越南伯克霍爾德氏菌B418的紅色熒光蛋白標記及功能穩(wěn)定性

劉敏敏，吳遠征，扈進冬，李紀順，王燕，楊合同,*

(1. 齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 生物工程學院，山東 濟南 250353； 2. 齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 山東省科學院生態(tài)研究所 山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250103)

熒光蛋白標記是指利用不同顏色的熒光蛋白或熒光蛋白基因作為標記物，連接到蛋白、核酸等生物分子上，構建攜帶有熒光且不影響生物正常生理活性的一種標記方法[1-2]。熒光蛋白作為基因表達的報告基因、細胞發(fā)育過程中的外源標記以及活細胞體內蛋白的定位標簽，已經廣泛應用于生物大分子的遺傳檢測和示蹤侵染，具有操作簡便、非放射性、穩(wěn)定性高、靈敏度高和選擇性好等特點[3-5]。常用的熒光蛋白主要包括綠色、黃色和紅色等3種顏色，其中綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)最初從維多利亞多管發(fā)光水母Aequoreavictoria中分離，發(fā)射光譜一般在440～529 nm；黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)是GFP的一種突變體，由203位蘇氨酸突變?yōu)槔野彼幔l(fā)射波長為527 nm；紅色熒光蛋白DsRed首先發(fā)現于珊瑚屬海葵Discosomastriata，發(fā)射光譜更長，大多在560～610 nm[6]。DsRed與GFP在氨基酸水平上僅有23%的相似性，但二者的三級結構十分相似[7]。

熒光蛋白標記靶標微生物在植病生防領域展現出巨大的應用潛力，可用于植物病原菌的侵染、生防菌的定殖與互作、致病基因的表達檢測及抗性植株的構建篩選等[8-9]。Wang等[10]將綠色熒光蛋白GFPuv連接到廣宿主質粒pDSK上，構建了穩(wěn)定、宿主范圍廣、高表達的質粒載體pDSK-GFPuv，并轉化丁香假單胞菌，熒光觀察標記后的病原菌能夠實時監(jiān)測細菌在宿主煙草葉面的侵染、定位和活性以及整個植物水平上的細菌病害發(fā)展。田兆豐等[11]將綠色熒光蛋白質粒pGFP4412電擊轉入枯草芽孢桿菌Kct99，獲得穩(wěn)定遺傳的熒光標記菌株gfp-Kct99，對甘藍枯萎病的防治效果可達到90%以上，發(fā)現gfp-Kct99在作物根部定殖并占領一定的生態(tài)位點和空間，從而更有效地防止病害的發(fā)生。王亞嬌等[12]采用PEG-CaCl2介導的原生質體轉化體系將紅色熒光蛋白基因DsRed轉入到列當的生防菌株Br-2中，共聚焦顯微鏡觀察表明Br-2-DsRed能夠侵染寄生植物-分枝列當的莖部表皮、厚壁細胞及維管束細胞內部，并導致莖部腐爛，而不會侵染番茄根尖內部。Villarino等[13]在弧菌啟動子gpdA的驅動下利用sGFP和DsRed分別標記紅青霉PO212，標記菌株的生長速率、形態(tài)培養(yǎng)及生防功效均未受影響，熒光觀察顯示兩種質粒轉化的PO212在番茄根尖定殖而不侵入根內組織。

越南伯克霍爾德氏菌BurkholderiavietnamiensisB418(菌種保藏號CGMCC No.1212)是本課題組從大麥根際土壤中分離到的一株多功能生防細菌，該菌株具有固氮、解磷、解鉀、促進植物生長及防治真菌和線蟲病害的作用，已作為生物農藥和生物肥料推廣應用于農業(yè)生產上[14-15]。前期田間試驗表明，施用B418菌株對番茄根結線蟲病的防治效率為63.42%，對茄子根結線蟲病的防治效率為75.60%[16]。室內毒力測定結果顯示，B418菌株發(fā)酵上清液對南方根結線蟲2齡幼蟲的6 h校正死亡率達70%以上，對次級代謝物的分離鑒定表明，其發(fā)酵液中含有cyclo(L-Pro-L-Leu)、cyclo(L-Pro-L-Phe)等多種環(huán)二肽[17]。此外，B418菌株還能分泌兒茶酚型鐵載體，競爭螯合土壤中的鐵元素，表現出顯著的殺線蟲活性。本研究擬利用紅色熒光蛋白DsRed轉化標記B418菌株，檢測熒光標記菌株的功能穩(wěn)定性，為探究B418菌株在植物根際的定殖及其與病原菌的互作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

