本氏煙草中異源合成抗癌藥物葫蘆素前體

郭兆寬，王益娜，李志遠(yuǎn)，馮孝林，陳 庚，舒彥宇，張廣輝，郝 冰，楊生超*

1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南昆明 650201；3.云南特色植物提取實驗室，云南昆明，650106

葫蘆素（cucurbitacins）是一類以葫蘆烷為骨架的四環(huán)三萜類化合物，主要存在于葫蘆科植物中[1]，具有顯著的抗癌活性[2-5]。葫蘆科植物羅漢果（Siraitia grosvenori）中的一些葫蘆烷糖苷（羅漢果苷）有很強的甜味，是糖尿病患者的潛在糖類替代品[6]。解析葫蘆素和葫蘆烷糖苷的生物合成途徑，對于瓜類作物育種、葫蘆素單體和羅漢果苷的生物合成具有重要意義。

葫蘆素與絕大多數(shù)植物三萜類化合物相似，植物體內(nèi)的三萜化合物骨架的生物合成始于甲羥戊酸途徑，代謝途徑是以乙酰輔酶A（acetyl-CoA）為起始原料合成異戊二烯焦磷酸（IPP）和二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）。這類代謝產(chǎn)物在一系列催化酶的催化作用下形成 2,3-氧化角鯊烯（2,3-oxidosqualene），即四環(huán)三萜化合物的前體物質(zhì)（圖1）。通常情況下大多數(shù)四環(huán)三萜化合物的基本碳骨架都由一類氧化鯊烯環(huán)化酶家族催化2,3-氧化角鯊烯的船式或椅式構(gòu)象形成[7]。研究表明，葫蘆素生物合成起始于 2,3-氧化鯊烯環(huán)化形成的葫蘆二烯醇（Cuol），是由氧化鯊烯環(huán)化酶（OSCs）家族的葫蘆二烯醇合酶（CBS）催化[8-10]。在大多數(shù)情況下，OSC催化形成的四環(huán)三萜骨架在細(xì)胞色素P450的催化下，通過引入羥基、羧基進(jìn)行特定部位的氧化修飾，從而衍生出更多的終產(chǎn)物和中間體。前人研究發(fā)現(xiàn)甜瓜中葫蘆素B和西瓜中葫蘆素E的多功能CYP87D20連續(xù)不斷地催化Cuol的C11氧化和C20位羥化，形成11-羰基-20β-羥基-Cuol（11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol），接下來CYP81Q59催化其C2位的β羥化，形成11-羰基-2,20β-二羥基-Cuol[8-9]（11-carbonyl-2,20β-dihydroxy-Cuol）（圖1）。

圖1 葫蘆素中間體的生物合成路徑Fig.1 Biosynthetic pathway of cucurbitacin intermediates

雪膽中的雪膽素（包括葫蘆素 IIa和葫蘆素IIb）屬于典型的葫蘆素F（cucubitacin F），其葫蘆烷型骨架的 C3-羥基為 α型（圖2）[10]，這是葫蘆素F的典型結(jié)構(gòu)特點之一。同時葫蘆素F與其他葫蘆素結(jié)構(gòu)中有許多相同修飾基團(tuán)，比如葫蘆素B（cucubitacin B）和E（cucubitacin E）的C11氧化，C20位羥化以及C2位的β羥化與葫蘆素F共性；葫蘆素B、E與F在C25位羥基化修飾后，然后再?；?，還有C22的酮基化和C16的 α-羥基化。因此，亟待解析雪膽葫蘆素 B、E和F生物合成途徑過程以及挖掘其他CYP450基因，推進(jìn)葫蘆素全合成尤為重要。

圖2 葫蘆素F分子結(jié)構(gòu)（A）和六年生雪膽塊莖（B）Fig.2 Molecular structure of cucurbitacin F (A) and six-year-old Hemsleya chinensis Cogn.tuber (B)

