張輝，毛群穎 綜述，梁爭論，徐苗 審校

中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）嚴重威脅人類健康和公共衛(wèi)生安全。截至 2022 年 6 月，SARS-CoV-2 感染已造成全球超過600 萬人死亡［1］。接種疫苗對有效控制疫情具有重要作用，全球已有150 多個SARS-CoV-2 疫苗進入臨床試驗階段，38 個獲批緊急使用或上市，我國有34個疫苗進入臨床試驗階段，5 個獲批附條件上市［2］。目前全球已接種SARS-CoV-2 疫苗118.5 億劑次，我國33.9億劑次［1，3］。隨著SARS-CoV-2值得關注變異株（variants of concern，VOC）不斷出現，其傳染性和免疫逃逸功能增強，導致現有疫苗有效性均有不同程度下降，需研發(fā)新一代更有效的變異株疫苗或廣譜疫苗［4-5］。

中和抗體水平是評價疫苗免疫原性的主要指標，但至今尚無標準化的SARS-CoV-2 中和抗體檢測方法，不同實驗室和不同產品之間的中和抗體水平難以進行橫向比較，嚴重制約疫苗和抗體類治療藥物的研發(fā)和評價。因此，2020年9和12月，我國及世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）先后建立了第一代SARS-CoV-2 抗體中國國家標準品和WHO國際標準品（international standard，IS），為SARSCoV-2 疫苗研發(fā)和評價提供了關鍵標準物質［6-8］。但隨著兩個第一代標準品售罄及VOC 的不斷出現，2022年，WHO 與我國又同步開展了第二代標準品的研制工作。本文就WHO 和我國SARS-CoV-2 抗體標準物質的研制及應用進展作一綜述。

1 指南文件

1.1 定義及分類 標準物質是一種確定了具有一個或多個足夠均勻特性值的物質或材料［9］。作為分析測量行業(yè)中的“量具”，在校準測量儀器和裝置、評價測量分析方法、測量物質或材料特性值、考核分析人員的操作技術水平及在生產過程中產品的質量控制等領域發(fā)揮重要作用。標準物質是具有特性量值的準確性、均勻性、穩(wěn)定性和傳遞性的實物形式計量標準。生物制品標準物質可分為一級（IS）、二級和三級標準物質［10-11］。其中，一級標準物質是由WHO 生物標準化專家委員會指定國際單位（international unit，IU）的最高級別標準品，用于次級標準品的量值溯源；二級標準物質為全球區(qū)域性或國家級標準物質，用于標定三級標準物質和分析檢測；三級標準物質為企業(yè)標準物質，用于實驗室檢測和儀器定標等。WHO 建議應建立二級標準物質標準品，用于大量的SARS-CoV-2 抗體檢測或三級標準物質的標定，以保證限量的WHO 標準品用于維持量值溯源的穩(wěn)定性和持續(xù)性。

1.2 WHO 指南 為規(guī)范生物制品標準物質的研制和分發(fā)，WHO 制訂了《WHO 國際和其他生物制品標準物質制備、特性描述和建立的建議》《國家和其他二級疫苗標準物質建立手冊》和《用于傳染病核酸或抗原檢測的體外診斷實驗二級參考物質的制備手冊：與 WHO 國際標準校準》［10，12-13］。由于 SARS-CoV-2 疫苗及抗體類治療制品研發(fā)和應用的大量需求，2022年又頒布了《WHO 抗體檢測用二級標準品制備手冊》和《WHO 新冠病毒抗體二級標準品制備手冊》，指導全球抗體類二級標準品的研制和應用［11，14］。

1.3 研制基本要求 《WHO 抗體檢測用二級標準品制備手冊》和《WHO 新冠病毒抗體二級標準品制備手冊》中均明確提出，抗體類標準物質是一類用于檢測抗體樣本生物活性（如由抗體亞群所致的中和能力或結合能力）的標準物質［11，14］。標準物質的關鍵屬性包括可追溯性、不確定度（measurement uncertainty，MU）、賦值方法、穩(wěn)定性、可交換性和生物負荷（無菌）等。一級標準品通常采用國際認可的指定值表示，因此，僅二級、三級標準品的標定值具有可追溯性和MU。可交換性是指標準物質是否適合于所檢測的樣品類型，應在協(xié)作標定時加入不同類型的樣品進行評估?；跇藴势吩牧系耐|性、安全性的要求及對突變株的考慮，對相應標準品的制備、協(xié)作標定、結果統(tǒng)計和賦值也提出了具體要求。WHO 提出應依據領域內有經驗的機構（如WHO 協(xié)作中心）的建議組織協(xié)作標定，并需獲得領域內專家和統(tǒng)計學專家支持。應盡量由多個實驗室參加，參加實驗室應具備相關經驗。檢測方法可采用不同檢測方法進行協(xié)標外，還應盡可能提供一個統(tǒng)一的方法和標準操作程序（standard operation procedure，SOP），全部方法均應經驗證，并預設實驗成立的接受標準。

