王 倩，顏 璽，黃 鑫 綜述,簡華剛 審校

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院急救部 400010)

糖尿病足(diabetic foot,DF)定義為糖尿病患者踝關節(jié)以遠的皮膚和皮下組織的破壞,通常會侵犯到肌肉和骨組織,下肢動脈閉塞和外傷可增加其發(fā)生的概率。DF是導致糖尿病患者殘疾和死亡的主要原因之一。目前,糖尿病足潰瘍(diabetes foot ulcer,DFU)已成為我國重要的公共衛(wèi)生問題。DFU患者死亡率高達11%,截肢率已達22%[1]。下肢動脈閉塞、周圍神經(jīng)病變和創(chuàng)傷是DFU風險增加的3個主要原因。由于糖尿病患者自身糖代謝障礙的影響,細菌生物膜的產(chǎn)生,創(chuàng)面局部肉芽組織生長所需的生長因子缺乏,傳統(tǒng)的清創(chuàng)術已不能滿足創(chuàng)面肉芽生長的需求,富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)可以解決這個問題。PRP是通過體外離心技術獲得的自體血液制品，其中高濃度的血小板可產(chǎn)生大量生長因子,促進細胞分裂增殖,加速創(chuàng)面微血管形成,從而改善創(chuàng)面微環(huán)境，促進創(chuàng)面愈合,可廣泛用于各種DFU的修復。

1 DFU愈合困難原因

DFU創(chuàng)面難愈合、延遲愈合與創(chuàng)面微環(huán)境的改變、局部細菌感染、細菌生物膜的形成及創(chuàng)面生長因子的缺乏有關,由于各種原因共同作用導致局部生長因子減少和活性降低[2],主要原因如下:(1)長期高糖環(huán)境導致糖尿病患者外周動脈硬化,外周血管狹窄導致創(chuàng)面供血不足,局部代謝產(chǎn)物排泄障礙、生長因子和其他營養(yǎng)物質(zhì)供應不足導致創(chuàng)面愈合困難[3]。(2)糖尿病患者血液處于高凝狀態(tài),血液黏度的增加會影響細胞之間的物質(zhì)交換及糖基化最終產(chǎn)物的堆積[4],影響創(chuàng)面局部金屬蛋白酶(MMPs)的水平,改變生長因子的活性并降低其功能[5]。除此以外,組織中糖代謝產(chǎn)物排泄障礙,導致代謝產(chǎn)物異常堆積阻礙了各類修復細胞的增殖,促進細胞凋亡,表皮細胞上皮化時間延長,細胞外基質(zhì)合成受阻,降解增加,血管舒縮功能障礙等導致急性創(chuàng)面慢性化,并出現(xiàn)創(chuàng)面延遲愈合或不愈合[6]。(3)糖尿病患者創(chuàng)面易被病原微生物定植,導致創(chuàng)面局部感染程度加重[7]。創(chuàng)面細菌感染導致細菌不可逆的附著于創(chuàng)面局部,繁殖分化并分泌多糖基質(zhì),包裹細菌群落產(chǎn)生細菌生物膜,可抵抗抗生素、殺菌劑、惡劣環(huán)境及宿主免疫防御機制,導致創(chuàng)面細菌難以根治;還可分泌多糖基質(zhì)、脂蛋白等多糖蛋白復合物刺激細菌繁殖;細菌生物膜中的炎性滲出物可持續(xù)為細菌提供營養(yǎng),導致持續(xù)的過度炎性反應[8]。同時,創(chuàng)面缺血缺氧表達內(nèi)皮細胞黏附因子增加,導致白細胞介素(IL)-1α、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α等促炎因子釋放增加,加速創(chuàng)面炎癥級聯(lián)反應發(fā)生[9]。(4)神經(jīng)病變和糖代謝產(chǎn)物異常堆積導致參與創(chuàng)面修復細胞功能下降甚至凋亡,創(chuàng)面生長因子分泌減少,高濃度的炎癥因子刺激細胞釋放大量蛋白水解酶,水解生長因子及受體、基質(zhì)蛋白等促進創(chuàng)面愈合所需的生長因子,抑制肉芽組織生長使創(chuàng)面修復進程受阻[10]。