葫蘆素這類化合物高度被氧化，在植物中的含量較低同時其利用也受到限制，提取純化工藝復(fù)雜且耗時，需投入大量的人力、物力等資源，如前人曾從375 kg黃瓜葉片中分離到480 mg缺乙酰基葫蘆素 C，用于體外實驗來研究葫蘆素生物合成的關(guān)鍵酶基因功能，巨大的材料投入和工作量令人望而生畏[11]。目前，相關(guān)藥物的開發(fā)中，主要通過從植物中提取的方式來制備。要實現(xiàn)對葫蘆素的化學(xué)合成仍存在諸多挑戰(zhàn)，特別是葫蘆素關(guān)鍵中間體化合物。隨著合成生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展，為葫蘆素中間體高效異源合成提供了新的契機，農(nóng)桿菌滲入法（agro-infiltration）即根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導(dǎo)的瞬時表達(dá)是一種高效的生產(chǎn)植物三萜的合成生物平臺[12-14]，也是一種快速鑒定和發(fā)現(xiàn)三萜生物合成相關(guān)基因并驗證功能的有效方法[15-18]。本研究嘗試將前期鑒定的雪膽（Hemsleya chinensisCogn.）的CBS同源基因（HcOSC6）和HcCYP87D20基因表達(dá)于本氏煙草（Nicotiana benthamiana）中，獲得葫蘆素生物合成中間體11-羰基-20β-羥基-葫蘆二烯醇，本研究結(jié)果將為葫蘆素B、E、F的合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料和菌種 本氏煙草種子由本實驗室保存。攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因的質(zhì)粒pAN580（pAN580-GFP）購自武漢天問生物科技有限公司。瞬時表達(dá)載體pEAQ-HT-DEST1由東北林業(yè)大學(xué)薛哲勇教授惠贈。大腸桿菌 DH5α、根癌農(nóng)桿菌菌株 GV3101、EHA105和 LAB4404感受態(tài)細(xì)胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器與試劑 RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技有限公司（北京），Q5?High-Fidelity DNA Polymerase購自NEB有限公司，EasyPure Quick Gel Extraction Kit，2×EasTaqPCR Mix 購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸（MES)、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）購自昆明傲雪商貿(mào)有限公司，Gateway entry clone（ALH328）試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。

凝膠成像系統(tǒng)儀（Protein Simple）；帶有藍(lán)色激發(fā)光的 LSM710共聚焦激光顯微鏡（Carl Zeiss, Inc., Jena，德國）；NanoReady超微量紫外可見分光光度計，安捷倫1260高效液相色譜儀，真空滲透儀（DGG-9000B系列），氮吹儀（MD200-1A）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)煙草 本氏煙草種子用 2%次氯酸鈉表面消毒后，播種于1/2MS培養(yǎng)基上。待出芽后，室溫放置1~2 d，移栽到填充腐殖土的蔬菜育苗穴盤上。置于人工氣候室（25℃，相對濕度80%，18 h光照，6 h黑暗），生長5周后用于農(nóng)桿菌滲入。

1.2.2 載體構(gòu)建 為快速判斷外源基因是否在本氏煙草葉片中表達(dá)及細(xì)胞中的表達(dá)部位，構(gòu)建了攜帶GFP基因的pEAQ-HT-DEST1-GFP載體，同時以pAN580-GFP載體[19]作為外源基因表達(dá)的亞細(xì)胞定位的陽性對照。利用引物GFP-F和GFP-R，從pAN580-GFP上擴增出GFP的編碼序列并克隆雪膽的HcOSC6和HcCYP87D20基因。前人研究表明，截短的 3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶 A還原酶基因（tHMGR）與 β-香樹脂醇（SAD1）和CYP51H10共表達(dá)，能夠顯著提高煙草瞬時表達(dá)系統(tǒng)的三萜產(chǎn)量[12]，因此也克隆了糙伏毛燕麥（Avena strigosa）HMGR基因（GenBank登錄號：KY284573）截短的417個核苷酸的部分（tHMGR）。

