楊曉菲，李 強*，李延峰，王洪權

1.赤峰學院附屬醫(yī)院 神經內科, 內蒙古自治區(qū) 赤峰 024000； 2.中國醫(yī)學科學院 北京協和醫(yī)學院 北京協和醫(yī)院 神經科, 北京 100050；3.航天中心醫(yī)院/北京大學航天臨床醫(yī)學院 神經內科, 北京 100049

缺血性卒中(ischemic stroke,IS) 是世界范圍內死亡和長期致殘的主要原因之一，治療方法有限，因此研發(fā)治療藥物具有重要意義。NF-E2相關因子2(Nrf2)通過協調多種細胞保護基因表達，是機體防御氧化應激損傷的主要調節(jié)因子[1]。近年研究顯示，通過藥物激活NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)通路可抑制氧化應激損傷、小膠質細胞激活和神經炎性反應等機制來抑制缺血性卒中神經元丟失，發(fā)揮對腦保護作用。因此，靶向調控Nrf2/ARE通路成為治療缺血性卒中很有吸引力的新靶點。本文目的主要綜述近2年來在短暫局灶性腦缺血(transient focal cerebral ischemia, tMCAO)動物模型中通過藥物激活Nrf2/ARE通路治療腦缺血損傷研究的最新進展。

1 Nrf2/ARE通路

缺血性卒中存在Nrf2/ARE通路的激活。在生理條件下，Nrf2主要定位于細胞質內， 與Nrf2上游調控因子Keap1結合，經泛素蛋白酶途徑降解，從而使Nrf2維持在基礎水平。當細胞在腦缺血期間受到過多的氧化刺激時，Nrf2與Keap1分離、轉運到細胞核，與抗氧化和細胞保護蛋白的ARE序列結合并激活這些保護基因，后者包括血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1), NAD(P) H:醌氧化還原酶1(NAD(P)H quinone oxidoreductase，NQO1), 谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx), 和谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase, GST)家族等一些成員。

2 Nrf2/ARE通路激活在短暫局灶性腦缺血中的作用

通過短暫結扎阻塞大腦中動脈(middle cerebral artery occlusion, MCAO)造成的局灶性腦缺血/再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)的動物模型，稱之為短暫局灶性腦缺血(tMCAO)模型。研究顯示，在tMCAO模型中Nrf2/ARE通路被激活。I/R導致如過氧化氫(H2O2)等在內的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高，后者反過來激活Nrf2，轉運到細胞核的Nrf2與細胞保護基因的抗氧化反應原件(antioxidant response element, ARE)結合，進而上調包括HO-1在內的抗氧化蛋白，從而可減輕I/R期間過量產生的ROS所引起的氧化應激損傷和細胞死亡。

在tMCAO后24 h腦損傷最嚴重，因此大多數研究在該時間點檢測腦組織Nrf2/ARE通路改變，包括皮層、大腦半球、海馬、紋狀體和小腦在內不同缺血腦組織中Nrf2的變化。而有些研究延伸到早期(2～8 h)或晚期(3～14 d)。多數研究者選擇持續(xù)1～2 h的腦缺血制備tMCAO I/R動物模型。大多數研究在持續(xù)1～2 h造成tMCAO后24 h檢測缺血皮層或大腦中的總Nrf2水平，顯示Nrf2在mRNA和蛋白質水平均上調(可高達2～3倍)。Nrf2蛋白水在8 h后開始升高[2]，可持續(xù)3～14 d。核轉位后Nrf2在細胞核內聚集，增加與ARE結合的活性[3]，這一現象可出現在tMCAO后7 h[4]。而Nrf2靶基因，包括HO-1和NQO1等也同時上調。HO-1升高可持續(xù)2～14 d。tMCAO后24 h，缺血側海馬神經元總Nrf2蛋白和細胞核內Nrf2蛋白表達明顯升高，并至少持續(xù)升高2 d。另有免疫組化研究顯示，1 h缺血造成tMCAO后再灌注2 h后在缺血區(qū)域周圍存在Nrf2升高，8 h后達峰，而包括HO-1在內的Nrf2靶基因在24～72 h后明顯升高。