標準品標定的統(tǒng)計分析應盡量采用平行線法或曲線法，WHO、《歐洲藥典》（10. 0 版）和《美國藥典》（USP35-NF30）對此均有專項描述［15-17］，應使用適宜的統(tǒng)計模型進行數據分析，并對每次獨立檢測進行統(tǒng)計模型有效性檢驗。在二級標準品與IS 賦值時，應首先評估兩者對數劑量-關系的線性和平行性，證明兩者具有相近的生物學特性。同時還提出二級標準品的標定值應包括MU，可用95%可信限表示，MU應具有方法特異性等要求。

2 WHO對SARS-CoV-2抗體標準品的研制

2.1 第一代SARS-CoV-2抗體WHO IS的建立 SARSCoV-2 疫苗和抗體治療藥物的研發(fā)急需建立可靠的分析方法進行抗體檢測和評估。IS 的建立可有效促進SARS-CoV-2 抗體檢測方法的標準化，提高各實驗室間檢測結果的可比性和一致性，對確定疫苗和治療藥物所需的有效抗體水平開展流行病學調查及效果評價等具有重要意義。因此，WHO及時啟動了SARSCoV-2抗體IS研究［7-8］。研究選取11位COVID-19患者恢復期血清制備候選標準品（NIBSC code：20／136），由高效價捐獻血漿制備候選參考品（NIBSC code：20／130）。來自15 個國家的51 個實驗室參加了本次協(xié)標研究，共采用ELISA（總抗體、IgG、IgA 和IgM）、活病毒中和、假病毒中和、流式細胞術、免疫層析、抑制試驗和雙抗原結合等共125 個檢測方法進行了協(xié)作標定。協(xié)作標定樣品包括候選標準品1 份，高、中、低效價、低S／高N（S 蛋白低應答／N 蛋白高應答）和陰性候選參考品各1 份、4 份臨床樣本（即高、低滴度COVID-19 患者恢復期血漿和血清各2 份），共計10 份不同類型樣品用以評估20／136 作為國際標準品的適用性。協(xié)作標定結果顯示，20／136是抗體效價最高的樣品之一；采用20／136 為標準計算樣品的相對效價，對于多數陽性樣品可有效降低各實驗室間結合抗體與中和抗體檢測結果的檢測差異，收窄實驗室間的四分位數范圍，提高檢測幾何均值／中位數＜2 的實驗室比例；但對于2 份低效價樣品，相對效價未顯著改變各實驗室間的檢測差異，這可能是由于低效價樣品接近于各種方法的檢測閾值，實驗室間檢測差異較小所致。對于中和抗體檢測，在ELISA 法中，20／136 降低實驗室間檢測差異的作用更明顯。由于不同ELISA 法中采用的單位不同，實驗室間檢測結果差異可達10 000 倍，當采用統(tǒng)一單位時，可顯著提高各實驗室間檢測結果的可比性。對于全部檢測方法，大多數實驗室對5 份參考品的檢測結果均得到相同的高、中、低排序，表明該候選參考盤適用于所有檢測方法。

將候選標準品賦值1 000 國際單位（IU）／mL 計算樣品的IU 值，結果表明，低效價樣品的結合抗體和中和抗體的IU 幾何均值相近，但高效價樣品結合抗體的IU 幾何平均值是中和抗體的2倍?？赡苁怯捎谂c其他樣本比較，20／136結合抗體含量高于中和抗體含量所致，表明雖然候選標準品適用于中和抗體和ELISA 結合抗體檢測，但中和活性與結合活性存在一定區(qū)別。在二級標準品溯源時，應對不同檢測方法分別進行溯源賦值。

2020 年 12 月，經第 73 屆 WHO 生物標準化專家委員會（The Expert Committee on Biological Standardization，ECBS）會議討論，批準 20／136 為第一代SARS-CoV-2 抗體國際標準品（250 IU／安瓿），批準20／150（高效價）、20／148（中效價）、20／144（低S，高N）、20／140（低效價）和20／142（陰性）為第一代SARS-CoV-2抗體國際參考盤，不賦予國際單位。

2.2 第一代SARS-CoV-2 突變株抗體國際參考盤的建立 第一代SARS-CoV-2 抗體IS 和參考盤的建立對統(tǒng)一和協(xié)調全球范圍內疫苗和治療產品的相關抗體檢測發(fā)揮了重要作用。自2020 年底，更具傳染性的SARS-CoV-2 VOC不斷出現，對現有疫苗和抗體類藥物的有效性提出了嚴峻挑戰(zhàn)。為促進針對不同VOC 抗體檢測方法的發(fā)展，支持疫苗和藥物的持續(xù)開發(fā)，WHO計劃建立含有不同VOC的國際抗體參考盤［18］。經第 74 屆 ECBS 討論確定開展新一代 SARSCoV-2 突變株抗體國際參考盤的研制項目。該項目采取WHO、流行病預防創(chuàng)新聯盟和英國國家生物制品檢定所（The National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）合作的形式開展，以建立包含5個VOC抗體參考品為目標，將主要用于活病毒中和抗體檢測，而不再應用于以結合抗體類檢測為主的診斷試劑。目前該項目已獲得了3 個不同VOC（原型株、Alpha 和Delta 株）的恢復期血漿或血清原材料，其他兩個VOC 的恢復期血漿或血清尚在收集中，一旦新VOC出現，該參考盤將進行靈活調整。