將擴增到的GFP、HcOSC6、HcCYP87D20和tHMGR基因切膠回收，使用 Gateway entry clone試劑盒BP克隆酶II混合物（Invitrogen）將膠回收產(chǎn)物克隆到pDONR207載體中。所構(gòu)建體均在 Entry載體中測序，以驗證克隆的完整性，根據(jù)制造商的說明，使用 LR克隆酶 II將相關(guān)的Entry載體中的基因克隆到pEAQ-HT-DEST1中。構(gòu)建成功的 pEAQ-HT-DEST1-GFP、pEAQ-HTDEST1-HcOSC6、pEAQ-HT-DEST1-HcCYP87D20和 pEAQ-HT-DEST1-tHMGR重組質(zhì)粒以及載體pAN580-GFP通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞里。

1.2.3 本氏煙草的農(nóng)桿菌滲入 挑取構(gòu)建好的工程菌單菌落在添加LB（50 mg/mL Kan+ 50 mg/mL Rif）液體培養(yǎng)基中，28℃ 220 r/min培養(yǎng)24 h。從中吸取200 μL加入含有上述新鮮培養(yǎng)基50 mL中，繼代培養(yǎng)至OD600達(dá)2.0左右時以5000 r/min離心5 min，收集菌體，用含10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES和100 μmol/L乙酰丁香酮的緩沖液重懸菌體，于 250 mL配置成不同濃度菌液（OD600分別為 0.4、0.6、0.8、1.0），放置在滲透槽中，將整株煙草浸沒在農(nóng)桿菌液中，在不同真空壓力（40、60、80、100 kPa），以5周齡的煙草作為植物材料，真空滲透時間為 3 min，4 d后采收煙草葉片，取 100 mg煙草葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并稀釋至200 ng/μL，以此為模板進(jìn)行半定量PCR以評價各因素對轉(zhuǎn)化效率的影響。半定量PCR使用編碼GFP基因上的特異引物P-GFP-F和P-GFP-R，使用延伸因子1a（EF1a）[20]作為煙草內(nèi)參基因，使用 Image J軟件對核酸凝膠GFP目的條帶進(jìn)行灰度值分析。使用特異性引物見表1。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.4 煙草中的葫蘆二烯醇的提取分析 溫室培養(yǎng)4 d后收獲煙草葉片，提取代謝物進(jìn)行GC-MS分析。取1.0 g干燥葉片于液氮中冷凍后研磨成細(xì)粉，用5 mL正己烷重復(fù)提取3次，37℃下孵育1 h，之后超聲提取20 min。再用正己烷∶乙酸乙酯混合液（4∶1,V/V）提取一次，提取物短暫渦旋后以5000 r/min離心10 min，取60 μL上清液到玻璃小瓶中，用氮吹儀吹干濃縮。濃縮的提取物置于玻璃小瓶中，加40 μL三甲基甲硅烷基氰化物（TMSCN）衍生化。加入TMSCN后，將樣品轉(zhuǎn)移到MPS的攪拌器中，并在40℃下孵育40 min。衍生化后的干燥樣品重懸于200 μL萃取溶劑中，即用 1 mL正己烷重新溶解，然后吸取每個樣品1 μL直接進(jìn)樣到ISQ型質(zhì)譜聯(lián)用的GC超氣相色譜儀安捷倫中檢測。以不分流模式（脈沖壓力30 psi）注入1 μL樣品（進(jìn)樣口250℃），該程序涉及2 min的柱箱溫度170℃，以20℃/min的速度升至300℃。在300℃下保持11.5 min。溶劑延遲8 min后，以掃描模式（60~800質(zhì)量單位）進(jìn)行檢測。使用MassHunter工作站（Agilent）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 HPLC檢測方法 測定定量葫蘆二烯醇的含量，在不同濃度下分別注入配好的葫蘆二烯醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用 Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm, 2.7 μm）色譜柱，流動相為2%純水（A），98%乙腈溶液（B），等度洗脫 0~26 min，98% B；檢測波長為200 nm，進(jìn)樣體積10 μL，流速0.8 mL/min，柱溫為40℃。以5個濃度不同的對照品為橫坐標(biāo)，所對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于含量測定。