越南伯克霍爾德氏菌BurkholderiavietnamiensisB418、尖孢鐮孢菌Fusariumoxysporum和大麗輪枝菌Verticilliumdahliae均為本實驗室保存；大腸桿菌E.coliJM109購自天根生化科技(北京)有限公司。質粒pCMV-C-DsRed和pGEX-4T-1購自武漢淼靈生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

溶菌肉湯(Luria-Bertani,LB)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，無菌水1 L，pH 7.2～7.4，固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂粉。胰蛋白胨酵母粉(tryptone yeast extract,TY)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉1 g，CaCl20.2 g，無菌水1 L，pH 7.2～7.4，固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂粉。B418專用固體培養(yǎng)基：K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.02 g，CaCl20.2 g，NaMoO4·2H2O 0.002 g，EDTA-FeNa 0.006 g，谷氨酸鈉0.05 g，葡萄糖5 g，瓊脂粉15 g，無菌水1 L，pH 7.2～7.4。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，無菌水1 L，pH自然?？股兀喊逼S青霉素，工作質量濃度100 μg/mL。

1.1.3 試劑

氨基納米黏土參考文獻[18]所述由本實驗室合成。DNA marker、Premix TaqTM、限制性內切酶及T4 DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司。質粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。引物合成、序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pGEX-4T-1-DsRed的構建

以含紅色熒光蛋白DsRed的質粒pCMV-C-DsRed為模板，采用DsRed的特異性引物P1(5′-CGCGGATCCATGGACAACACCGAG-3′)和P2(5′-CCGGAATTCCTGGGAGCCGGAGTG-3′)進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增，反應參數為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，52 ℃梯度退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產物電泳后采用凝膠回收試劑盒回收目的片段，并進行序列測定。

將回收后的DsRed片段和高拷貝表達載體pGEX-4T-1分別用限制性內切酶BamHI和EcoRI雙酶切，回收線性化載體片段；載體pGEX-4T-1與DsRed片段按摩爾比1∶3的比例混合，加入T4 DNA連接酶，于16 ℃連接過夜后采用熱擊法轉化E.coliJM109感受態(tài)細胞，在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取篩選陽性克隆子，提取質粒，通過雙酶切和PCR擴增鑒定重組質粒pGEX-4T-1-DsRed。

1.2.2 氨基納米黏土介導轉化B418菌株

參考文獻[18]的方法利用氨基納米黏土介導將重組質粒pGEX-4T-1-DsRed導入B418菌株中。按照文獻所述合成納米黏土，用滅菌雙蒸水配置100 mg/mL納米黏土溶液，加入重組質粒pGEX-4T-1-DsRed至150 ng/mL制備納米黏土-質?；旌弦?。將B418菌株接種到TY液體培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)至對數期，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。在1.5 mL微量離心管中分別加入500 μL B418菌懸液和等體積納米黏土-質?；旌弦海瑴u旋震蕩30 s，取200 μL涂布含氨芐青霉素的B418固體培養(yǎng)基平板，30 ℃倒置培養(yǎng)16～24 h，挑取篩選陽性轉化子，并將標記菌株命名為B418-DsRed。

1.2.3 標記菌株的熒光顯微觀察

用接種環(huán)挑取抗性平板上的單菌落涂布于載玻片上，置于奧林巴斯Fluoview FV3000型激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，激發(fā)光波長558 nm，發(fā)射光波長583 nm，觀察菌體能否在綠光下激發(fā)紅色熒光。

