李艷莉 徐仰龍 鄧金勇 何升騰 董方

(1.三亞中心醫(yī)院口腔科，海南 三亞 572000;2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科，貴州 遵義 563003;3.三亞市人民醫(yī)院口腔科，海南 三亞 572000)

口腔黏膜下纖維性變(Oral submucous fibrosis，OSF)是亞洲國家常見的口腔癌前病變，由口腔黏膜結(jié)締組織中異常的膠原蛋白沉積所引起，往往伴隨組織纖維化，患者會出現(xiàn)口干、潰瘍、燒灼刺痛感、口腔活動受損以及進行性張口受限等癥狀[1-3]。研究表明，7%～30%的OSF患者可能會轉(zhuǎn)化為口腔癌，且隨著OSF患者數(shù)量的增多，惡變風(fēng)險也在逐漸升高[4]。OSF的病變組織內(nèi)存在纖維化頰粘膜肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblast，MFB)，能夠表達平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，具有較好的收縮性及膠原分泌能力，活化的MFB是導(dǎo)致纖維化過程中細(xì)胞外基質(zhì)積累的關(guān)鍵致病細(xì)胞[5]。因此在OSF中以MFB為作用靶點抑制增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為，逆轉(zhuǎn)成纖維細(xì)胞向其分化，是OSF潛在的治療策略。

人趨化素樣因子(Chemokine-like factor 1，CKLF1)是趨化因子樣因子蛋白家族的一員，作為CCR4 的功能配體，其在炎癥和自身免疫性疾病中具有廣譜的生物學(xué)功能。CKLF1 包含至少兩個位于其C末端的分泌亞型，其中一種為CKLF1-C19多肽，簡稱C19，從果蠅S2細(xì)胞中穩(wěn)定表達時所分泌，可作為CKLF1的拮抗劑在多種疾病中發(fā)揮抑制作用[6-7]。目前已有研究表明，C19對TGF-β誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化具有抑制作用，并能夠抑制氣道重塑和纖維化的發(fā)生[8]。本研究通過使用C19處理OSF患者MFB觀察細(xì)胞活化的變化，并探討C19影響OSF的分子機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月～2021年1月在三亞中心醫(yī)院口腔科門診就診并確診為OSF的患者8例，其中男6例，女2例，年齡38～51歲，平均(40.95±3.98)歲，均有咀嚼檳榔習(xí)慣。選擇同期體檢的健康志愿者8例，其中男5例，女3例，年齡37～48歲，平均(39.75±3.66)歲，均無咀嚼檳榔、飲酒及吸煙等行為，且無口腔黏膜病變和其他急性或慢性炎癥性疾病。本研究獲得患者知情同意以及三亞中心醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 CKLF1-C19多肽(中國疾病基因研究中心)；胎牛血清(浙江天杭生物科技公司)；DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；免疫熒光染色試劑盒和CCK-8試劑盒(上海翊圣生物科技公司)；羥脯氨酸檢測試劑盒(英國Abcam公司)；Trizol(日本Takara公司)；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物公司)；DAPI染液、Phallacidin染液和I型鼠尾膠原(北京索萊寶生物公司)；Transwell小室、BCA蛋白測定試劑盒和結(jié)晶紫染液(上海碧云天生物研究所)；Pierce ECL化學(xué)發(fā)光試劑液(上海索寶生物科技公司)；鼠抗人α-SMA、sFRP1、sFRP2、sFRP5單克隆抗體以及兔抗人GAPDH單克隆抗體(英國Abcam公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠(北京中杉金橋公司)。

1.3 方法

1.3.1 FB和MFB分離、培養(yǎng)與鑒定 取兩組頰部對應(yīng)位置黏膜組織，采用組織塊法分離培養(yǎng)原代細(xì)胞。用含抗菌素的PBS清洗黏膜組織3次，每次3 min，分離上皮下組織并剪成約1 mm3的小塊，將小塊放入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的恒溫箱中貼壁培養(yǎng)，當(dāng)組織塊周圍有細(xì)胞生長，且融合達到80%左右時，0.25%胰蛋白酶消化傳代，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，選擇第三代至第六代細(xì)胞用于實驗。

