(xiàn)PHF5A可能調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路。因此，我們利用siRNA技術(shù)抑制了A549細胞中PHF5A的表達，并檢測其對PI3K/AKT信號通路下游相關(guān)蛋白表達的影響。結(jié)果提示，與對照組相比，PHF5A表達下調(diào)后，PI3K、磷酸化AKT和下游c-Myc表達明顯減少（P＜0.05）；而p21表達明顯升高（P＜0.05）（圖6）。說明PHF5A可能通過激活PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)NSCLC細胞的增殖和遷移。

圖6 抑制NSCLC細胞A549細胞中PHF5A表達對PI3K/AKT信號通路中相關(guān)蛋白表達的影響。A：利用siRNA技術(shù)抑制了A549細胞中PHF5A的表達，Western blot法檢測A549抑制組與對照組細胞中PI3K、p-AKT、AKT、p21及c-Myc的表達水平；B：半定量分析Western blot檢測結(jié)果，提示PHF5A降低可以抑制PI3K、p-AKT及c-Myc的表達，而p21表達明顯升高。*P＜0.05.Fig 6 The effect of PHF5A down-regulation on the PI3K/AKT signaling pathway in A549 cells. A: The expression level of PHF5A in A549 was decreased by using siRNA. Western blot analysis was used to examine the expression levels of PI3K, p-AKT, AKT, p21 and c-Myc; B: Quantitation of Western blot analysis. The results showed that p21 was significantly up-regulated, while PI3K, p-AKT and c-Myc were significantly down-regulated upon PHF5A knockdown. *P＜0.05.

3 討論

PHF5A是高度保守的小轉(zhuǎn)錄啟始因子，參與細胞周期的調(diào)控、細胞生長和分化[7,9]，對染色質(zhì)重塑、組織和器官形態(tài)發(fā)展、腫瘤干細胞樣表型的維持起著重要的作用[4,9-11]。有研究[12]報道抑制PHF5A的表達可以抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖，同時其在膠質(zhì)母細胞瘤中的外顯子識別、維持細胞擴增以及活力中發(fā)揮重要作用。另一項NSCLC的研究[4]中發(fā)現(xiàn)，PHF5A在肺癌細胞中表達升高，并且可能通過選擇性剪接發(fā)揮促癌作用。PHF5A還被證實在胰腺癌細胞中可以與PAF1和DDX3相互作用，通過抑制PAF1-PHF5A-DDX3復合物，可以抑制原位胰腺癌的增殖，以及腫瘤在小鼠體內(nèi)的發(fā)展。研究[6-8]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中，PHF5A乙酰化可以通過抗壓力途徑增進腫瘤細胞對抗應激的能力，最終促進結(jié)腸癌細胞的進展。但PHF5A在肺癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用尚未完全明確。深入探究PHF5A在肺癌進展中的作用，有助于尋找新的潛在的癌癥治療靶點，為NSCLC診治提供新的思路。

有研究[6]發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，PHF5A在NSCLC中顯著上調(diào)，且PHF5A上調(diào)與患者的總生存期呈負相關(guān)。本研究通過克隆形成、MTT法、Transwell、劃痕實驗等方法檢測了增加或抑制PHF5A的表達后NSCLC細胞的增殖和遷移能力的變化。結(jié)果顯示，下調(diào)NSCLC細胞中PHF5A的表達可以抑制NSCLC細胞的增殖和遷移，升高PHF5A的表達可以促進NSCLC細胞的增殖和遷移。PHF5A的抑制可以使細胞周期停留在G1期/S期，進一步證實了PHF5A在NSCLC增殖中的促進作用。PI3K/AKT信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用已為人們所熟知，已有報道，PI3K/AKT在NSCLC、前列腺腺癌和腸癌中持續(xù)活化以及表達量增高。它可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖和存活，其活性異常不僅能導致細胞惡化，且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移行為密切相關(guān)。本研究抑制NSCLC細胞A549中PHF5A蛋白表達，并應用Western blot方法檢測的PI3K/AKT通路及其下游p21、c-Myc蛋白表達的變化，初步探索了PHF5A對肺癌細胞生物學功能產(chǎn)生的影響可能是通過激活PI3K/AKT通路產(chǎn)生的。

綜上所述，NSCLC細胞中PHF5A的表達增高，并可以通過影響PI3K/AKT信號通路促進肺癌細胞的增殖和遷移。而研發(fā)PHF5A的相關(guān)抑制劑，可能為預防和治療NSCLC提供新的思路。

Author contributions

Xu N conceived and designed the study. Wang HH and Liu FL performed the experiments. Wang HH analyzed the data. Liu FL contributed analysis tools. Xu N and Bai CX provided critical inputs on design, analysis and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.