胡伊力格其，白小紅，白梅榮，包文雙，胡和珠拉，拉喜那木吉拉

(1.內(nèi)蒙古民族大學 蒙醫(yī)藥學院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古民族大學 蒙醫(yī)藥研發(fā)工程教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)發(fā)病發(fā)展主要涉及免疫、環(huán)境、炎癥因子、腸道菌群等多方面因素[1-2].本病在臨床上具有高致殘率、高復(fù)發(fā)率、服藥周期長等特點[3]，多見于中年女性[4]，RA發(fā)病機制復(fù)雜，尚無特效治療，該病有“不死癌癥”之稱[5].目前RA主要用糖皮質(zhì)激素和非甾體類等西藥治療[6]，西藥治療雖然見效快，可有效消除其疼痛和炎癥，服用方便，但毒副作用較大，且無法根治，對于病人來說治療價格偏高.隨著對RA發(fā)病機制的深入研究及蒙醫(yī)藥現(xiàn)代化的長久發(fā)展，從蒙醫(yī)藥寶庫中尋找高校、低毒的抗RA藥物具有重要意義.

瑞香狼毒是逐水殺粘、治癰消腫蒙藥，為瑞香科植物瑞香狼毒(StellerachamaejasmeL.)的干燥根，具有味苦、辛、性澀、動、輕、平等藥性[7].研究發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒主要含有萜類、木脂素類和黃酮類及香豆素類成分[8-9]，有顯著的藥理活性.本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學和動物實驗相結(jié)合的方法，探討瑞香狼毒治療RA的作用機制，為蒙藥治療RA提供科學依據(jù).

1 材料

1.1 方劑、藥物與儀器

瑞香狼毒(批號20170629)，亳州市宏大中藥飲片科技有限公司；雷公藤多苷片(批號20200502)，遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司；Freunds完全佐劑(批號SLCC7169)，美國sigma公司；水合氯醛(150330)內(nèi)蒙古古道科技有限公司；蘇木素-伊紅染液(20220316)，南京建成科技有限公司;TNF-a(JM-01587R2)、IL-6(JM-01597R2)、IL-1β(JM-01454R2)，內(nèi)蒙古古道科技有限公司.

足趾容積測量儀(PV-200)，成都泰盟科技有限公司;臺式高速離心機(TG16-WS)，長沙湘鑫儀器儀表有限公司;恒溫水浴鍋(HH-8)，常州榮華儀器制造有限公司;電子天平(SOP)，賽多利斯科學儀器北京有限公司;超聲波(KQ5200DE)，昆山市超聲儀器有限公司;酶標儀(SUNRISE)，中國上海貿(mào)易有限公司;自動組織脫水機(TP-1020)，上海新振儀器設(shè)備有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9246A)，上海精宏試驗設(shè)備有限公司;顯微鏡(LU-N4)，日本NKON公司;生物組織包埋機(KD-BM)，金華市科迪儀器設(shè)備有限公司.

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學數(shù)據(jù)庫及軟件

表1為網(wǎng)絡(luò)藥理學數(shù)據(jù)庫及軟件.

表1 網(wǎng)絡(luò)藥理學數(shù)據(jù)庫及軟件

1.3 實驗動物

SD大鼠，210～250 g，9周齡，SPF級，雄性，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，批號：SCXK(遼)2020-0001.動物飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院動物實驗室(室內(nèi)溫度20～25 ℃，濕度40%～60%)，動物實驗倫理批件號：NM-LL-2019-01-06-5.

1.4 瑞香狼毒醇提取物的制備

取15 g瑞香狼毒粉碎物放入20 L圓底燒瓶中，加1.5 L體積分數(shù)95% 乙醇浸泡12 h.第2天加熱回流提取，第1次加熱回流4 h，取上清液備用.第2次在上述藥渣中再加入1.5 L體積分數(shù)95%乙醇加熱回流2 h，取上清液備用.第3次在上述藥渣中加1.5 L體積分數(shù)95%乙醇加熱回流2 h，取上清液，把3次取的上清液合并一起，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮回收乙醇，干燥即為瑞香狼毒醇提物，冷藏備用.使用前用純水配制成不同濃度的瑞香狼毒乙醇提取物混懸液.

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學方法

2.1.1 瑞香狼毒有效成分的篩選及預(yù)測化學成分作用靶點

通過中藥系統(tǒng)藥理學TCMSP、PubMed數(shù)據(jù)庫，中藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID)及相關(guān)文獻報道補充，整合收集瑞香狼毒的化學成分.通過Swiss Target Predictio、Uniprot數(shù)據(jù)庫預(yù)測化學成分的作用靶點.

2.1.2 瑞香狼毒疾病靶點收集

以“Rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞，使用OMIM(https://omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)及PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)疾病數(shù)據(jù)庫，整合收集RA相關(guān)靶點.

2.1.3 瑞香狼毒治療RA作用的靶點(交集靶點)

使用Cytoscape 3.6.1 軟件，分別對瑞香狼毒成分靶點與RA疾病靶點進行相交分析，篩選出瑞香狼毒治療RA之間相互交集的靶點.

2.1.4 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用STRING 數(shù)據(jù)庫軟件，輸入交集靶點，獲取人類靶蛋白相互作用的數(shù)據(jù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將數(shù)據(jù)運用Cytoscape 3.6.1 軟件進行分析，獲取核心靶點，構(gòu)建“瑞香狼毒藥材-有效成分-核心靶點-RA”網(wǎng)絡(luò).

2.1.5 GO功能及KEGG通路富集分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫軟件，對獲取的交集靶點進行GO富集和KEGG靶點通路富集，分析瑞香狼毒RA主要相關(guān)通路及生物過程.