1 h缺血造成tMCAO后7 d[3]在神經元、內皮細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞中存在Nrf2免疫陽性[5]。利用熒光素酶小鼠模型觀察到從腦缺血開始到tMCAO后7 d存在時間依賴性Nrf2表達。在缺血早期未檢測到體內Nrf2表達的熒光信號，但在缺血后24 h達到峰值。這種Nrf2表達主要在缺血半暗帶區(qū)檢測到，主要定位于神經元和星形膠質細胞內部[6]。通過量化綠色熒光蛋白(GFP)標記的Nrf2，發(fā)現缺血后4～48 h的皮質和24 h的紋狀體中Nrf2和HO-1 蛋白增高更加明顯。

3 藥物靶向激活Nrf2/ARE通路抑制缺血性腦損傷

在腦缺血中靶向激活Nrf2/ARE通路觸發(fā)細胞保護反應，能夠抑制缺血性腦損傷，使Nrf2激活劑成為治療實驗性短暫局灶性腦缺血的可能性。以下本文綜述近2年來通過激活Nrf2/ARE通路在tMCAO實驗模型中治療腦缺血損傷的研究進展。

3.1 黃酮類化合物

槲皮素(quercetin)通過SIRT1/Nrf2/HO-1信號通路顯著降低腦梗死體積、神經功能缺損、血腦屏障(blood brain barrier,BBB)通透性和ROS生成。此外，選擇性Sirt1抑制劑EX527逆轉了這種神經保護作用，表明槲皮素通過SIRT1信號通路保護MCAO大鼠的BBB，從而對腦缺血再灌注損傷具有抑制作用[7]。花葵素(pelargonidin)為常見的花青素(anthocyanidin)之一，最近研究顯示，其可通過激活Nrf2通路，上調HO-1、SOD，下調腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白細胞介素-6 (IL-6)和丙二醛(MDA)，進而在tMCAO大鼠模型中降低腦梗死面積、改善神經功能[8]。 枇杷苷(eriocitrin)在tMCAO大鼠模型中，可通過激活Nrf2通路，上調HO-1、SOD和NQO1, 抑制NF-κB p65的磷酸化，降低腦組織內IL-6和TNF-α的水平、增加IL-10的含量，進而通過抗氧化和抗炎作用發(fā)揮其對I/R損傷的抑制作用[9]。作為草藥主要查爾酮成分的黃腐酚(xanthoangelol, XAG)可通過激活Nrf2抑制氧化應激誘導的凋亡，在tMCAO大鼠模型中發(fā)揮抑制神經元損傷的作用[10]。其他黃酮類化合物如山奈酚(kaempferol)[11]、黃芪黃酮(astragalin)[12]和三葉苷(trilobatin)[13]等均可通過激活Nrf2/ARE通路發(fā)揮在tMCAO模型中的腦保護作用。綜上所述，黃酮類化合物在tMCAO模型中具有激活Nrf2通路，發(fā)揮抑制缺血性卒中損傷的作用。

3.2 多酚類化合物

多酚二苯乙烯類天然化合物白皮杉醇(piceatannol)在小鼠I/R中其可激活Nrf2, 上調HO-1和 NQO1發(fā)揮改善神經功能評分和減少腦梗死面積，進而具有神經保護和抗腦缺血損傷的作用[14]。 葉下珠素(phyllanthin)在I/R大鼠模型中通過激活Nrf2通路，抗神經炎性反應、氧化應激和抗凋亡機制，從而改善腦功能障礙和腦水腫，抑制腦損傷[15]。綠原酸(chlorogenic acid, CGA)在tMCAO大鼠模型中抑制大腦受損，增強學習能力和改善空間記憶。此外，CGA以劑量依賴性方式促進腦源性神經生長因子(BDNF)和神經生長因子(NGF)的表達，減輕I/R誘導的神經損傷。此外，CGA增加SOD活性和GSH水平，降低ROS和MDA的生成。值得注意的是，CGA減輕氧化應激誘導的腦損傷和細胞凋亡，并抑制凋亡相關蛋白(caspase-3和caspase-9)的表達。此外，CGA促進Nrf2、NQO-1和HO-1的表達。Nrf2途徑抑制劑ML385減弱CGA對腦損傷的抑制作用，表明CGA通過Nrf2通過發(fā)揮其抗氧化和凋亡作用[16]。綜上所述，多酚類化合物在tMCAO模型中具有激活Nrf2通路，發(fā)揮抑制缺血性腦損傷作用。