2 PRP促進慢性創(chuàng)面愈合作用機制

創(chuàng)面愈合可分為凝血期、炎癥期、修復期、成熟期4個時期。慢性創(chuàng)面愈合主要是后2個時期受阻,這與創(chuàng)面局部缺乏生長因子和纖維蛋白有關[11]。PRP被激活后形成富血小板凝膠,每個血小板由50～80個α顆粒和數(shù)百種生物活性蛋白組成,主要包括以血小板源性生長因子(PDGF)為代表的多種生長因子。這些生長因子主要參與組織修復過程,并有其特定的生物分子功能,改變創(chuàng)面炎癥細胞功能、促進肉芽組織生長及血管神經(jīng)再生。PRP中大量的纖維蛋白可促進細胞遷移增殖。纖維蛋白原激活后形成的網(wǎng)絡結構為修復細胞的爬行提供支架。任慈等[12]報道自體PRP中豐富的纖維蛋白,能夠收縮創(chuàng)面促進細胞修復,還可在創(chuàng)面局部形成濕潤的環(huán)境,加速創(chuàng)面愈合。

2.1 抗炎

DFU創(chuàng)面抗炎和炎癥微環(huán)境的失衡促進了慢性持續(xù)性炎性反應的出現(xiàn)和發(fā)展。LI等[13]研究發(fā)現(xiàn)PRP中的白細胞具有抗炎作用;有研究[13-14]通過建立體外DFU模型發(fā)現(xiàn)DFU 中的 miRNA 水平與傷口愈合直接相關,miRNA-21/PDCD4/NF-κB信號通路是PRP發(fā)揮抗炎作用的直接機制,PRP可上調(diào) miRNA-21水平,下調(diào) PDCD4水平來降低 NF-κB 活性,從而促進組織修復。國內(nèi)一項研究顯示,PRP可分泌血小源性抗菌肽(包括血小板堿性蛋白、纖維蛋白肽等),通過降低炎性反應增強免疫作用[15]。

2.2 抗菌

?ETINKAYA等[16]發(fā)現(xiàn)革蘭陽性球菌中的耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌,革蘭陰性桿菌中的肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌是各種慢性創(chuàng)面中較為常見的菌群,PRP可抑制上述細菌的活性發(fā)揮抗菌作用。CHEN等[4]用糖尿病慢性難愈合創(chuàng)面患者的全血制備PRP研究其體外抗菌作用,結果顯示PRP可降低金黃色葡萄球菌細菌活性,其發(fā)揮抗菌作用的機制可能是PRP釋放的血小板殺菌蛋白(platelet microbicidal protenins PMPs)可增加細菌細胞膜的通透性,PMPs進入細胞后抑制細胞內(nèi)物質(zhì)合成,從而起到抗菌作用。PRP中活化的血小板還可通過釋放多種生物活性物質(zhì)(如腺苷、組胺、趨化因子、免疫球蛋白等),誘導血小板聚集,也可通過趨化白細胞發(fā)揮抗菌作用。

2.3 大量生長因子和活性物質(zhì)釋放

PRP含有豐富的生長因子、細胞因子、抗菌肽等生物活性物質(zhì),可刺激細胞增殖分化,基質(zhì)合成,加速組織再生與修復[17]。PRP 中包含的主要生長因子有:血小板源性生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子β(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF)、表皮生長因子(EGF)等[18]。相關研究表明,PRP中的生長因子可誘導組織細胞中MMPs抑制劑(TIMP)釋放增加,TIMP可抑制MMPs合成,MMPs/TIMP二者比例下降可延長創(chuàng)面細胞基質(zhì)、細胞外基質(zhì)及生長因子降解時間,促進創(chuàng)面愈合[19]。