1.3.2 免疫熒光染色 原代培養(yǎng)的細(xì)胞傳至第5代時，進行細(xì)胞爬片，進行α-SMA和F-actin的免疫細(xì)胞熒光染色。細(xì)胞爬片后，4℃下以4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水沖洗干凈，pH7.4的PBS處理5 min，0.1% Triton X-100繼續(xù)作用5 min，再以5%BSA封閉20 min，PBS清洗干凈后，在玻片上滴加鼠抗人α-SMA單克隆抗體和Phallacidin試劑液，室溫避光染色20 min，PBS清洗干凈，采用DAPI復(fù)染10 min，清洗后封片，通過掃描共焦顯微鏡觀察染色情況。

1.3.3 細(xì)胞分組與處理 選擇生長狀態(tài)良好的第5代MFB，以1×104個細(xì)胞接種入96孔板，置于37℃、5%CO2的恒溫箱過夜培養(yǎng)。實驗分組設(shè)置為對照組、0.001 mg/L C19組、0.01mg/L C19組、0.1 mg/L C19組，對照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，各濃度C19處理組分別加濃度為0.001、0.01、0.1 mg/L的CKLF1-C19多肽培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞進行后續(xù)研究。

1.3.4 CCK-8法 將MFB按照1.3.3處理，結(jié)束后置于37℃、5%CO2的恒溫箱內(nèi)孵育，分別于24、48、72 h 時，加入10 μL CCK-8試劑液至待測細(xì)胞孔中，輕輕混勻，繼續(xù)孵育4 h，通過全自動酶標(biāo)儀測定450 nm 處各孔細(xì)胞的光密度(OD)值。

1.3.5 羥脯氨酸含量 測定收集處理后的各組MFB，4℃下以4000 rpm/min離心10 min，獲取各組樣本的上清，測定羥脯氨酸的含量，具體步驟嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書進行。

1.3.6 膠原凝膠收縮實驗 將Ⅰ型鼠尾膠原溶液配制成2 mg/mL的新鮮膠原混合液，收集處理后的各組MFB，胰蛋白酶消化后，使用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸，并以2×105個/mL接種于膠原液中，混合后，取500 μL接種于24孔板中，置于37℃下孵育2 h，使細(xì)胞貼附于凝膠表面，進一步置于恒溫箱內(nèi)孵育48 h，觀察膠原凝膠收縮情況，數(shù)碼相機攝像，使用ImageJ軟件分析膠原凝膠面積，測定培養(yǎng)后凝膠面積與凝膠初始面積的百分比。

1.3.7 細(xì)胞遷移與侵襲檢測 使用帶8 μm孔徑的聚碳酸酯濾膜的24孔Transwell小室測定各組MFB的遷移和侵襲能力。在細(xì)胞侵襲測定中，濾膜涂基質(zhì)膠以覆蓋膜孔。在上室中加入100 μL含1×103個細(xì)胞的懸液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液。置于37℃、5%CO2恒溫箱中孵育24 h，將其下表面在4%多聚甲醛中固定后，結(jié)晶紫染色，PBS清洗后封片，光學(xué)顯微鏡觀察膜下細(xì)胞數(shù)目，計數(shù)5個不同視野取平均值。

1.3.8 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 各組MFB中加入適量Trizol，提取總RNA，分光光度計檢測純度與濃度。根據(jù)第一鏈cDNA合成試劑盒，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再以cDNA為模板，通過熒光定量PCR系統(tǒng)進行擴增，檢測各基因mRNA的表達水平，按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書進行。擴增條件如下：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 10 s，40個循環(huán)；溶解曲線：95℃ 15 s；60℃ 60 s；95℃ 15 s。以GAPDH作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法來計算目的基因表達量，引物序列，見表1。

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequence

1.3.9 Western blot檢測 在各組MFB中加入RIPA溶液，置于冰上裂解30 min，4℃下以12000 r/min離心30 min，收集上清，BCA法測定蛋白質(zhì)量。取等量蛋白樣品，在制備的10%SDS-PAGE凝膠孔內(nèi)上樣，電泳分離，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，將膜放在5%脫脂奶粉中，室溫封閉1 h，TBST洗膜，加入一抗工作液(1∶1000)，4℃孵育過夜。次日，棄去原液，TBST充分洗膜后，加入對應(yīng)二抗工作液(1∶5000)，室溫孵育1 h，利用Pierce ECL化學(xué)發(fā)光底物顯影，凝膠系統(tǒng)成像，ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié)果

