李艷，李子雯，李利民，汪夢霞，張鵬，吳正治*

(1.深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院 深圳市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，廣東 深圳 518035；2.深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所，廣東 深圳 518020)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是以高血糖和胰島素抵抗為主要病理特征的疾病。通常認為是一種侵襲性疾病，疾病的進展常常導(dǎo)致心血管疾病、微血管并發(fā)癥、腎病、視網(wǎng)膜病變及神經(jīng)病變等多項并發(fā)癥風(fēng)險飆升[1]。研究數(shù)據(jù)顯示全球范圍內(nèi)T2DM的發(fā)病率在不斷上升，到2030年全球糖尿病人數(shù)預(yù)計增長到5.11億人，而到2045年糖尿病人數(shù)將躍升至7億人[2]。。

中醫(yī)藥治療復(fù)雜疾病具有安全、低毒、高效等獨特優(yōu)勢[3-4]。中醫(yī)學(xué)將糖尿病歸屬于“消渴”的范疇，認為消渴的基本病機為陰津虧損，燥熱內(nèi)生[5]?！端貑枴て娌≌摗分惺状纬霈F(xiàn)“消渴”之名，曰：“脾癉……此人必數(shù)食甘美而多肥也，肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴?！毕什∽兊牟课恢饕c五臟有關(guān)，尤以肺、胃(脾)和腎為關(guān)鍵。肺的宣發(fā)肅降功能，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中胰島素促進肝外胰島素敏感組織的血糖代謝作用相似。中醫(yī)臨床中有運用“瀉肺”法來治療消渴病，多以清肺熱、滋肺陰為主[6]。桑白皮為?？浦参锷orusalbaL.的干燥根皮，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性寒，入肺經(jīng)，具有瀉肺平喘、利水消腫的功效[7-8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明桑白皮具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗糖尿病以及神經(jīng)保護作用等[9-12]。仝小林教授認為，桑葉、桑白皮和桑枝分別散中上焦、肺胃和四旁經(jīng)絡(luò)及皮腠之火，其中桑白皮有“小白虎湯”之美譽，三味藥臨床上均具有明確的降糖療效[13-14]。陳春光[15]研究發(fā)現(xiàn)桑白皮煮水代茶飲能夠有效降低糖尿病患者的血糖、減少胰島素使用劑量。目前臨床應(yīng)用桑白皮及其復(fù)方治療T2DM及其并發(fā)癥有較好的療效[16]，但其詳細的作用機制尚不明確。

近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被廣泛用于中醫(yī)藥治療復(fù)雜疾病的機制研究中，如新型冠狀病毒肺炎、癌癥、心腦血管疾病等[17-18]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將藥物、化合物、靶點、疾病之間的連接形成網(wǎng)絡(luò)，從整體考慮了藥物之間的相互作用，實現(xiàn)了多組分、多靶點網(wǎng)絡(luò)的新模式。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測桑白皮治療T2DM的活性化合物、潛在的蛋白靶點和通路，同時通過分子對接從受體與配體方面驗證桑白皮活性成分干預(yù)T2DM關(guān)鍵靶點的有效性，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 桑白皮活性成分的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database andanalysis platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)以“桑白皮”為關(guān)鍵詞，檢索其所有活性成分。參考文獻[18]方法，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件，進一步獲得桑白皮的主要活性成分。

1.2 桑白皮活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對桑白皮的主要活性成分進行靶點預(yù)測，得到所有活性成分對應(yīng)的靶點，并利用UniProt(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫篩選出人源(Home sapiens(Human))靶蛋白，再將靶蛋白轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的靶基因，最終得到桑白皮所有靶點的基因名稱。然后采用Cytoscape 3.6.1軟件，導(dǎo)入上述獲得的活性成分及靶點關(guān)系，構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 T2DM疾病靶點與桑白皮共同靶點的獲取