1.2.6 UPLC-ESI-qTOF-MS 分析 11-羰基-20β-羥基-Cuol 取 200 mg煙草葉片于液氮中冷凍后研磨成細(xì)粉，用1 mL乙酸乙酯重復(fù)提取3次，37℃下孵育1 h，合并萃取液，用氮吹儀濃縮干。濃縮物加入200 μL色譜甲醇溶解，并用0.22 μm微孔濾膜過濾，然后采用UPLC-ESI-qTOF-MS（Agilent 1290，四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜Agilent 6540）進(jìn)行檢測，檢測條件：色譜柱Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×100 mm, 2.7 μm），進(jìn)樣量 2 μL，流速0.8 mL/min。流動相是0.1%甲酸（A相）和乙腈（B相），采用線性梯度洗脫程序，時間及B相的比例如下：0 min，30%；16 min，100%；23 min，100%；28 min，100%。質(zhì)譜條件：離子源采用是正離子模式，氣體溫度 350℃，噴霧電壓500 V；碎裂電壓140 V；錐孔電壓60 V；射頻電壓750 V，掃描范圍50~1000m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌瞬時表達(dá)體系的構(gòu)建

攜帶pEAQ-HT-DEST1-GFP載體和pAN580-GFP農(nóng)桿菌菌液，在OD600=0.8，真空壓力80 kPa條件下，農(nóng)桿菌滲入5周齡煙草幼苗，96 h后激光共聚焦顯微鏡觀察葉片中報告基因GFP的表達(dá)部位。發(fā)現(xiàn)2個載體農(nóng)桿菌菌液滲入處理后，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜中均能觀察到GFP的表達(dá)（圖3），表明構(gòu)建的pEAQ-HT-DEST1-GFP瞬時表達(dá)載體在煙草葉片中穩(wěn)定工作。

圖3 重組表達(dá)載體滲入后煙草葉片后GFP的表達(dá)情況Fig.3 GFP expression in tobacco leaves after infection with recombinant expression vector

研究發(fā)現(xiàn)，攜帶pEAQ-HT-DEST1-GFP載體的不同農(nóng)桿菌菌株（GV3101、EHA105和LBA4404）滲入煙草后，GFP表達(dá)量均在處理后第4天達(dá)到最高，而且EHA105滲入植株的GFP表達(dá)量最高（圖4A），說明EHA105是最適宜瞬時轉(zhuǎn)化的菌株，而外源基因在滲入后第4天表達(dá)最高，然后表達(dá)下降。EHA105滲入本氏煙草的GFP表達(dá)效果（圖4B）。比較不同濃度（OD600為0.4、0.6、0.8、1.0）的農(nóng)桿菌EHA105菌液滲入效果，農(nóng)桿菌滲透液濃度OD600=0.8時，GFP的表達(dá)效率最高（圖4C）；比較不同的真空滲透壓力（40~100 kPa）發(fā)現(xiàn)，真空壓力為80 kPa時，GFP的表達(dá)效率最高，達(dá)到80%（圖4D）。

圖4 農(nóng)桿菌滲入的不同因素對GFP瞬時表達(dá)效率的影響Fig.4 Effects of different factors of agro-infiltration on transient expression efficiency of GFP

2.2 瞬時表達(dá)產(chǎn)物葫蘆二烯醇的GC-MS鑒定

提取瞬時表達(dá) pEAQ-HT-DEST1-HcOSC6的本氏煙草葉片，進(jìn)行 GC-MS分析，采用 HPLC法測定其含量。在煙草葉片提取物出現(xiàn)新的分子離子峰 21.18 min（圖5A），與葫蘆二烯醇標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間一致，且分子峰碎片吻合（圖5C，圖5D），確定該峰為葫蘆二烯醇。對照組中pEAQ-HT-DEST1-GFP滲透的煙草提取物中未發(fā)現(xiàn)葫蘆二烯醇峰。由HPLC定量分析葫蘆二烯醇（圖5B），繪制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=1663.56953X-21.224813，r=0.98567；Y為峰面積，X為葫蘆二烯醇含量），測定葫蘆二烯醇含量為2.832 mg/g（干重），當(dāng)pEAQ-HT-DEST1-HcOSC6和pEAQHT-DEST1-tHMGR在煙草共滲透時，葫蘆二烯醇含量達(dá)到9.48 mg/g（干重），提高了234.75%，實現(xiàn)了葫蘆二烯醇在本氏煙草中的高效生產(chǎn)。