2.4 改善局部循環(huán)

PRP可以通過提供多種生長因子和細胞因子改善創(chuàng)面局部微循環(huán)，促進糖尿病缺血創(chuàng)面的愈合[20]。PRP中的VEGF與血管內(nèi)皮細胞受體(VEGFR)結合可刺激內(nèi)皮細胞增殖,促進創(chuàng)面微血管生成。FGF通過促進蛋白多糖產(chǎn)生,刺激內(nèi)皮細胞增殖而改善創(chuàng)面局部循環(huán)[21]。

2.5 自噬作用

一項國內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn),自噬與創(chuàng)面愈合密切相關,PRP可以通過調(diào)節(jié)自噬水平加速DFU創(chuàng)面的愈合,具有調(diào)節(jié)炎癥、抑制凋亡、抗氧化應激和促進血管生成的作用[22]。實驗證明,經(jīng)PRP治療的DF患者,創(chuàng)面肉芽組織中LC-3蛋白表達水平升高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,自噬反應增強。PRP可以抑制組織細胞中炎癥因子的釋放和聚集,改善創(chuàng)面局部微環(huán)境,這也可能與自噬有關[23]。

2.6 促進周圍神經(jīng)修復

PRP可促進周圍神經(jīng)修復,其機制可能與PRP具有刺激細胞增殖的潛力有關,可誘導如神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生生長因子(GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子等的合成,并明顯增加施旺細胞的增殖,促進軸突遷移和再生。ROSNER等[24]研究表明,PRP可以刺激大鼠坐骨神經(jīng)的修復,效果相當于自體神經(jīng)移植。還發(fā)現(xiàn),PRP中的PDGF是施旺細胞的有絲分裂原,且TGF-β具有調(diào)控施旺細胞的作用。

3 制備方法

PRP是通過體外離心靜脈血液得到的血小板和生長因子的濃縮物。它可以是自體的,也可以是異體的。根據(jù)制備時采取的離心次數(shù)不同,分為一次離心法和二次離心法。國內(nèi)外對于PRP的制備方案沒有統(tǒng)一的指南或共識。目前,我國廣泛采用二次離心法。然而,由于各研究單位使用的離心設備不同,制備參數(shù)和成品質(zhì)量也有很大差異。

PRP中的多種高濃度的生長因子是其發(fā)揮效應的主要物質(zhì),國際細胞醫(yī)學學會根據(jù)PRP中的血小板濃度劃分出低濃度(2.5～3倍)和高濃度(5～9倍);基礎研究和臨床應用普遍認同血小板濃度500×109/L～1 000×109/L為其發(fā)揮作用的有效濃度。部分研究人員認為,血小板濃度2～6倍對組織修復有促進作用,血小板過度激活后產(chǎn)生過高濃度的生長因子反而會抑制細胞增殖,阻礙組織再生與創(chuàng)面修復[25]。

PRP制備過程需嚴格遵守無菌原則，采取“現(xiàn)采現(xiàn)用”原則[26]。根據(jù)創(chuàng)面大小抽取靜脈血20～100 mL，加入含枸櫞酸鈉抗凝劑的試管中，第一次離心后血液分為3層，最上層為貧血小板血清層，最下面為紅細胞層，中間為富血小板層，棄去最下層紅細胞層，余下上清液收集備用。上清液經(jīng)二次離心后分為兩層，最上層為血清層，下層即為 PRP層。將兩次離心所獲得PRP收集在一起，以10∶1比例加入血小板激活劑葡萄糖酸鈣注射液，10 min內(nèi)完成創(chuàng)面注射。