使用疾病數(shù)據(jù)庫DrugBank(https://go.drugbank.com/)、GeneCards(https://www.genecards.org /)和TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)，通過輸入關(guān)鍵詞“Type 2 diabetes”，得到疾病的相關(guān)靶點。經(jīng)過去除重復(fù)、獲得2型糖尿病的相關(guān)靶點。通過維恩分析，得到桑白皮治療T2DM的潛在作用靶點，構(gòu)建活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過STRING數(shù)據(jù)庫分析桑白皮治療T2DM潛在作用靶點間的相互作用，研究物種設(shè)置為人類，從而獲取靶點蛋白之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction ，PPI)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。再將其TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，并使用cyto Hubba插件對網(wǎng)絡(luò)進行分析，計算度值(degree)，最終獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖，其網(wǎng)絡(luò)圖由內(nèi)而外度值依次減小，顏色由深及淺。

1.5 GO和KEGG通路富集分析

Matascape網(wǎng)站(http://metascape.org)集成了四十多個生物信息數(shù)據(jù)庫，在內(nèi)容上包含了生物通路分析、PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析以及豐富的基因注釋功能，讓生物學(xué)家輕松獲得全面的數(shù)據(jù)解析。將桑白皮治療2型糖尿病的潛在靶點基因輸入Matascape功能注釋工具中，選定物種(H.sapiens)，進行基因本體(gene ontology，GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，得到并保存結(jié)果。其中P值Cutoff為0.01，并使用 Banjamini-Hochberg方法進行P值校正。根據(jù)P值大小進行排序，繪制條形圖和氣泡圖，分析藥物治療疾病的可能機制。

1.6 活性成分-關(guān)鍵靶點分子對接驗證

從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載化合物(槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、鳶尾甲黃素B和光果甘草酮)2D結(jié)構(gòu)的mol2格式文件，即小分子配體。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中保存AKT1，IL-6、VEGFA，CASP3靶點的3D結(jié)構(gòu)PDB格式，即蛋白受體；用Autodock tools處理小分子和靶點蛋白，并生成pdbqt格式文件。通過AutoDock vina軟件驗證化合物與靶蛋白之間的親和力和結(jié)合模式，分析了100次對接結(jié)果并選擇最低能量打分進一步分析，應(yīng)用Pymol軟件繪制靶點蛋白受體和活性成分之間的結(jié)合模式圖。

2 結(jié)果

2.1 桑白皮的活性成分及活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜集桑白皮中的化學(xué)成分共194個，篩選得到活性成分31個。通過對上述活性成分進行作用靶點預(yù)測，發(fā)現(xiàn)有6個成分未找到對應(yīng)靶點，刪除重復(fù)靶點后，則25種成分共獲得預(yù)測靶點191個。根據(jù)OB大小進行排序，前10位主要活性成分及靶點數(shù)目見表1(全表OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1)。

研究建立了一個各個節(jié)點密切聯(lián)系的活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖1)，該網(wǎng)絡(luò)圖由217個節(jié)點和454條邊線組成。通過Network Aanlysis對每個節(jié)點進行分析，得到網(wǎng)絡(luò)圖中各個節(jié)點的度值。在活性成分中度值越大，表示該活性成分對應(yīng)的靶點數(shù)目越多；而在靶點中度值越大，表示能與該靶點發(fā)生作用的活性成分越多。通過分析結(jié)果可以看出，度值最高的活性成分為槲皮素(S20)，對應(yīng)的靶點有153個，其次為山奈酚(S24)、β-谷甾醇(S13)、鳶尾甲黃素B(S14)、光果甘草酮(S19)，對應(yīng)的靶點個數(shù)分別為62、37、21和20個。通過表1與圖1共同體現(xiàn)了桑白皮具有多活性成分、多作用靶點、各藥物之間具有豐富共同作用靶點、可協(xié)同發(fā)揮治療疾病作用的藥理學(xué)特點。

表1 桑白皮的主要活性成分及靶點數(shù)目Table 1 Active ingredients and number of targets of Mori Cortex

圖1 桑白皮活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Active ingredient-target network of Mori Cortex

2.2 桑白皮治療T2DM潛在靶點的篩選

應(yīng)用DrugBank、GeneCards和TTD數(shù)據(jù)庫檢索T2DM的疾病靶點，合并所獲得的靶點并刪除重復(fù)、整合后，共得到2 147個疾病靶點。將疾病相關(guān)靶點與桑白皮的預(yù)測靶點取交集后，共得到126個潛在靶點，主要包括PTGS2、AR、PTGS1、ESR1、PRSS1、PPARG等。通過Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。該圖中包含節(jié)點149個，邊線286條。提示桑白皮治療T2DM的作用機制可能與這126個潛在靶點有關(guān)。