圖5 煙草中葫蘆二烯醇產(chǎn)物的GC-MS和HPLC分析Fig.5 GC-MS and HPLC analysis of cucurbitadienol tobacco products

2.3 11-羰基-20β-羥基-Cuol在本氏煙草中異源合成

由于農(nóng)桿菌滲入法能夠共表達(dá)多個目的基因，異源合成不同單體化合物，而無需逐步構(gòu)建多個不同表達(dá)載體。大多數(shù)的 CYP450氧化酶在催化過程中都需要還原蛋白（CPR）的參與，利用本氏煙草本身的特性，一方面評估了農(nóng)桿菌滲入本氏煙草內(nèi)表達(dá) CYP450氧化酶的潛力，另一方面在煙草中驗證雪膽參與葫蘆素生物合成的CYP同源基因HcCYP87D20。結(jié)果顯示，在tHMGR、HcOSC6和HcCYP87D20共滲入煙草葉片中，在22.75 min提取出1個特異代謝產(chǎn)物（m/z457.3746 [M+H]+）（圖6A），與 11-羰基-20β-羥基-Cuol標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間一致，且質(zhì)譜圖一致（圖6B）。空白對照組 pEAQ-HT-DEST1-GFP滲透的煙草中未發(fā)現(xiàn)11-羰基-20β-羥基-Cuol。

圖6 Hc87D20在本氏煙草表達(dá)11-羰基-20β-羥基-Cuol產(chǎn)物的LC-qTOF-MS分析Fig.6 LC-qTOF-MS analysis of 11-carbonyl-20β-hydroxyl-Cuol products expressed by Hc87D20 in N.benthamiana

3 討論

隨著合成生物學(xué)領(lǐng)域的飛速發(fā)展，已闡明越來越多的天然藥物的生物合成途經(jīng)并實現(xiàn)高效異源合成，煙草作為重要的植物異源生產(chǎn)平臺受到人們的廣泛關(guān)注。目前，新冠肺炎COVID-19抗原已在煙草中實現(xiàn)了高效生產(chǎn)，用于制備新冠疫苗。農(nóng)桿菌滲入本氏煙草為高效、快速表達(dá)疫苗抗原或單體藥物提供了一個新的平臺，然而，如何提高植物體內(nèi)蛋白質(zhì)和單體化合物產(chǎn)量是目前農(nóng)桿菌滲入研究的重點和難點之一[21]。為了最大限度地提高基因表達(dá)水平，研究人員試圖在多個水平上優(yōu)化該過程，例如通過提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化率和改造特定載體包含增加轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄，翻譯衍生的元件[22]。農(nóng)桿菌的遺傳背景極大地影響植物病原體T-DNA轉(zhuǎn)移載體的能力。因此，本研究測試了3種常見的農(nóng)桿菌攜帶pEAQ-HT-DEST1-GFP載體在本氏煙草中的GFP表達(dá)的能力，高活力菌株EHA105在4 d時GFP表達(dá)量最高，與其他2種菌株相比，EHA105可能更有效地編碼農(nóng)桿菌T-DNA轉(zhuǎn)運。農(nóng)桿菌滲入過程中的菌滲透液濃度會影響基因表達(dá)效率，過于稀釋的菌滲透液可能會導(dǎo)致農(nóng)桿菌細(xì)胞比例降低，從而降低外源基因表達(dá)效率，而濃度大的菌滲透液會導(dǎo)致農(nóng)桿菌過度生長并損傷煙草葉片組織，影響本氏煙草細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄或翻譯能力，進(jìn)而影響外源基因的表達(dá)效率[23-24]。此外，通過比較不同真空滲透壓力發(fā)現(xiàn)，真空滲透壓力過低，農(nóng)桿菌不能有效地滲入，壓力過高可能嚴(yán)重影響植物的生理狀態(tài)。因此，本研究通過測試不同的農(nóng)桿菌滲透條件，探索最佳的滲透條件以期為下一步的基因異源表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