2.1 FB與MFB的鑒定結(jié)果 在倒置顯微鏡下可見培養(yǎng)的FB與MFB大多呈長梭形，胞體較大，胞核為卵圓形，MFB較FB更加飽滿，體積增大，且形態(tài)較不規(guī)則，細(xì)胞增殖加快(見圖1)。α-SMA和F-actin免疫熒光染色結(jié)果顯示，從健康志愿者的頰黏膜組織中分離的FB，α-SMA染色為陰性，F(xiàn)-actin染色呈紅色熒光，主要分布在細(xì)胞膜；從OSF患者的頰黏膜組織中分離的MFB，α-SMA染色呈綠色熒光，F(xiàn)-actin染色呈紅色熒光，兩者均在形成束狀纖維結(jié)構(gòu)分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。見圖2。

圖1 FB與MFB的形態(tài)觀察(比例尺=20 μm)Figure 1 Observation of the morphology of FB and MFB

圖2 FB與MFB內(nèi)α-SMA和F-actin表達檢測(免疫熒光染色，比例尺=20 μm)Figure 2 Detection of α-SMA and F-actin expression in FB and MFB

2.2 CKLF1-C19多肽對MFB增殖活性的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，經(jīng)過0.001、0.01、0.1 mg/L的C19多肽處理的MFB，在培養(yǎng)48 h和72 h后，細(xì)胞增殖活性均顯著降低(P<0.05)，各劑量對細(xì)胞增殖活性的抑制作用呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組MFB增殖活性比較Figure 3 Comparison of MFB proliferation activity in each group

2.3 CKLF1-C19多肽對MFB上清中羥脯氨酸含量的影響 各組MFB培養(yǎng)液上清中羥脯氨酸含量測定結(jié)果顯示，經(jīng)過0.001、0.01、0.1 mg/L的C19多肽處理的MFB上清中羥脯氨酸的含量均顯著低于對照組MFB上清中羥脯氨酸的含量(P<0.05)；與0.001 mg/L C19組比較，0.01 mg/L C19組與0.1 mg/L C19組細(xì)胞上清中羥脯氨酸的含量顯著降低(P<0.05)；與0.01 mg/L C19組比較，0.1 mg/L C19組細(xì)胞上清中羥脯氨酸的含量也顯著降低(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組MFB上清中羥脯氨酸含量比較Figure 4 Comparison of hydroxyproline content in MFB supernatant of each group注：與對照組比較，①P<0.05；與0.001 mg/L C19組比較，②P<0.05；與0.01 mg/L C19組比較，③P<0.05

2.4 CKLF1-C19多肽對MFB收縮活性的影響 膠原凝膠收縮實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，經(jīng)過0.001、0.01、0.1 mg/L的C19多肽處理的MFB與膠原混合培養(yǎng)后，膠原凝膠收縮面積比率均顯著增加(P<0.05)；與0.001 mg/L C19組比較，0.01 mg/L C19組與0.1 mg/L C19組膠原凝膠收縮面積比率顯著增加(P<0.05)；與0.01 mg/L C19組比較，0.1 mg/L C19組膠原凝膠收縮面積比率也顯著增加(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組MFB收縮活性比較 Figure 5 Comparison of MFB contractile activity in each group注：A.膠原凝膠收縮實驗檢測各組MFB膠原情況；B.各組MFB膠原凝膠收縮面積比率。與對照組比較，①P<0.05;與0.001 mg/L C19組比較，②P<0.05；與0.01 mg/L C19組比較，③P<0.05

2.5 CKLF1-C19多肽對MFB內(nèi)分泌型卷曲相關(guān)蛋白表達的影響 qRT-PCR實驗測定結(jié)果顯示，經(jīng)過0.001、0.01、0.1 mg/L的C19多肽處理的MFB內(nèi)sFRP1和sFRP2的mRNA表達水平均較對照組顯著上調(diào)(P<0.05)；0.01 mg/L C19組與0.1 mg/L C19組中sFRP1和sFRP2的mRNA表達水平較0.001 mg/L C19組顯著上調(diào)(P<0.05)；與0.01 mg/L C19組比較，0.1 mg/L C19組sFRP1和sFRP2的mRNA表達水平進一步顯著上調(diào)(P<0.05)。而不同濃度C19多肽處理下的sFRP5 mRNA表達水平與對照組sFRP5 mRNA表達水平之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖6)。Western blot檢測結(jié)果也顯示，與對照組比較，經(jīng)過0.001、0.01、0.1 mg/L的C19多肽處理的MFB內(nèi)sFRP1和sFRP2的蛋白表達水平均顯著上調(diào)(P<0.05)；與0.001 mg/L C19組比較，0.01 mg/L C19組與0.1 mg/L C19組中sFRP1和sFRP2的蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與0.01 mg/L C19組比較，0.1 mg/L C19組sFRP1和sFRP2的蛋白表達水平進一步顯著上調(diào)(P<0.05)，而各組之間的sFRP5 蛋白表達水平的變化差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖7。

