文成龍,馬雪瑤，楊 瑞，胡張濤，劉偉東,胡建宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

性別控制技術(shù)被稱為家畜繁育改良的第三次革命，是指通過對動物正常生殖過程進行人為干預(yù)，使家畜產(chǎn)生的后代性別符合人們需要的一種繁殖技術(shù)[1]。通過性別控制技術(shù)可以使與性別有關(guān)的經(jīng)濟性狀所產(chǎn)生的經(jīng)濟效益更大，如泌乳量、生長速度以及肉質(zhì)等；此外，運用性別控制技術(shù)還能提高選種強度、增加育種效率，以及克服伴性有害基因的危害[2]等，因此，研究性別控制技術(shù)對家畜的繁育改良十分重要。本文以性別控制技術(shù)為切入點，對性別分化的基因調(diào)控、性別反轉(zhuǎn)、X和Y精子分離的方法如電泳法、精子上游分離法、白蛋白柱分離法、免疫分離法和流式細(xì)胞儀分離法進行綜述，以期為與性別控制相關(guān)的研究提供參考。

1 性別分化的基因調(diào)控

性別分化是從性腺的形成和發(fā)育開始的，原始生殖細(xì)胞(Primordial Germ Cells，PGCs)經(jīng)過遷移與體細(xì)胞結(jié)合形成完整的胚胎性腺[3]，隨后胚胎性腺會在多種信號因子的作用下向著睪丸或者卵巢分化，這些信號因子的產(chǎn)生需要激活特異性睪丸或卵巢信號通路，而任一通路的激活就會對另一特異性通路產(chǎn)生抑制。

1.1 睪丸的分化調(diào)控

SRY基因是Y染色體中對性別分化起決定性作用的基因，其在雄性動物睪丸發(fā)育過程中能激活SOX9，并與其共同作用于WT1、NR5A1、GATA4等基因，最終導(dǎo)致睪丸的形成和雄性性別分化[4]。

睪丸發(fā)育開始時，EMX2和LHX9開始表達，LHX9和WT1可以激活NR5A1表達，而NR5A1和WT1可以激活A(yù)MH表達，其表達可誘導(dǎo)繆勒氏管退化，刺激雄性器官的發(fā)育[5]，同時CBX2不僅促進性腺的形成，而且也促進SRY、WT1、NR5A1的轉(zhuǎn)錄[6]。睪丸開始發(fā)育期間，SOX9通過睪丸增強子核心序列 TESCO調(diào)節(jié)自身轉(zhuǎn)錄，或者與 FGF9、PTGDS形成彼此促進表達的正向調(diào)控循環(huán)，SOX9的高水平表達狀態(tài)可以代替SRY的調(diào)節(jié)功能，進一步誘導(dǎo)睪丸的發(fā)育[7]。研究表明在睪丸分化的成熟階段，DMRT1維持了睪丸的后期發(fā)育，DMRT1可以抑制與卵巢發(fā)育有關(guān)的基因FOXL2的表達，一直到機體的成熟[8]。

1.2 卵巢的分化調(diào)控

卵巢的發(fā)育是以抑制雄性睪丸發(fā)育特異基因的表達為基礎(chǔ)的，通過WNT4基因的表達來調(diào)控卵巢的發(fā)育[9]。卵巢發(fā)育初步開始時，WNT4與RSPO1 共同促進 CTNNB1的表達，激活FOXL2基因抑制SOX9的表達，促進了卵巢的發(fā)育[10]。WNT4 、RSPO1、CTNNB1和FOXL2的表達能夠調(diào)節(jié)FST等基因的表達轉(zhuǎn)錄，從而促使卵巢發(fā)育的開始[11]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2基因有維持卵巢和卵泡發(fā)育的作用，其通過抑制WT1的表達來阻止卵泡發(fā)育過程中NR5A1和SOX9的表達。在卵巢發(fā)育成熟階段，F(xiàn)OXL2與RUNX1相互促進，降低DMRT1表達，維持促進卵巢的發(fā)育[12]。

