鮑曼不動桿菌致病機制及相應(yīng)疫苗的研究現(xiàn)狀

馬源 綜述，宋磊，羅招慶 審校

吉林大學第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科與感染與免疫中心，吉林 長春 130021

鮑曼不動桿菌是一種革蘭陰性菌，是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌之一［1-2］，主要感染肺等多種人體器官［3］，最終引起菌血癥、肺炎等疾病，嚴重威脅患者生命，免疫力較弱的人群，尤其患有嚴重呼吸道疾病需氣管插管及腫瘤化療的患者，更易感染該菌［4］。目前，鮑曼不動桿菌對抗生素已產(chǎn)生廣泛耐受性，普通抗生素難以清除臨床流行的菌株，迄今為止，全球僅有南極洲未分離出多重耐藥的鮑曼不動桿菌。在已分離獲得的鮑曼不動桿菌菌株中，碳氫霉烯類藥物耐受菌株位列世界衛(wèi)生組織“新型抗生素研發(fā)重點病原體清單”的首位［5］，疫苗接種是預防該菌感染的主要措施。本文就鮑曼不動桿菌的致病機制和相應(yīng)疫苗的研究現(xiàn)狀作一綜述，以期為該菌及新型疫苗的研究提供參考。

1 鮑曼不動桿菌的致病機制

鮑曼不動桿菌的致病過程主要包括菌體與宿主細胞黏附、生物膜的形成及菌體定殖。與許多病原體相似，鮑曼不動桿菌能產(chǎn)生大量包圍外膜的莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）［6］，并形成黏液，對該菌的黏附起關(guān)鍵作用。有研究在鮑曼不動桿菌中發(fā)現(xiàn)，雙組分離調(diào)節(jié)系統(tǒng)BfmRS 可影響CPS 的形成［7-9］，還可控制 CPS 產(chǎn)生基因的 K 位點及菌毛產(chǎn)生csuA／BABCDE 操縱子的表達［10］。BfmRS 突變體（ΔbfmR）可過量產(chǎn)生CPS，具有更強毒性［11］。CPS 輸出蛋白（Wza）與耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌的毒力及莢膜的形成密切相關(guān)。研究表明，wza基因敲除可影響莢膜聚合酶Wzy 依賴的CPS 合成途徑，導致CPS 的組裝、輸出和胞外固定受阻，從而產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，降低該菌的毒性［12-13］。

生物膜是微生物細胞在多種生理環(huán)境因素影響下黏附于生物或非生物表面形成的三維結(jié)構(gòu)［14］，其形成導致細菌的耐藥性、致病性升高，慢性感染、反復感染率增加［15］。臨床上65%～80%的細菌感染性疾病與生物膜形成有關(guān)，但形成生物膜的細菌對抗菌藥物耐藥性通常是游離菌的10～1 000倍，這也是抗菌藥物治療細菌感染失效的主要原因［16］。生物膜的形成和發(fā)展包括4 個主要步驟：細菌可逆性黏附定殖、細菌不可逆性黏附集聚、生物膜成熟及細菌的脫落與再定殖。當浮游細菌與惰性物體表面或活性實體的表面接觸后，會黏附至物體表面，啟動形成生物膜過程，在該階段，單個附著細胞僅由少量胞外聚合物包裹，未進入生物膜的形成過程，多數(shù)菌體還可重新進入浮游狀態(tài)，因此，此時細菌的黏附是可逆的。細菌經(jīng)過初步定殖黏附后，激活與形成生物膜相關(guān)的基因，細菌在生長繁殖的同時分泌大量胞外聚合物黏結(jié)細菌，在該階段，細菌對物體表面的黏附更牢固，是不可逆的。隨后生物膜的形成逐漸進入成熟期，形成高度有組織的結(jié)構(gòu)，由類似蘑菇狀或堆狀的微菌落組成，在這些微菌落之間存在大量通道，可運送養(yǎng)料、酶、代謝產(chǎn)物等。成熟的生物膜通過蔓延、部分脫落或釋放出浮游細菌進行擴展，脫落或釋放出來的細菌重新變?yōu)楦∮尉谖矬w表面形成新的生物膜［17］。

與其他菌種比較，鮑曼不動桿菌的生物膜形成率為80%～91%，其他菌種為5%～24%［18］。生物膜保護鮑曼不動桿菌免受抗生素、噬菌體的作用，協(xié)助其在惡劣條件下存活［19-20］，該菌借助生物膜黏附于醫(yī)療設(shè)施上，使其在醫(yī)院環(huán)境中持續(xù)存在，導致院內(nèi)感染［21］。鮑曼不動桿菌分離株的生物膜由菌體、細菌分泌的黏性物質(zhì)和CPS 組成，其形成通常與金屬離子、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子和外膜蛋白等表達基因的上調(diào)有關(guān)［22］，相關(guān)基因作用見表1［23-31］。黏附性是形成生物膜的第一步，菌毛有助于鮑曼不動桿菌在任何非生物表面形成生物膜［32］，有研究表明，鮑曼不動桿菌相關(guān)的多聚β-1，6-乙酰葡萄糖胺（polymerization β-1，6-acetylglucosamine，PNAG）、分子伴侶／分子引導分泌（molecular chaperone system,CUS）系統(tǒng)和群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）等也與生物膜的形成密切相關(guān)［33-35］。