圖2 桑白皮活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Active ingredient-potential target network of Mori Cortex

2.3 潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將桑白皮治療T2DM的126個潛在靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫獲取PPI關(guān)系，再導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制PPI圖(圖3)。該圖中包含126個節(jié)點，2 364條邊，平均節(jié)點度值為37.5。該網(wǎng)絡(luò)圖由內(nèi)而外度值依次減小，顏色由深及淺，其中度值大于37.5的靶點有58個，前10位見表2(全表見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表2)。度值大小排名前10位的靶點分別為AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、TP53、CASP3、JUN、MAPK1、EGF、MMP9。推測這10個靶點為桑白皮治療T2DM的關(guān)鍵靶點。

表2 桑白皮部分潛在靶點信息(度值大于37.5)Table 2 Information of potential targets of Mori Cortex(degree>37.5)

圖3 桑白皮治療T2DM的關(guān)鍵靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of key targets of Mori Cortex in the treatment of T2DM

2.4 潛在靶點的GO功能及KEGG通路富集分析

對桑白皮治療T2DM的潛在靶點進行GO分析和KEGG通路富集分析，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1。GO分析主要從基因的生物學(xué)過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3個方面提供了詳細的基因功能注釋。通過分析可知，BP主要涉及對脂多糖、細菌起源分子、無機物質(zhì)、有毒物質(zhì)、脂質(zhì)的反應(yīng)等；CC主要涉及膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)等；MF主要涉及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、酶結(jié)合等。KEGG通路分析表明，桑白皮治療T2DM涉及的通路主要包括AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、癌癥通路、流體切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、乙型肝炎、IL-17信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、內(nèi)分泌抵抗、PI3K-Akt信號通路等，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2。

2.5 桑白皮活性成分和關(guān)鍵靶點分子對接驗證

將篩選得到的桑白皮活性成分與其關(guān)鍵蛋白使用AutoDock軟件進行分子對接驗證，以直觀的方式展示了成分的最佳構(gòu)型和關(guān)鍵靶點之間的相互作用。對接結(jié)果如表3所示，分子與靶點蛋白的最低結(jié)合能均不超過-23.43 kJ/mol，表現(xiàn)出較強的結(jié)合活性。其中槲皮素與AKT1的結(jié)合能最低，而光果甘草酮與IL-6、VEGFA、CASP3的結(jié)合能最低，分別為-31.80、-29.71、-35.15 kJ/mol。2D與3D結(jié)合模式顯示，槲皮素與AKT1蛋白結(jié)合時，

表3 桑白皮活性成分與關(guān)鍵靶點分子對接分數(shù)Table 3 Molecular docking fraction of core active ingredients and key targets of Mori Cortex

通過AKT1的Trp80結(jié)構(gòu)上的苯環(huán)與底物的共軛結(jié)構(gòu)之間的π-π相互作用，以及這種共軛結(jié)構(gòu)與一些極性氨基酸之間的超共軛效應(yīng)相互作用，較好地結(jié)合在了AKT1的活性中心。此外，槲皮素與AKT1復(fù)合物活性位點中的許多殘基相互作用形成了氫鍵網(wǎng)絡(luò)。如羥基上氫的化學(xué)結(jié)構(gòu)與一些容易形成氫鍵的氨基酸(分別為Gln 79、Ser 205、Thr 211和Tyr 272)形成氫鍵相互作用，起到關(guān)鍵作用。光果甘草酮與IL-6蛋白結(jié)合時，結(jié)合到了由Glu100、Lys121、Gln125、Gln128、Asn145、Ala146這些提供范德瓦耳斯力的氨基酸的口袋中，Leu93、Glu96、Val97、Ile124、Pro142提供疏水作用力,Thr139與glabrone形成了3.3 ?的氫鍵。光果甘草酮與VEGFA蛋白結(jié)合時，光果甘草酮結(jié)合到了由Asp34、Ile35、Glu42、Ile46、Phe47、Ser50這些提供范德瓦耳斯力的氨基酸的口袋中，Phe36、Ile43、Pro85提供疏水作用力,與Tyr45形成了2.8 ?的氫鍵。光果甘草酮與CASP3蛋白結(jié)合時，主要是通過范德瓦耳斯力與疏水作用力結(jié)合在Casp3的口袋中，Arg64、Ser120、His121、Ala162、Ser205、Ser213、Ser251、Asp253提供范德瓦耳斯力，Cys163、Trp206、Arg207、Phe256提供疏水作用力。槲皮素、光果甘草酮與AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3的分子對接可視化結(jié)果見圖4。