2 性別反轉(zhuǎn)的調(diào)控

性別反轉(zhuǎn)是指由于某些原因，個體從一種性別特征轉(zhuǎn)換成為另一種特征的現(xiàn)象，表現(xiàn)為個體表型與性染色體不同，即只是生殖腺及其表型發(fā)生變化而其性染色體并沒有發(fā)生變化。因此可將性別反轉(zhuǎn)分為XX性別反轉(zhuǎn)(染色體型為XX，表型為雄性)和XY性別反轉(zhuǎn)(染色體型為XY，表型為雌性)。在部分較低等動物尤其是在水生生物中，由于外界環(huán)境的改變會使其發(fā)生性別反轉(zhuǎn)，但仍然擁有正常的繁殖能力。而哺乳動物由于性腺比較穩(wěn)定，至今尚未發(fā)現(xiàn)具有繁殖能力的自然性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象，但高等動物能通過基因和激素調(diào)控的方式人為實現(xiàn)反轉(zhuǎn)，這是通過性別分化的機制啟動性別反轉(zhuǎn)調(diào)控的一種方式[13]。

早在1991年，就有研究者通過將存在SRY的Y染色體片段導(dǎo)入雌鼠胚胎的手段，使部分雌鼠發(fā)育為雄性，證明了性別反轉(zhuǎn)在動物性別控制應(yīng)用的可行性[14]。由于Sp1結(jié)合位點在人類和兔子中具有高度的同源性，因此，兔子是一個用來確定臨床雄性對雌性的性別逆轉(zhuǎn)綜合征的合適的動物模型。研究者應(yīng)用CRISPR/Cas9質(zhì)粒顯微注射到原核期受精卵的細(xì)胞質(zhì)中，通過破壞兔SRY基因5'側(cè)翼區(qū)的Sp1-B和Sp1-C結(jié)合位點導(dǎo)致雄性動物性反轉(zhuǎn)為雌性[15]。隨后將囊胚期胚胎移植后得到12只性反轉(zhuǎn)兔，暗示具有雌性表型的SRY基因敲除的雄性兔子可能維持懷孕并產(chǎn)下活的幼崽[15]。在豬上，具有SRY基因敲除的基因雄性豬會經(jīng)歷外部和內(nèi)部生殖器的性別逆轉(zhuǎn)。SRY作為豬性別決定的主要開關(guān)的發(fā)現(xiàn)，可能為豬生產(chǎn)中防止公豬感染的外科閹割提供一種替代方法[16]。豬與人類在遺傳、生理和解剖上有很多的相似性，也為人類性逆轉(zhuǎn)綜合征提供了一個合適的大型動物模型，從而可以開發(fā)新的人類性障礙干預(yù)措施。從最早在鼠上實現(xiàn)性別反轉(zhuǎn)到在豬上實現(xiàn)性別反轉(zhuǎn)，表明了性別反轉(zhuǎn)的可行性，有望在更多的動物上實現(xiàn)性別反轉(zhuǎn)。

3 X、Y精子分離方法

分離X、Y精子的方法主要是利用其物理、化學(xué)和生物差異進行，如精子的大小、密度、電荷、DNA含量等。隨著研究的不斷深入，X、Y精子分離技術(shù)得到發(fā)展和完善。目前，能應(yīng)用的分離技術(shù)包括電泳法、免疫學(xué)分離法、流式細(xì)胞儀分離法等。

3.1 電泳法

由于不同精子表面膜電位帶電荷數(shù)的差異，使不同精子在電場內(nèi)向不同電極游動，從而達到分離精子的效果。孫玲等[17]用電泳法成功的分離了人類的精子。利用電泳法分離出的正常精子形態(tài)比率、DNA未損傷比例和受精能力均優(yōu)于梯度離心法，但電泳法處理的精子活率并不理想，而且此方法的分離結(jié)果容易受到環(huán)境和pH的影響，所以此方法在生產(chǎn)中并不常用[18]。