表1 生物膜相關(guān)基因及其功能Tab.1 Biofilm related genes and their functions

由于多重耐藥鮑曼不動桿菌不斷增多［36］，抗生素的有效性越來越差，更加凸顯開發(fā)新型防治手段的重要性。接種疫苗在防治鮑曼不動感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在該菌致病過程中涉及多種物質(zhì)（如CPS、蛋白質(zhì)及相關(guān)基因）的參與，以這些組分為靶點制備相應(yīng)疫苗（如OmpA、Bap 疫苗），通過降低細菌黏附和生物膜的形成，進而阻斷或減弱鮑曼不動桿菌的感染，以達到預防和治療的目的。

2 鮑曼不動桿菌疫苗的研發(fā)現(xiàn)狀

疫苗是預防病原體感染的重要手段，可分為滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗、植物疫苗等。目前，鮑曼不動桿菌疫苗集中于滅活全菌體疫苗、DNA疫苗、重組亞單位疫苗及莢膜多糖疫苗等研究，尚無疫苗進入臨床試驗階段。且現(xiàn)有疫苗存在周期長、免疫原性弱、安全性低等缺點，急需開發(fā)新型疫苗用于防治鮑曼不動桿菌感染。

2.1 滅活全菌體疫苗 鮑曼不動桿菌滅活全菌體（inactivated whole cell，IWC）疫苗是指將培養(yǎng)的鮑曼不動桿菌滅活后，保留具有抗原性的菌體作為主要成分的疫苗，滅活方式主要有加熱、輻射、暴露于抗生素等。加熱滅菌操作簡單、價格便宜；輻射滅菌更徹底，可提高疫苗安全性；暴露于抗生素法更傾向于清除多重耐藥菌。IWC 疫苗可預防由不同鮑曼不動桿菌菌株引起的致命膿毒癥，如擴展耐藥率（extended drug resistance rate，XDR）菌株，其7 d存活率為80%～100%，且IgG、IgG1、IgG2a和IgM水平顯著升高，刺激了Th1／Th2 介導的混合反應(yīng)［37-41］。這些蛋白具有中和、清除病原微生物的作用，從而減少對機體的損傷，增強抵抗作用。滴鼻免疫、皮下注射、腹腔注射同樣能起到以上效果，滴鼻免疫起效更快；腹腔注射免疫操作簡便；皮下注射免疫機體吸收較快且產(chǎn)生抗體含量高。但IWC 疫苗免疫原性較弱，且滅菌不完全時可能會對機體造成危害，與其他類型疫苗比較，該疫苗免疫效果較差。

2.2 減毒活疫苗 減毒活疫苗是人工誘變或從自然界篩選出毒力降低或無毒的活病原微生物制成的疫苗。免疫力較弱的人群是大多數(shù)鮑曼不動桿菌的易感人群，因此使用減毒活疫苗存在潛在的安全風險。目前，已研發(fā)出一種具有TrxA黏附素缺陷的減毒多重耐藥菌株疫苗，經(jīng)小鼠腹腔或皮下免疫4周后，存活率≥90%［42］。與滅活疫苗比較，減毒活疫苗誘導免疫反應(yīng)強，但有可能發(fā)生逆行突變，在人體內(nèi)恢復毒力［43］，其安全性有待探索。