圖4 槲皮素、光果甘草酮與AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3的分子對接可視化結(jié)果Fig.4 Visual results of molecular docking of quercetin and glabrone with AKT1, IL-6, VEGFA and CASP3

3 討論

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法初步探討了桑白皮治療T2DM的作用機制，篩選其活性成分、作用靶點及相關(guān)生物學(xué)通路，為臨床“從肺論治消渴”提供科學(xué)依據(jù)。預(yù)測得到桑白皮有效活性成分25個，藥物-疾病交集靶點126個，借助PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選到10個較為重要的靶點AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、TP53、CASP3、JUN、MAPK1、EGF、MMP9。GO分析主要涉及細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、對脂質(zhì)的反應(yīng)和凋亡信號通路等生物過程；KEGG通路分析主要涉及AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、癌癥通路、流體切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、內(nèi)分泌抵抗、PI3K-Akt等信號通路。

研究表明，AKT1參與細胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細胞過程，與糖尿病、腫瘤、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19-20]。T2DM可能是細胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，IL-6、TNF在T2DM患者體內(nèi)顯著升高，進而可導(dǎo)致胰島素分泌功能障礙的發(fā)生[21]。細胞周期與凋亡蛋白CASP3，腫瘤相關(guān)基因如TP53、MAPK1和MMP9等也在肥胖、糖尿病等疾病中發(fā)揮重要作用[22-23]。此外，AGE-RAGE信號通路可激活下游核轉(zhuǎn)錄因子(NF-KB)，刺激產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，在糖尿病腎病、糖尿病足、糖尿病周圍神經(jīng)病變等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[24]。PI3K-Akt信號通路是胰島素的主要下游分子通路，其表達下降在糖尿病和胰島素抵抗發(fā)病機制中起重要作用[25-26]。

桑白皮活性成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、鳶尾甲黃素B、光果甘草酮等可能通過PI3K-Akt、TNF等相關(guān)信號通路作用于AKT、IL-6、TNF等靶點而起到抗T2DM作用。現(xiàn)代研究表明，槲皮素是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化等作用，可治療糖尿病及糖尿病腎病、糖尿病性周圍神經(jīng)病變等多種并發(fā)癥[27-28]。張煜敏等[27]研究表明槲皮素可通過激活A(yù)KT/FOXO3信號通路減少糖尿病大鼠心肌細胞凋亡。山奈酚可通過上調(diào)骨骼肌PI3K-AKT-GLUT4信號通路，改善自發(fā)型T2DMKKAy小鼠的胰島素抵抗[29]。β-谷甾醇可通過下調(diào)炎癥因子TNF-a和IL-6水平改善急性肺損傷[30]。鳶尾甲黃素B是肝臟X受體(LXR)調(diào)節(jié)劑，可增加巨噬細胞RAW264.7中ABCA1和ABCG1的表達，從而調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)[31]。光果甘草酮是一種異黃酮，具有抗流感活性和顯著的PPAR-γ配體結(jié)合活性[32]。作為天然的異戊烯基黃酮類化合物，桑辛素A、B、C、D等一系列化合物也表現(xiàn)出顯著的抗癌、抗氧化等生理活性[33]。Guo等[34]研究發(fā)現(xiàn)桑辛素M可通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。在分子對接方面，山奈酚、β-谷甾醇、鳶尾甲黃素B和光果甘草酮與AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3均具有較好的結(jié)合活性，其中光果甘草酮與對應(yīng)靶點的結(jié)合能最低。

綜上所述，根據(jù)中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，本文初步闡述了桑白皮治療T2DM的潛在活性成分、可能作用靶點及信號通路。由于光果甘草酮對T2DM的基礎(chǔ)研究甚少，未來將對其進行分子生物學(xué)和體內(nèi)體外實驗驗證，為光果甘草酮的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。