3.3 中草藥提取物

作為中藥閉苞買麻藤提取物主要成分的異丹葉大黃素(isorhapontigenin，ISO)治療顯著改善神經功能評分，減少梗死體積、壞死神經元，減少ROS產生、4-羥基壬烯醛加合物(4-HNE)和8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine, 8-OHDG)水平。同時，ISO顯著增加Nrf2和HO-1的表達。而敲除Nrf2和HO-1能夠抵消ISO的神經保護作用，此外，蛋白激酶Cε(PKCε)基因的敲除阻斷了ISO誘導的核Nfr2和HO-1表達，因此，ISO具有抑制腦缺血再灌注損傷作用，其神經保護機制可能與PKCε/Nrf2/HO-1通路有關[17]。補骨脂(psoralea corylifolia)提取物補骨酯酚(bakuchiol, BAK)在tMCAO小鼠模型中，減輕小鼠的神經功能缺損，減少梗死體積、腦水腫和神經元損傷。BAK減少了腦內 Iba1(ionized calcium binding adapter molecule 1)免疫反應細胞的數量，表明小膠質細胞的激活減少。BAK還降低了NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的表達，BAK促進Nrf2在細胞核內聚集和HO-1水平的升高，表明BAK通過激活Nrf2信號通路、抑制NLRP3介導的炎性反應從而抑制缺血性腦損傷[18]。二分生褐藻提取物氫青石烯二萜 (hydroazulene diterpenes, HDD)在tMCAO大鼠模型中通過激活Nrf2/ARE通路發(fā)揮神經保護作用[19]。丁苯酞(L-3-n-butylphthalide, L-NBP)作為治療急性腦梗死的藥物，其可通過激活Nrf2/HIF-1α/VEGF信號通路，改善大腦微循環(huán)和促進腦血管新生[20]。 研究首次證明枸杞提取物狼毒甲素(lyciumamide A, LyA)通過激活PKCε/Nrf2/HO-1通路，抑制氧化損傷和神經元凋亡，從而抑制I/R誘導的腦損傷[21]?？傊?，中草藥提取物在tMCAO模型中具有激活Nrf2通路，發(fā)揮抑制缺血性腦損傷的作用。

3.4 萜類化合物

羽扇豆醇(lupeol)可顯著減少tMCAO大鼠的腦梗死體積和含水量，并恢復神經行為功能，下調氧化應激和炎性因子的表達，激活Nrf2，抑制caspase-3活性，降低BAX/Bcl-2比率，抑制p38 MAPK的磷酸化，總結其可能通過激活Nrf2和抑制細胞凋亡途徑來抑制氧化應激和炎性因子生成，從而抑制腦缺血損傷[22]。

綜上所述，近2年來研究顯示黃酮類化合物、多酚類化合物、中草藥提取物和萜類化合物等均具有激活Nrf2/ARE通路的作用，進而在tMCAO實驗性動物模型中發(fā)揮抗氧化、抗凋亡、抗神經炎性反應等藥理學作用，進而發(fā)揮它們對缺血性腦損傷的抑制作用。

4 問題與展望

植物源性活性化合物具有抗氧化作用，通過激活Nrf2信號在缺血性卒中實驗模型中具有神經保護作用。不同的天然化合物由于其誘導Nrf2激活的能力不同，從而使包括HO-1和NQO1在內的抗氧化酶表達增加以及降低氧化應激標記，從而在實驗性tMCAO模型中表現出有益的作用。不同生物活性化合物激活Nrf2調節(jié)不同途徑，通過活化PI3K/Akt、MAPK和NF-κB等磷酸化激活Nfr2，進而上調保護基因表達，抑制缺血性腦損傷。目前作為Nrf2激活劑之一的多靶點天然化合物在腦缺血中的具體神經保護機制還有待于深入研究。鑒于Nrf2/ARE激動劑丁苯酞和依達拉奉通過激活Nrf2對急性缺血性卒中具有治療作用，提示探索靶向Nrf2/ARE通路的藥物治療缺血性卒中的臨床試驗研究值得進一步探索?？傊?，本文表明，植物源性天然化合物作為Nrf2激活劑，有望成為治療缺血性卒中新的潛在藥物。