目前,國內(nèi)外研究人員普遍認為二次離心法所得到的血小板濃度較高。HELLER等[27]發(fā)現(xiàn)第一次以160×g低速離心20 min,第二次以400×g高速離心15 min,所得血小板濃度相當于正常血小板濃度的10倍。LANDESBERG等[28]研究后發(fā)現(xiàn)離心力大于250×g時血小板會過度破壞,第一次離心時間小于5 min得到的血小板濃度與全血中的濃度無明顯差異。因此他認為第一次以200×g離心15 min,第二次以200×g離心10 min制備的PRP促進創(chuàng)面修復的效果較好。張昭遠等[29]采用第一次以400×g離心10 min,第二次以1 100×g離心10 min得到的PRP中血小板濃度約為全血濃度的6.13倍,應用于創(chuàng)傷修復效果良好。袁南兵等[30]比較了幾種離心方法后發(fā)現(xiàn)第一次以313×g低速離心4 min,第二次以1 252×g高速離心6 min,血小板濃縮倍數(shù)可達到3～7倍,血小板回收率高達75%以上,是制備PRP較好的方法。

4 應用及進展

4.1 PRP聯(lián)合干細胞

脂肪來源的干細胞可通過分化為成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞直接促進創(chuàng)面愈合[31]。干細胞還可以通過釋放多種生長因子及瘦素、脂聯(lián)素等創(chuàng)面愈合相關的肽促進創(chuàng)面愈合[32]。脂肪細胞與PRP聯(lián)合應用,可在早期促進脂肪細胞血管化,改善缺血,提高細胞存活率,增強脂肪來源的干細胞促進創(chuàng)面愈合的能力[33]。

4.2 同種異體PRP

不同患者的病情有一定差異,尤其是糖尿病患者的年齡段主要分布于中老年組。糖尿病患者全身狀況差且存在很多并發(fā)癥,尤其是糖尿病腎病患者血黏度增加,血流動力學改變,血小板易發(fā)生聚集,血小板數(shù)量減少、功能減退等使治療無法達到預期效果,難以從中分離提取PRP,因此很難確保PRP的質(zhì)量和療效。在這些患者中,使用同種異體PRP已成為一種較為理想的治療選擇。早在2003年研究人員就開始研究異基因PRP,CARTER等[34]在公馬的難愈性創(chuàng)面模型中使用異基因PRP,結果表明同種異體PRP對慢性創(chuàng)面具有相同的治療效果,實驗中未發(fā)生異常不良反應。

5 展望和小結

PRP在治療慢性難愈合性創(chuàng)面方面具有諸多優(yōu)勢。PRP作為一種自體生物材料，具有制備簡單,使用后無副作用,組織修復和再生能力強,低免疫原性,不傳播傳染性疾病,抗感染能力強等特點;高濃度的生長因子加速創(chuàng)面愈合,纖維蛋白促進創(chuàng)面收縮,多種因素共同作用促進創(chuàng)面愈合。

PRP在臨床的廣泛應用為治療慢性難愈合性創(chuàng)面提供了新的方向,但還存在很多局限性。(1)目前國內(nèi)外關于PRP的制備方法不夠成熟,不同制備方法及制備參數(shù)所得到的PRP成分和濃度不同,不同的活化方法和不同的抗凝劑會產(chǎn)生不同的量-效關系,這是PRP在臨床推廣的最大阻礙。(2)PRP的半衰期短,儲存時間短,常規(guī)的真空冷凍方法無法保證冷凍制劑的生物效應,尚缺乏大量的基礎實驗和臨床試驗以進一步制訂標準化制備方法,統(tǒng)一血小板濃度標準,進一步闡明其修復創(chuàng)面的分子機制,以更好地應用于慢性創(chuàng)面的臨床治療。

PRP和其他技術的聯(lián)合應用提高了慢性難愈合性創(chuàng)面的治愈率[35]。創(chuàng)面局部采用PRP同時聯(lián)合基因技術或細胞工程技術治療慢性難愈性創(chuàng)面成為可能;通過DNA分子重組技術或基因探針技術將目的基因?qū)氚屑毎?再誘導或抑制目的基因的表達,并對細胞的特定功能進行調(diào)控,從而達到促進創(chuàng)面愈合的目的[36]。