2.3 第二代SARS-CoV-2 抗體WHO IS 的建立 由于第一代SARS-CoV-2 抗體IS 的需求較大，至2021年8 月庫存已告罄，急需建立第二代WHO IS。因此在 2021 年 10 月 的 第 74 屆 ECBS 會 議 上 ，討 論 并通過了第二代WHO IS 的研制申請（WHO／BS／2021.2411）［19］。經討論確定，基于當前 SARS-CoV-2疫苗免疫的抗體效價較高，且VOC不斷出現，第二代WHO IS的原材料選擇首先應采用更高滴度的SARSCoV-2疫苗免疫或恢復期血清及血漿進行研制，理想情況是第二代IS 對現有的VOC 均呈現高滴度；其次，考慮到原材料變化可能帶來的影響，原材料應盡可能與第一代WHO IS相似，并使用相同的中和抗體測量系統(tǒng)進行評估；制備量至少應達5 000 安瓿以上，以滿足SARS-CoV-2疫苗、治療藥物和流調需求。

在第一代標準物質應用中發(fā)現，由于標準物質在結合抗體類檢測方法的不恰當應用，可能會導致國際單位的混亂和誤解。因此，第二代IS 明確為基于中和抗體的IU，而對于針對不同抗原的結合抗體檢測，將被指定一個新結合抗體單位（BAU），以確保該國際單位的性質和定量準確；同樣，對于可能出現的VOC，將根據協(xié)作標定結果為每個VOC 計算并指定數值。

3 中國國家SARS-CoV-2抗體標準品的研制

3.1 第一代國家標準品的建立 我國是開展SARSCoV-2 疫苗研發(fā)最早的國家之一，具有研發(fā)類型多、企業(yè)多、臨床試驗多等特點。為滿足我國SARS-CoV-2疫苗免疫原性評價的需求，在第一代IS建立之前，我國于2020 年9 月建立了第一代國家SARS-CoV-2 中和抗體標準品［6］。該標準品采用我國COVID-19 患者恢復期血漿制成，由包括國家質控實驗室在內的11 個實驗室開展了協(xié)作標定研究，研究采用活病毒和假病毒檢測方法對包括國家標準品在內的5 份樣品進行協(xié)作標定檢測，結果顯示，采用國家標準品計算相對效力可有效降低各實驗室間檢測差異，提升不同實驗室和不同疫苗之間中和抗體檢測準確性和可比性。2020年9月，該標準品通過了我國國家藥品監(jiān)督管理局生物制品標準委員會的批準，成為我國第一代SARS-CoV-2中和抗體標準品，賦值1 000 U／mL，用于SARS-CoV-2 假病毒中和抗體檢測。由于該標準品的建立早于第一代IS，未能將其溯源至國際單位（IU）。同期，我國還另建立了國家SARS-CoV-2血清參考盤（SARS-CoV-2 IgM 和IgG 抗體檢測試劑國家參考品：370096、370097），用于結合抗體類診斷試劑的質量控制［20］。

3.2 第二代國家標準品的研制 與WHO IS 相同，我國第一代國家標準品也得到了廣泛關注，需求量較大，于2021 年迅速售罄。為確保我國疫苗、治療藥物的研發(fā)，并與WHO IS 進行量值溯源，我國于2021年底采用COVID-19 患者恢復期血漿和免疫球蛋白分別制備了2個候選標準物質，聯合國內9家主要臨床檢測實驗室進行協(xié)作標定，目前已完成協(xié)作標定和穩(wěn)定性研究。

4 小結及展望

WHO 和我國第一代SARS-CoV-2 抗體標準物質對支撐全球范圍SARS-CoV-2 疫苗和抗體類藥物研發(fā)，對抑制疫情蔓延均發(fā)揮了重要作用，但具有高傳染性和免疫逃逸能力的SARS-CoV-2 VOC流行，對全球范圍疫情的控制造成了巨大挑戰(zhàn)。為滿足新一代疫苗、治療藥物研發(fā)的需求，WHO 正在積極收集不同VOC 感染者的血清樣本，以研究建立靈活組合的第二代標準參考血清盤。我國SARS-CoV-2 疫苗和治療性抗體藥物研發(fā)企業(yè)多，研究建立標準物質對滿足疫苗和藥物研發(fā)需求具有重要意義，需在進一步收集篩選不同VOC感染者血清樣本的基礎上加強國際合作，加快我國新一代SARS-CoV-2抗體標準品的研制進程。