圖6 各組MFB內(nèi)sFRP1、sFRP2及sFRP5的mRNA表達水平比較Figure 6 Comparison of mRNA expression levels of sFRP1,sFRP2 and sFRP5 in each group of MFB注：與對照組比較，①P<0.05;與0.001 mg/L C19組比較，②P<0.05；與0.01 mg/L C19組比較，③P<0.05

圖7 各組MFB內(nèi)sFRP1、sFRP2及sFRP5的蛋白表達水平比較Figure 7 Comparison of the protein expression levels of sFRP1,sFRP2 and sFRP5 in the MFB of each group注：A.Western blot檢測各組MFB內(nèi)sFRP1、sFRP1、sFRP5蛋白條帶；B.各組MFB內(nèi)sFRP1、sFRP2、sFRP5蛋白的表達水平。與對照組比較，①P<0.05;與0.001 mg/L C19組比較，②P<0.05；與0.01 mg/L C19組比較，③P<0.05

2.6 CKLF1-C19多肽對MFB遷移與侵襲的影響 Transwell實驗測定結(jié)果顯示，與對照組比較，經(jīng)過0.001、0.01、0.1 mg/L的C19多肽處理的MFB，遷移細(xì)胞數(shù)目與侵襲細(xì)胞數(shù)目均顯著減少(P<0.05);相較于0.001 mg/L C19組比較，0.01 mg/L C19組與0.1 mg/L C19組遷移細(xì)胞數(shù)目與侵襲細(xì)胞數(shù)目均顯著減少(P<0.05)；0.1 mg/L C19組遷移細(xì)胞數(shù)目與侵襲細(xì)胞數(shù)目均顯著少于0.01 mg/L C19組(P<0.05)。見圖8。

圖8 各組MFB遷移與侵襲的數(shù)目比較 Figure 8 Comparison of the number of MFB migration and invasion in each group注：與對照組比較，①P<0.05;與0.001 mg/L C19組比較，②P<0.05；與0.01 mg/L C19組比較，③P<0.05

3 討論

OSF是一種慢性口腔疾病，會導(dǎo)致疤痕產(chǎn)生以及組織纖維化，并具有惡性轉(zhuǎn)化潛力，最終可能引發(fā)口腔癌。由于其惡性轉(zhuǎn)化率逐漸增高，該疾病對死亡率也有顯著影響，據(jù)統(tǒng)計，OSF的發(fā)生因種族和地區(qū)而異，并與飲食、習(xí)慣和文化密切相關(guān)，南亞和東南亞的OSF患病率最高[9-10]。根據(jù)流行病學(xué)與相關(guān)研究表明，咀嚼檳榔是OSF重要的危險因素之一。為了減少OSF的發(fā)生，早期發(fā)現(xiàn)癌前病變、了解病理機制和探究治療方案均意義重大。本研究通過從OSF患者頰部病變黏膜組織分離MFB，觀察到在不同濃度CKLF1-C19多肽作用下對細(xì)胞增殖活性、收縮、遷移以及侵襲等能力活化相關(guān)指標(biāo)產(chǎn)生了積極影響。