1.2.4 標記菌株生長曲線的測定

將標記菌株B418-DsRed的單菌落接種于含5 mL TY液體培養(yǎng)基的試管中，于30 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h，按1%的接種量接種到裝有100 mL TY培養(yǎng)基的三角瓶中，于30 ℃下180 r/min搖床培養(yǎng)。以野生菌株B418為對照，每2 h取菌液1 mL，測定其OD600值，記錄數據并繪制二者的生長曲線。

1.2.5 標記菌株遺傳穩(wěn)定性的測定

過夜活化標記菌株B418-DsRed，以0.1%接種于無抗生素的TY培養(yǎng)液中，于30 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，取樣再以0.1%接種無抗生素TY培養(yǎng)液于同樣條件培養(yǎng)，如此重復轉接10代，最后涂布于無抗生素TY平板，隨機選取200個克隆轉入含抗生素的平板，以抗性菌株百分比計算工程菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.6 標記菌株抑菌能力的測定

采用平板對峙培養(yǎng)法測定標記菌株的抑菌能力：用無菌打孔器將PDA平板上培養(yǎng)的尖孢鐮孢菌和大麗輪枝菌打成直徑5 mm的菌塊，將菌塊轉接到PDA平板中央；在距病原菌塊1.5 cm處放置滅菌的濾紙片(直徑0.5 cm)，分別滴加10 μL活化培養(yǎng)的標記菌株B418-DsRed和野生菌株B418，各處理重復3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，至朝向濾紙片方向的病原菌菌落不再生長時(其他方向繼續(xù)生長)，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，計算抑菌率。

1.3 數據分析

采用Excel 2013和SPSS 16.0軟件對試驗數據進行分析并作圖，應用Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pGEX-4T-1-DsRed在大腸桿菌中的表達

通過PCR擴增從哺乳動物細胞表達質粒pCMV-C-DsRed中得到DsRed片段，凝膠回收后測序未發(fā)現堿基突變。將DsRed片段和表達載體pGEX-4T-1分別用BamHI和EcoRI雙酶切、連接，轉化JM109，提取質粒，雙酶切檢測獲得了約4.9 kb質粒和0.7 kb片段(圖1(a))，PCR擴增也有明顯的0.7 kb條帶(圖1(b))，表明重組質粒pGEX-4T-1-DsRed構建成功。轉化后的大腸桿菌在激光共聚焦顯微鏡下觀察到很強的紅色熒光(圖2)，表明重組質粒在大腸桿菌中得到了高效表達。

注：M1為1 kb DNA Marker; A1為BamHI和EcoRI雙酶切; A2為EcoRI單酶切； M2為100 bp DNA Marker; B1～B5為陽性克隆子PCR產物; B6為陰性對照。圖1 重組質粒pGEX-4T-1-DsRed的酶切及PCR鑒定Fig.1 Electrophoresis of digested plasmid pGEX-4T-1-DsRed and PCR amplification of DsRed fragment

圖2 大腸桿菌轉化菌株的熒光觀察結果Fig.2 Fluorescent observation of transmitted E.coli JM109 labeled with DsRed

2.2 DsRed標記伯克霍爾德氏菌B418的形態(tài)及熒光觀察

為提高越南伯克霍爾德氏菌的轉化效率，采用氨基納米黏土介導的轉化方法將重組質粒pGEX-4T-1-DsRed轉入B418菌株中。帶有陽離子電荷的氨基納米黏土能夠附著于細菌細胞表面，在外加摩擦力的作用下納米黏土刺穿細胞壁，將DNA分子攜帶轉移到細菌細胞內。將渦旋震蕩后的菌體與納米黏土混合液涂布抗性培養(yǎng)基，篩選得到菌落形態(tài)與原始菌株B418相似但顏色略帶暗紅色的菌落。轉化后的陽性菌株置于激光共聚焦顯微鏡下，可以觀察到清晰明亮的有紅色熒光的菌體(圖3)，表明熒光蛋白DsRed在B418菌株中標記成功并獲表達。