3.2 精子上游分離法(Swim-up)

X精子和Y精子在TALP溶液中的活力高低不同，Y精子有更快的運動速度且可穿透TALP溶液聚集在上層，從而分離X、Y精子。Yan等[19]用此方法分離了牛精子，但是其體外授精后的胚胎性別比例并沒有明顯的變化，分離效果并不顯著。然而Azizeddin等[20]通過改進后的swim-up法分離出了大量具有受精能力的精子。這種方法操作簡單而且費用較低，可以用于生產(chǎn)實踐。Umehara等[21]研究表明，TLR7/8的配體激活選擇性地抑制了攜帶X染色體的精子(X精子)的運動，但不影響精子的活率，而未受抑制的Y精子則向上游動，精子活力的不同使得Y精子和X精子得以分離，將上層精子進行體外受精后，雄性胚胎占90%，胚胎移植后獲得的后代中有83%是雄性，相反，用下層精子產(chǎn)生的胚胎和后代中有81%是雌性。

3.3 白蛋白柱分離法

當(dāng)X、Y精子在白蛋白溶液中運動時，Y精子具有更快的速度，故可以用白蛋白柱來分離精子。但是分離的結(jié)果并不理想，Beernink等[22]用白蛋白柱分離出牛的Y精子然后進行授精，其后代的性別比例并沒有明顯的變化。

3.4 免疫分離法

免疫學(xué)分離法根據(jù)H-Y抗體可與Y精子上的H-Y抗原特異結(jié)合，以此來分離X、Y精子。羅承浩等[23]運用這一原理對奶牛進行試驗，結(jié)果表明奶牛的產(chǎn)母犢率可達60.7%，相比于自然情況下性別比例提高了10.7%。但是此方法操作時間較長，對精子的損傷較大，影響精子活力，降低了分離精子的受胎率，故難以大規(guī)模推廣。

3.5 流式細(xì)胞儀分離法

目前分離X、Y精子的最有效分離方法是利用流式細(xì)胞儀進行分離。利用X精子和Y精子中DNA含量的微小差異，可達到分離的效果[24]。利用此方法分離出的性控精液在性別控制上準(zhǔn)確度可達到90%，并且該技術(shù)在牛的生產(chǎn)上已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[25]。熊顯榮等[26]利用流式細(xì)胞儀分離了牦牛精子，其分離后的精子純度可達到94%以上，分選后的精子活力可達到54%。分離后的X精子和Y精子進行體外授精后，各組胚胎性別鑒定結(jié)果精子純度基本吻合。盡管用流式細(xì)胞儀分離精子已取得了很大進展，但是由于成本高、周期慢、技術(shù)要求高，目前僅在牛上有效應(yīng)用，該技術(shù)不能被很好地推廣[27]。

4 展 望

高效、準(zhǔn)確地控制畜禽的性別一直是現(xiàn)代動物生產(chǎn)中期望突破的技術(shù)，雖然在性別控制技術(shù)的研究領(lǐng)域已經(jīng)取得了許多突破，但在實際生產(chǎn)中仍存在許多困難和挑戰(zhàn)。流式細(xì)胞術(shù)可以基于DNA的差異精確分離X、Y精子，目前在牛生產(chǎn)的應(yīng)用中取得良好的經(jīng)濟價值，但在其他一些物種中的應(yīng)用較少。此外，流式細(xì)胞儀分離精子速度慢、成本高，且分離出的精子受精能力低于常規(guī)精子，冷凍解凍后的活力和頂體完整率低等問題也限制了性別控制技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化。每一種性別控制技術(shù)都有其優(yōu)缺點。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，性別控制技術(shù)的準(zhǔn)確度和靈敏度將大大提高。相信在不久的將來，性別控制技術(shù)將會實現(xiàn)商業(yè)化并大規(guī)模生產(chǎn)，必將給畜牧業(yè)帶來更大的經(jīng)濟效益。