根據(jù)口腔黏膜的功能和組織學(xué)特征，可分為咀嚼型黏膜、特殊型黏膜和襯里型黏膜。OSF在這三種類型的黏膜上均發(fā)生，并最常發(fā)生在頰黏膜、磨牙后區(qū)域和軟腭部位。在OSF 病例中，最初口腔粘膜從柔軟的粉紅色逐漸變?yōu)闆]有彈性并略微發(fā)白，隨后黏膜明顯無彈性、不透明，觸診時呈紙質(zhì)白色且堅韌，在后期階段唇部和上顎也會發(fā)生一個甚至多個部位病變[11]。OSF患者在攝入辛辣食物后，口腔會出現(xiàn)嚴(yán)重?zé)聘?，此外，患者還會出現(xiàn)張口能力受限和口腔傷口愈合不佳等現(xiàn)象。MFB廣泛存在于瘢痕和纖維化的組織中，除了具備成纖維細(xì)胞的分泌功能外，還能夠發(fā)揮部分肌細(xì)胞的收縮功能，然而，在組織修復(fù)過程中持續(xù)激活MFB可導(dǎo)致修復(fù)機制異常，分泌富含膠原的纖維性基質(zhì)，從而促使瘢痕攣縮及纖維化發(fā)生。MFB產(chǎn)生的α-SMA能夠結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維中，在收縮時產(chǎn)生強大的力，MFB通過這些纖維控制細(xì)胞的形狀和運動、ECM重塑以及組織收縮[12-14]。本研究通過免疫熒光染色也發(fā)現(xiàn)了從OSF患者中分離培養(yǎng)的MFB中α-SMA高表達。此外，還有研究表明MFB表現(xiàn)出高水平的細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和細(xì)胞表面受體的誘導(dǎo)性，這使得細(xì)胞具有炎癥細(xì)胞的某些特性，能夠?qū)Ω鞣N炎癥、免疫和機械信號做出反應(yīng)，并且纖維化組織中的MFB還顯示出對凋亡的高度抵抗性。結(jié)合以上觀點，MFB在OSF進展中可能發(fā)揮著重要作用。

以往研究[15]結(jié)果顯示C19在多項疾病中發(fā)揮積極作用，例如，C19通過抑制TNF-α、IL-1β和IL-8等介質(zhì)的產(chǎn)生來減少中性粒細(xì)胞對缺血區(qū)域的浸潤，防止大鼠局灶性腦缺血；C19在體內(nèi)和體外抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移和內(nèi)膜增生，表明其在動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄中的保護作用[16]；C19通過抑制炎癥細(xì)胞的浸潤和微血管細(xì)胞的增殖來預(yù)防銀屑病[17]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過C19處理后MFB的增殖活性下降，細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)目均減少，膠原凝膠收縮面積比率增加，同時，上清中羥脯氨酸的含量減少，由此說明C19能夠有效抑制MFB的活化。此外，羥脯氨酸是膠原組織代謝的指標(biāo)，其含量變化反映了細(xì)胞上清中可溶性膠原含量的變化，間接說明纖維化的程度。

Wnt分泌蛋白是糖基化脂質(zhì)修飾蛋白家族成員，在組織發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，Wnt信號通路的異常激活與多種疾病的發(fā)病機制有關(guān)，而sFRP家族是Wnt信號通路的細(xì)胞外調(diào)節(jié)因子，具有與卷曲受體同源的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，可以通過該結(jié)構(gòu)域隔離Wnt或與卷曲受體形成無活性的復(fù)合物來抑制Wnt信號傳導(dǎo)[18-20]。sFRP含有sFRP 1～5五個成員，且均已在哺乳動物中得到鑒定。目前，已證實sFRP1、sFRP2與sFRP5能夠影響肌成纖維細(xì)胞的增殖、膠原合成以及成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程，與不同組織的纖維化發(fā)生相關(guān)[21-23]。鑒于此，本研究在C19處理后的MFB中檢測了這三種sFRP的表達變化，結(jié)果顯示出C19能夠下調(diào)sFRP1和sFRP2的表達，對sFRP5的表達未產(chǎn)生顯著影響。由此推測，C19調(diào)控sFRP1和sFRP2表達可能是影響OSF發(fā)生發(fā)展的一個分子機制。

4 結(jié)論

肌成纖維細(xì)胞在口腔黏膜下纖維性變的發(fā)病機制中發(fā)揮作用，CKLF1-C19多肽能夠抑制口腔黏膜下纖維性變頰粘膜組織中肌成纖維細(xì)胞的增殖活性、遷移及侵襲，降低膠原分泌能力，阻止了肌成纖維細(xì)胞的活化，這一作用可能與調(diào)控sFRP1和sFRP2的表達相關(guān)，可能為CKLF1-C19多肽治療OSF提供了實驗依據(jù)。