張 敏，楊 華，魏巧蘭，何高明，沈 敏*

(1．石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000;2．新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆 石河子 832000)

羊毛是紡織業(yè)重要的原料，羊毛品質(zhì)決定著羊毛的價(jià)格和紡紗性能。其中羊毛的纖維直徑是決定羊毛品質(zhì)的關(guān)鍵因素。毛囊是羊毛生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，研究毛囊發(fā)育對(duì)羊毛品質(zhì)形成的遺傳學(xué)機(jī)理具有重要意義。研究表明，羊毛纖維直徑的大小受毛囊發(fā)育的影響[1]。毛干在皮膚經(jīng)歷周期性生長(zhǎng)和脫落，而底部毛囊也經(jīng)歷包括生長(zhǎng)期、退行期、休止期3個(gè)時(shí)期周期性循環(huán)。其中，生長(zhǎng)期是毛干發(fā)生的時(shí)間，在此期間毛乳頭細(xì)胞增殖，毛球膨大，毛母質(zhì)細(xì)胞分化，毛囊向下生長(zhǎng)至真皮層。毛囊生長(zhǎng)期決定了羊毛的長(zhǎng)度和細(xì)度，是研究毛囊發(fā)育信號(hào)分子調(diào)控的關(guān)鍵階段。退行期的毛乳頭毛球部萎縮，導(dǎo)致毛發(fā)逐步停止生長(zhǎng)。而休止期毛囊上皮細(xì)胞變少，毛發(fā)脫落。隨后在基因調(diào)控下再一次進(jìn)入生長(zhǎng)期。毛囊周期發(fā)育受多種信號(hào)通路和相關(guān)基因調(diào)控，影響毛囊發(fā)育的通路包括WNT通路、EDAR通路、BMP通路、FGF通路和SHH通路[1-5]，毛囊發(fā)育相關(guān)基因包括Wnt10b[6]、Edar[7]、BMP4[8]、FGF5[9]、PTCH1[10]等基因。其中，F(xiàn)GF5是FGF信號(hào)通路中已知的最有效的促進(jìn)毛囊從生長(zhǎng)期到休止期轉(zhuǎn)換的因子，對(duì)毛囊發(fā)育調(diào)控至關(guān)重要[9]。Higgins等研究證實(shí)，F(xiàn)GF5能夠誘導(dǎo)人毛囊的退行期，是決定人毛囊生長(zhǎng)期比例和毛發(fā)生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11]。He等[12]通過(guò)在體外培養(yǎng)的絨山羊真皮乳頭細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FGF5，發(fā)現(xiàn)FGF5能夠顯著下調(diào)維持毛囊生長(zhǎng)重要因子IGF-1、versican和noggin的表達(dá)。另外，Yoshizawa等[13]研究證實(shí)，F(xiàn)GF5基因突變可導(dǎo)致敘利亞倉(cāng)鼠中毛發(fā)長(zhǎng)度變長(zhǎng)，這證明了FGF5可以調(diào)控毛囊發(fā)育。EEF1D是翻譯延伸因子復(fù)合物的亞基，在細(xì)胞中負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)翻譯的過(guò)程。于常江等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊皮膚成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)EEF1D基因可顯著上調(diào)FGF5的表達(dá)。由此可見(jiàn)，EEF1D基因參與毛囊發(fā)育調(diào)控。然而， 目前針對(duì)EEF1D基因表達(dá)與羊毛品質(zhì)以及毛囊發(fā)育的研究較少。因此，本研究以中國(guó)美利奴羊和多胎薩?？搜?yàn)檠芯繉?duì)象，分析EEF1D基因的組織表達(dá)差異，以及在品種間和毛囊發(fā)育周期的表達(dá)變化，為深入研究EEF1D基因在毛囊周期和羊毛品質(zhì)形成中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)羊選自新疆農(nóng)墾科學(xué)院種羊場(chǎng)中同一飼養(yǎng)條件下2～3歲健康成年羊，包括3只中國(guó)美利奴羊(新疆軍墾型)和3只多胎薩?？搜?。參照程曉印[15]毛囊發(fā)育周期時(shí)間，采集處于毛囊生長(zhǎng)期(10月)、退行期(1月)和休止期(4月)綿羊體側(cè)部皮膚組織和羊毛樣品，以及中國(guó)美利奴羊(新疆軍墾型)的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮膚、肌肉、脂肪、大腦和小腦組織。羊毛樣品標(biāo)記后用于細(xì)度測(cè)定，組織樣品立即置于液氮中，轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