2.3 外膜蛋白疫苗 鮑曼不動桿菌外膜蛋白疫苗主要有外膜復合物（outer membrane complex，OMC）疫苗和外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）疫苗。從鮑曼不動桿菌ATCC 19606 中提取的OMC 可有效誘導小鼠產(chǎn)生體液和細胞免疫，小鼠感染后的生存率≥80%，可對抗不同鮑曼不動桿菌分離株的感染，且用OMC疫苗免疫的血清可清除鮑曼不動桿菌（恢復率為70%～100%）［44］，但血清制劑成分復雜且不明確，安全性較低。自B群腦膜炎球菌疫苗Bexsero?（一種基于OMVs的產(chǎn)品）獲得批準以來，OMVs疫苗引起人們的重視［45］，其提供了更廣泛的抗原，包括OMC和其他膜相關(guān)蛋白。通過優(yōu)化生物工程設(shè)計、分離、脂寡糖脫毒，OMVs可發(fā)展成安全有效、成本效益高的細菌疫 苗［46-47］。鮑曼不動桿菌 ATCC 19606 產(chǎn)生的天然OMVs免疫小鼠非常有效，在異種菌株感染后，免疫小鼠的存活率為90%，基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption／ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）分析確定了OMVs 中具有高免疫原性蛋白質(zhì)，包括OmpA、OmpW、CarO［45］。HUANG 等［48］將大腸埃希菌衍生的OMVs 包裝融合了外源性鮑曼不動桿菌Omp22 蛋白和成孔溶血蛋白ClyA，用其免疫小鼠的存活率≥60%，且無需佐劑；接種未經(jīng)修飾大腸埃希菌OMVs的小鼠存活率僅為35.0%～63.6%，表明大腸埃希菌衍生的OMVs對鮑曼桿菌感染具有交叉免疫作用。

2.4 重組亞單位疫苗 大分子抗原攜帶多種特異性抗原決定簇中，僅有少量抗原部位對保護性免疫應(yīng)答起作用。亞單位疫苗是將致病菌主要保護性免疫原組分進行提純、組裝，篩選出具有免疫活性片段制成的，因此也叫組分疫苗［49］。2010年以來，發(fā)現(xiàn)了多種鮑曼不動桿菌新型毒力因子及其分子相互作用，作為黏附素或侵入素的外膜免疫原蛋白是亞單位疫苗開發(fā)的主要目標，可阻斷細菌與宿主細胞受體的黏附和定植，達到有效預防細菌感染的目的。該疫苗最可能的候選亞單位是OmpA，OmpA 參與了鮑曼不動桿菌黏附、細胞毒性和生物膜形成等過程，在動物模型中具有高度免疫原性。OmpA的氨基酸序列與人類蛋白質(zhì)組無同源性，但變異較?。ā?9%保守），表明鮑曼不動桿菌OmpA不可能與其他含有OmpA的共生細菌相互干擾，從而將潛在副作用降至最低［24］。研究表明，用OmpA疫苗進行主動免疫可對鮑曼不動桿菌產(chǎn)生預防作用。小鼠經(jīng)鼻內(nèi)免疫與霍亂毒素結(jié)合的重組OmpA（rOmpA）15 d后，存活率為40%～100%，對照組在2 d內(nèi)全部死亡［50］。LUO等［51］研究發(fā)現(xiàn)，抗原劑量會影響免疫應(yīng)答水平，低劑量（3 μg）rOmpA免疫小鼠表現(xiàn)出平衡的IFNγ和IL-4免疫應(yīng)答，而接受高劑量（100 μg）免疫的小鼠表現(xiàn)出Th2極化反應(yīng)。

隨著生物信息學發(fā)展，不斷發(fā)現(xiàn)一些新的蛋白亞單位，其理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)逐漸清晰，在免疫學實驗中能起到不同的免疫作用，成為研制蛋白亞單位疫苗的理想抗原。有研究表明，Bap、Ata、DcaP、BfnH、BauA、OmpK／Omp22 重組蛋白疫苗均能引起保護性免疫［52-56］。亞單位疫苗通常僅由幾種主要表面蛋白組成，避免產(chǎn)生不需要的抗體，減少疫苗的副反應(yīng)。與全病毒疫苗比較，亞單位疫苗安全性更高，穩(wěn)定性更好，免疫更具持久性［57］。亞單位疫苗可以大腸埃希菌、桿狀病毒、畢赤酵母為載體，實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)［58］，但其免疫原性較低，需與佐劑聯(lián)合使用。

2.5 多糖疫苗 CPS在鮑曼不動桿菌的黏附、致病過程中起著重要作用［59-60］。CPS 可通過提取、生物合成、化學合成等方法獲得。RUDENKO 等［61］通過高碘酸鹽氧化法合成了3 種惰性載體蛋白與鮑曼不動桿菌K9 型CPS 片段的結(jié)合物，用不含佐劑的糖結(jié)合物免疫BALB／c 和ICR-1 小鼠，發(fā)現(xiàn)兩種小鼠免疫應(yīng)答情況有差異，前者激活了IFNγ 途徑，后者不產(chǎn)生IL-4，表明刺激產(chǎn)生了Th1 型適應(yīng)性免疫應(yīng)答。TNF-α是一種具有廣泛活性的促炎細胞因子，與IFNγ結(jié)合可顯著增強吞噬細胞的殺菌能力。因此，該多糖復合物免疫ICR-1小鼠可誘導Th1型適應(yīng)性免疫應(yīng)答，而免疫BALB／c小鼠可能會增強其吞噬細胞的殺菌能力。在RUSSO 等［62］研究中發(fā)現(xiàn)，免疫小鼠的血清能夠增強巨噬細胞吞噬細菌的能力。CPS 疫苗能增強巨噬細胞的吞噬作用，但抗原性和保守性欠佳，僅適用于特定菌株，隨著耐藥菌株的增加，以CPS 為靶點的被動免疫可用于治療耐藥菌株的感染［63］。