圖3 伯克霍爾德氏菌B418標記菌株的熒光觀察結果Fig.3 Fluorescent observation of transmitted Burkholderia vietnamiensis B418 labeled with DsRed

2.3 標記菌株B418-DsRed的生長曲線

標記菌株B418-DsRed和野生菌株B418的生長趨勢基本相同，生長曲線基本重合(圖4)。菌株接種初期生長比較緩慢，在培養(yǎng)8～30 h為對數生長期，30～48 h為穩(wěn)定期，48 h后進入衰亡期，表明野生菌株B418進行紅色熒光蛋白標記后，外源質粒pGEX-4T-1-DsRed的存在和紅色熒光蛋白的表達對B418菌株的生長無明顯影響。

圖4 標記菌株B418-DsRed和野生菌株B418的生長曲線Fig.4 The growth curve of wild strain B418 and labeled strain B418-DsRed

圖5 標記菌株B418-DsRed質粒穩(wěn)定性Fig.5 Stability of labeled strain B418-DsRed

2.4 標記菌株B418-DsRed中質粒的遺傳穩(wěn)定性

標記菌株B418-DsRed連續(xù)稀釋培養(yǎng)的試驗結果表明，在本試驗條件下連續(xù)繼代培養(yǎng)10次后抗生素抗性菌株所占百分比達91.2%(圖5)，說明重組質粒pGEX-4T-1-DsRed在B418菌株體內可以穩(wěn)定地完成遺傳復制。伯克霍爾德氏菌在實驗室適宜條件下約20 min分裂一代，在自然條件下分裂一代所需時間為50～100 h，因此標記菌株B418-DsRed的質粒穩(wěn)定性能夠滿足一般作物特定生育期甚至一年生作物全生育期研究的需要。

2.5 標記菌株B418-DsRed對病原菌的抑菌能力

采用平板對峙培養(yǎng)試驗測定標記前后菌株對尖孢鐮孢菌和大麗輪枝菌的抑菌能力，標記菌株B418-DsRed對2種病原菌的抑菌率分別為55.25%和67.55%，野生菌株B418分別為58.32%和66.47%(表1)，二者間無顯著性差異，說明標記后的菌株抑菌能力穩(wěn)定，即重組質粒pGEX-4T-1-DsRed的導入并未影響其抑菌能力，依然具有很強的生防功能。

表1 標記菌株B418-DsRed和野生菌株B418對病原菌的抑菌能力Table 1 Inhibition rates of labeled strain B418-DsRed and wild strain B418 against Fusarium oxysporum and Verticillium dahliae

3 討論

熒光蛋白標記技術作為快速高效的研究工具，在生防微生物定殖、微生物與環(huán)境及宿主相互作用研究等方面展示出良好的應用前景。作為生物標記的一種形式，表達性質粒標記菌株的應用已成為生物學研究方法的重要組成。本研究利用氨基納米黏土介導的轉化方法對越南伯克霍爾德氏菌B418進行了DsRed熒光標記，并對標記菌株B418-DsRed的功能穩(wěn)定性開展了研究。

其次，驗證了標記菌株B418-DsRed的生長速率及拮抗活性與野生型菌株相比無顯著差異，而且質粒的遺傳穩(wěn)定性較好，說明外源質粒并未影響其生理功能與生防特性的發(fā)揮，外源質粒在細菌體內的穩(wěn)定性是影響其功能表達的重要因素[21]。外源熒光蛋白的導入可能會對轉化菌株造成額外的代謝負擔，進而影響轉化菌株的功能與特性，導致轉化菌株在自然界中與其他微生物生存競爭時處于不利地位[22]。因此，轉化完成后對轉化菌株穩(wěn)定性的評估至關重要。本研究為進一步闡明該生防菌在植物體及其根際的定殖及與病原菌在土壤環(huán)境中的互作奠定了基礎。