1.3 方法

1.3.1 羊毛纖維直徑測(cè)定 羊毛樣品洗凈后，使用哈氏切片器(Y172型)制備羊毛纖維橫截面試樣切片，按照GB/T 10685-1989國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)羊毛纖維直徑試驗(yàn)方法，采用中國(guó)紡織科學(xué)研究院北京和眾視野科技有限公司的CU-4纖維細(xì)度儀對(duì)羊毛切片進(jìn)行纖維直徑測(cè)定，每只羊取400根羊毛進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及合成 設(shè)計(jì)EEF1D基因(GenBank登錄號(hào)：XM_015097560.1)和GAPDH基因(GenBank登錄號(hào)：XM_001289746.1)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物[14]，并交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。引物信息如表1所示。

表1 EEF1D和 GAPDH基因?qū)崟r(shí)熒光定量引物信息

1.3.3 組織總RNA提取和cDNA合成 按照Trizol試劑使用說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA。按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。20 μL體系和程序如下：5×gDNA Eraser Buffer(2.0 μL)，gDNA Eraser(1.0 μL)，Total RNA(2.0 μL)，RNase Free ddH2O(5.0 μL)在42 ℃孵育2 min，隨后添加PrimeScript RT Enzyme Mix I(1.0 μL)、RT prime Mix(1.0 μL)、5×gDNA Eraser Buffer 2(for Real Time)(4.0 μL)、RNA Free ddH2O(4.0 μL)至PCR管中，37 ℃孵育15 min，85 ℃ 5 s。合成的cDNA 保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4EEF1D和GAPDH基因的PCR擴(kuò)增EEF1D基因和GAPDH基因的PCR擴(kuò)增體系均為20 μL，包括2×MasterMix(10 μL)，上、下游引物(各0.5 μL)，cDNA(1 μL)，ddH2O(8 μL)。

qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s；40 ℃ 30 s。擴(kuò)增完成后，進(jìn)行熔解曲線分析，分別讀取EEF1D和GAPDH基因的CT值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法計(jì)算EEF1D基因表達(dá)，應(yīng)用IBM SPSS Statistics 22.0軟件的ANOVA模塊分析各組羊毛纖維直徑、基因表達(dá)水平的差異。比較在不同組織和品種間以及羊毛不同發(fā)育時(shí)期的EEF1D基因表達(dá)差異，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果和分析

2.1 品種間羊毛纖維直徑分析

統(tǒng)計(jì)分析在毛囊生長(zhǎng)期、退行期和休止期中國(guó)美利奴羊和多胎薩?？搜虻难蛎w維直徑和離散系數(shù)，結(jié)果如表2所示。在品種間，中國(guó)美利奴羊羊毛纖維直徑極顯著低于多胎薩?？搜?P<0.01)。

表2 多胎薩?？搜蚝椭袊?guó)美利奴羊的羊毛纖維直徑的比較

2.2 總RNA提取

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，綿羊10個(gè)組織的總RNA均存在28 s、18 s 和5 s 這3個(gè)條帶，且條帶清晰，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象。核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)OD260/280值均介于1.8～2.0之間。

2.3 EEF1D和GAPDH基因的PCR擴(kuò)增

將逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA各取1 μL模板進(jìn)行EEF1D基因和GAPDH基因PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳圖條帶與設(shè)計(jì)目的條帶大小基本一致。結(jié)果如圖1所示。

圖1 EEF1D(A)和GAPDH(B)基因的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.4 EEF1D基因的組織表達(dá)分析

由圖2可見(jiàn)，EEF1D基因在中國(guó)美利奴羊(新疆軍墾型)10種組織中均有表達(dá)。其中，EEF1D基因在皮膚組織中表達(dá)量最高(P<0.05)。

圖2 EEF1D基因的組織表達(dá)圖

2.5 EEF1D基因在綿羊品種間和毛囊發(fā)育周期中的表達(dá)水平分析

由圖3可知，中國(guó)美利奴羊(新疆軍墾型)和多胎薩福克羊兩個(gè)品種綿羊皮膚組織中EEF1D基因在毛囊發(fā)育期表達(dá)趨勢(shì)一致，在休止期表達(dá)量最高，在退行期表達(dá)量最低(P<0.05)。在毛囊生長(zhǎng)期和退行期，中國(guó)美利奴羊皮膚組織中EEF1D基因表達(dá)量顯著和極顯著高于多胎薩?？搜?P<0.05和P<0.01)。而在休止期，EEF1D基因的表達(dá)量在品種間差異不顯著。