2.6 核酸疫苗 核酸疫苗又稱DNA 疫苗，是將一種或多種目的抗原的編碼基因克隆至真核質(zhì)粒表達載體上，再將重組質(zhì)粒直接注入體內(nèi)，在宿主細胞內(nèi)表達目的蛋白，誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答。有研究將重組質(zhì)粒pBudCE4.1-ompA、pEGFP-C2-nlpA、pVAX1-ompA-pal 免疫小鼠后，其血清中的促炎因子和抗體水平均升高，表明該疫苗能有效觸發(fā)體液和細胞免疫應(yīng)答。用不低于5 × 108CFU 感染劑量的細菌免疫小鼠后，各劑量組均有小鼠存活，即該疫苗能引起保護性免疫［64-66］。核酸疫苗構(gòu)建簡單、生產(chǎn)方便、表達穩(wěn)定、可誘發(fā)全面的免疫應(yīng)答［67-68］，在抗感染、抗腫瘤免疫及疾病的預防中具有廣闊應(yīng)用前景。局部注射DNA疫苗可被周圍細胞攝取，進入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，在細胞質(zhì)中翻譯成目的蛋白，再通過細胞分泌或細胞破裂的方式進入組織間激活B 淋巴細胞產(chǎn)生抗體。傳統(tǒng)免疫所使用的抗原一般是滅活病原體、減毒活病原體或病原體的亞單位蛋白，核酸疫苗僅是病原體某種抗原的基因片段，可提供與天然構(gòu)象極為接近的目的蛋白給宿主免疫系統(tǒng)，與自然感染過程相似［69］。核酸疫苗兼有良好的安全性和高效力誘導全方位免疫應(yīng)答，其不僅能預防疾病，還可作為治療性疫苗治療病毒性肝炎、癌癥等［70］。針對流感、乙型肝炎、艾滋病、瘧疾和癌癥DNA 疫苗的試驗結(jié)果表明，核酸疫苗在早期階段效果較好，在小鼠模型中可誘導出強烈的免疫反應(yīng)，但在人體內(nèi)效果不佳［71］。且該疫苗存在一定風險，質(zhì)粒DNA 可能整合至細胞DNA 中，打開原癌基因，關(guān)閉抑癌基因，或誘發(fā)染色體不穩(wěn)定。

鮑曼不動桿菌候選疫苗的主動免疫研究結(jié)果見表2和表3。

表2 鮑曼不動桿菌候選疫苗的主動免疫日程Tab.2 Active immunization schedule for candidate vaccine of Acinetobacter baumannii

表3 鮑曼不動桿菌候選疫苗的免疫效果Tab.3 Effect of candidate vaccine of Acinetobacter baumannii

3 小結(jié)與展望

多重耐藥性菌株的不斷增多使抗生素的研制越發(fā)困難，疫苗研制顯得十分重要。疫苗研制主要側(cè)重于病原體致病機理的研究，目前，重組免疫策略針對單個或多個外膜蛋白，這些蛋白易于制備且安全性高，與其他形式的疫苗比較，病原體回復突變的風險較低。在設(shè)計重組亞單位疫苗時，只需選擇在特定菌株中的已知蛋白，采用PCR 法檢驗臨床分離物中的蛋白，應(yīng)用在線軟件分析基因組和蛋白質(zhì)組信息。鮑曼不動桿菌菌株經(jīng)完全和部分測序選出較多保守性蛋白，評估這些候選菌株疫苗的潛力，確定鮑曼不動桿菌感染或免疫誘導的特定宿主免疫途徑，將有助于發(fā)現(xiàn)潛在的免疫保護候選蛋白。

目前，大多數(shù)鮑曼不動桿菌候選疫苗的研制均基于蛋白質(zhì)技術(shù)。考慮到鮑曼不動桿菌是一種侵襲性病原體，Th2極化反應(yīng)可能不足以提供有效和長期的保護，混合的Th1／Th2 或Th1／Th17 反應(yīng)可能更有益。佐劑的開發(fā)可針對多種抗原，最終將提供覆蓋面廣、臨床療效好的疫苗［72-74］。另外，反向疫苗接種是一種利用大量生物信息數(shù)據(jù)預測潛在候選疫苗的便捷方法［75］。鮑曼不動桿菌耐藥性、多樣性、疫苗接種和動物感染模型的研發(fā)這有助于提高各種鮑曼不動菌疫苗的有效性。