目前，葫蘆素B、E和F的生物合成尚未報道，本研究選擇了特異性地含有葫蘆素F的雪膽為研究對象，同時葫蘆素F與其他葫蘆素結(jié)構(gòu)有許多相同修飾基團(tuán)。本研究在本氏煙草驗證雪膽的HcCYP87D20基因，以葫蘆二烯醇為底物下連續(xù)催化C11位和C20位生成了11-羰基-20β-羥基-Cuol，但葫蘆素F依然有多個位點的氧化修飾機理和基因未知，特別是C-22酮基和C-16α羥基位點等[8,25]。C-22酮基是所有葫蘆素分子的另一共同結(jié)構(gòu)特征，酮基一般為羥基氧化而來。目前報道的CYP90B家族催化C-22位羥化，例如參與油菜素內(nèi)酯生物合成的DWF4基因（CYP90B1），能夠催化菜油甾醇或 6-oxo-菜油甾醇的 C-22羥化[26-27]，在北美山藜蘆（Veratrum californicum）甾體生物堿環(huán)巴胺的生物合成中，CYP90B27則編碼膽固醇 22-羥化酶，催化膽固醇轉(zhuǎn)化為22(R)-OH-膽固醇，CYP90G1能夠轉(zhuǎn)化22-OH-22-氨基-膽固醇為 22-酮基-22-氨基-膽固醇[28]。催化C-16α羥基方面，目前已報道有兩類基因可以催化形成三萜類化合物的 C-16α羥化。一類屬于CYP基因，分別是CYP716Y1和CYP716A141，編碼C16α-羥化酶，能夠催化香樹脂骨架的C-16α羥化[25]；一類是馬鈴薯（Solanum tuberosum）2-酮戊二酸依賴型加雙氧酶（2-ODD，St16-DOX），編碼類固醇 16α-羥化酶催化(22S)-22,26-二羥基膽固醇的 C-16α-羥化[26]。

在本研究中，將雪膽CBS基因（HcOSC6）、截短的燕麥tHMGR和HcCYP87D20共滲入煙草葉片中表達(dá)，雖然UPLC-ESI-qTOF-MS檢測到了11-羰基-20β-羥基-Cuol，但未檢測到 11-羰基-Cuol，這可能是CYP87D20氧化酶催化效率低，導(dǎo)致 11-羰基-20β-羥基-Cuol前提物質(zhì) 11-羰基-Cuol不足，因此，下一步將利用酶工程手段提高CYP87D20活性，提高細(xì)胞色素P450氧化酶的催化效率，以實現(xiàn)葫蘆素植物工廠的高效生產(chǎn)。

4 結(jié)論

本研究將pEAQ-HT-DEST1-GFP與pAN580-GFP載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中滲透本氏煙草，確定在煙草細(xì)胞內(nèi)定位結(jié)果一致。將雪膽CBS基因（HcOSC6）與截短的燕麥tHMGR共表達(dá)，不斷優(yōu)化煙草共表達(dá)體系，將煙草葉片中的葫蘆二烯醇產(chǎn)量從2.832 mg/g（干重）提高到9.48 mg/g（干重）。同時，將雪膽的HcCYP87D20共滲入煙草葉片，獲得了葫蘆素生物合成的重要中間體11-羰基-20β-羥基-Cuol，實現(xiàn)了葫蘆素中間體在本氏煙草中的異源生產(chǎn)，為葫蘆素的生物合成奠定了堅實的基礎(chǔ)。