圖3 EEF1D基因在綿羊毛囊發(fā)育期和品種間的表達(dá)變化

3 討 論

我國(guó)是世界上最大的綿羊生產(chǎn)國(guó)，也是世界第三大羊毛生產(chǎn)國(guó)。但2020年1月-2020年10月，我國(guó)羊毛、毛條進(jìn)口量累計(jì)為18.32×104t，羊絨進(jìn)口量累計(jì)為0.59×104t[16]。羊毛市場(chǎng)的供需不平衡，優(yōu)質(zhì)細(xì)羊毛很大程度依賴(lài)進(jìn)口，需要進(jìn)一步提升國(guó)內(nèi)毛用羊的羊毛品質(zhì)。細(xì)度、長(zhǎng)度、彎曲、吸濕性和回潮率等均是影響羊毛品質(zhì)的重要因素，其中羊毛細(xì)度的經(jīng)濟(jì)價(jià)值相當(dāng)于其他因素價(jià)值的總和。在羊毛市場(chǎng)上，超細(xì)毛價(jià)格是普通羊毛2～3倍。因此，優(yōu)質(zhì)細(xì)羊毛是市場(chǎng)關(guān)注的重點(diǎn)[17]，也是科研突破的焦點(diǎn)。研究細(xì)毛羊的羊毛品質(zhì)形成的遺傳學(xué)機(jī)理，對(duì)提升羊毛品質(zhì)、推動(dòng)優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊的育種進(jìn)程有重要意義。

中國(guó)美利奴羊是在我國(guó)新疆育成的重要細(xì)毛羊品種，具有優(yōu)秀毛品質(zhì)的種質(zhì)特性。多胎薩?？搜蛞彩窃谖覈?guó)新疆育成的多胎肉用羊新品系，以高繁殖力為主、兼具肉用性能好的種質(zhì)特性。本試驗(yàn)中，中國(guó)美利奴羊平均羊毛纖維直徑為16.41 μm，而多胎薩?？似骄蛎w維直徑為29.2 μm，中國(guó)美利奴羊的毛纖維直徑顯著低于多胎薩?？搜?。該研究結(jié)果與王晶晶等[18]結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明中國(guó)美利奴羊具有優(yōu)良的羊毛品質(zhì)。

EEF1D基因在真核生物蛋白質(zhì)合成中負(fù)責(zé)翻譯延伸過(guò)程，發(fā)揮交換因子的作用[24]。在細(xì)胞水平，EEF1D基因參與細(xì)胞周期活動(dòng)[20]、卵母細(xì)胞成熟、大腦和睪丸轉(zhuǎn)錄激活、調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[21]，以及EF-1βγδ蛋白質(zhì)的合成[22]。在個(gè)體水平，EEF1D不但與各種癌癥、神經(jīng)元的發(fā)育[23]、膠質(zhì)瘤[24]有關(guān)，且與乳腺發(fā)育和乳脂合成[25]有關(guān)。然而，在綿羊毛囊發(fā)育研究方面，EEF1D基因的組織表達(dá)以及影響毛囊發(fā)育和羊毛品質(zhì)的研究報(bào)道非常少。于常江[14]采集18-30月齡美利奴羊的7個(gè)組織樣本，經(jīng)qRT-PCR分析EEF1D基因的組織表達(dá)差異，EEF1D基因的表達(dá)量從高到低分別：肺臟﹥脾臟﹥皮膚﹥腎臟﹥肝臟﹥心臟﹥肌肉。本試驗(yàn)中，EEF1D基因在中國(guó)美利奴母羊的10個(gè)組織中的表達(dá)量從高到低依次為：皮膚﹥脂肪﹥脾臟﹥肝臟﹥腎臟﹥小腦﹥肌肉﹥心臟﹥肺臟﹥大腦，與于常江試驗(yàn)結(jié)果明顯不同。本試驗(yàn)EEF1D基因在皮膚組織中表達(dá)量最高，說(shuō)明該基因在毛囊發(fā)育中起重要作用。

綿羊的毛囊包括初級(jí)毛囊和次級(jí)毛囊，初級(jí)毛囊在胎兒 65 d開(kāi)始發(fā)育，次級(jí)毛囊在胎兒期85 d開(kāi)始發(fā)育，次級(jí)毛囊的發(fā)育決定羊毛細(xì)度和品質(zhì)[26]。綿羊毛囊發(fā)育具有周期性，包括生長(zhǎng)期、退行期和休止期。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，毛囊生長(zhǎng)期和退行期的中國(guó)美利奴羊EEF1D基因表達(dá)量顯著高于多胎薩?？搜?，即EEF1D基因在粗毛羊皮膚組織中表達(dá)量低，在細(xì)毛羊皮膚組織中表達(dá)量高，說(shuō)明EEF1D基因的表達(dá)與羊毛細(xì)度相關(guān)。EEF1D基因表達(dá)量，在毛囊發(fā)育3個(gè)時(shí)期差異顯著，且休止期最高，說(shuō)明EEF1D基因參與毛囊發(fā)育，隨著EEF1D基因表達(dá)量升高，使毛囊進(jìn)入休止期。

4 結(jié) 論

EEF1D基因在皮膚組織中呈高豐度表達(dá)。在毛囊生長(zhǎng)期和退行期，EEF1D基因在細(xì)毛羊中的表達(dá)量顯著高于粗毛羊。EEF1D基因的高表達(dá)誘導(dǎo)毛囊發(fā)育進(jìn)入休止期。