2.2 動物實驗方法

2.2.1 動物分組、造模與給藥

取SD大鼠48只，隨機分6組，每組8只.除空白對照組以外，各組大鼠第1天、第7天及第14天，用0.1 mL弗氏完全佐劑注射大鼠右后足趾皮下致炎，在致炎前1 h測1次兩側(cè)后足趾容積值，致炎后每3 d測1次.第8天開始陽性對照組給雷公藤多苷片12.86 mg/kg，瑞香狼毒乙醇提取物高、中、低劑量組分別灌胃32.97、16.49、8.24 g/kg，除空白和模型以外各組連續(xù)給藥21 d，末次給藥后2 h，腹主動脈取血，將血樣靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，收集血清在-80 ℃冰箱里保存?zhèn)溆?

2.2.2 觀察指標與檢測方法

1)足趾腫脹度和HE染色及組織病理學方法

足趾腫脹度：各組大鼠造模前、后1 h測量其后足趾腫脹度.給藥組和陽性組日給藥1次，空白組和模型組日給生理鹽水1次.每3 d測1次大鼠后足趾腫脹度.每次連續(xù)測3次，算出平均值再把足趾腫脹進行統(tǒng)計學比較.

HE染色及組織病理學：末次給藥后，用質(zhì)量分數(shù)10%水合氯醛麻醉，取滑膜組織固定在體積分數(shù)10%甲醛溶液24 h，體積分數(shù)30%甲酸浸泡42 h脫鈣，梯度脫水，后浸泡至二甲苯中，用石蠟包埋后，切成厚約4 μm切片，完成脫蠟后用蘇木精-伊紅進行染色，在顯微鏡觀察損傷程度及炎性細胞浸潤情況，最后進行組織學分析.

2)LISA檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平

將備用的血清進行溶解，按照ELISA試劑盒說明書分別檢測TNF-α、IL-6、IL-1β等細胞因子含量.

2.2.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料用均數(shù)±標準差(x±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用SNK-q進行事后檢驗.P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義.

安康市位于陜西省東南部，屬國務(wù)院公布的全國14個連片特困地區(qū)之一——秦巴山區(qū)核心地帶，脫貧攻堅任務(wù)十分艱巨［1］；呈貧困體量大、貧困程度深、脫貧難度大特點。為實現(xiàn)2020年脫貧的目標，安康市各級政府統(tǒng)籌部署，攻堅克難，目前已經(jīng)取得了顯著的成效：貧困人口數(shù)量逐步減少，貧困農(nóng)村落后的基礎(chǔ)設(shè)施得到改善，貧困農(nóng)民的生活水平有了明顯提高和改善。然而，課題組成員2016—2018年在安康市多個貧困村調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，當?shù)剞r(nóng)村還存在一個棘手難題，即已達婚齡的男青年婚戀越來越困難，具體表現(xiàn)在三個方面：一是可婚配的女青年少；二是婚姻支付昂貴；三是婚姻極不穩(wěn)定。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)果

3.1.1 瑞香狼毒潛在活性成分

通過TCMSP、PubMed、中藥綜合數(shù)據(jù)庫TCMID及相關(guān)文獻報道補充，整合收集瑞香狼毒的化學成分共60個.由數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到631個靶點.使用Cytoscape 3.6.1軟件繪制“藥材-成分網(wǎng)絡(luò)圖”.結(jié)果見圖1.

圖1 藥材-成分網(wǎng)絡(luò)

3.1.2 瑞香狼毒的疾病靶點收集

通過Swiss Target Prediction及 Uniprot 數(shù)據(jù)庫，整合3個疾病數(shù)據(jù)庫，刪除重復(fù)靶點，共得5 017個與RA有關(guān)的疾病靶點.

3.1.3 瑞香狼毒治療RA靶點

將成分靶點與疾病靶點進行相交，得出380個交集靶點，即瑞香狼毒治療RA的作用靶點.結(jié)果見圖2.

圖2 成分靶點與疾病靶點交集靶點

3.1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

3.1.5 核心靶點分析結(jié)果

Cytoscape 3.6.1 軟件進行分析，得到核心靶點 84個，構(gòu)建“瑞香狼毒藥材-有效成分-核心靶點-RA”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4.

圖4 藥材-有效成分-核心靶點-RA網(wǎng)絡(luò)

3.1.6. GO功能及KEGG通路富集分析

3.1.6.1 GO功能分析 通過DAVID對380 個交集靶點進行GO 富集的分析得到 165條蛋白質(zhì)的分子功能，83條細胞組分，713條生物學反應(yīng)，對GO富集的每個條目根據(jù)所含靶點數(shù)進行排序，GO富集的前20條結(jié)果進行可視化呈現(xiàn).結(jié)果見圖5和表2.

表2 主要通絡(luò)排序

BP.生物信息處理過程；CC.細胞分析；MF.分子功能

3.1.6.2 KEEG通路富集分析 通過DAVID對380個交集靶點進行KEGG 靶點通路注釋分析，最終得到121條KEGG信號通路，利用Omicshare 平臺，對KEGG富集的每個條目根據(jù)所含靶點數(shù)(count)進行排序，結(jié)果見圖6.

圖6 KEGG的前20條結(jié)果可視化呈現(xiàn)

3.2 動物實驗結(jié)果

3.2.1 模型復(fù)制結(jié)果評價及各組大鼠給藥前后足趾腫脹度

與正常組比較：第7天加強造模后模型組足趾腫脹度明顯增加(P<0.01).與模型組比較：給藥組大鼠的足趾腫脹度明顯下降(P<0.01)，其中高劑量組消腫最明顯，提示蒙藥瑞香狼毒具有抗炎、消腫及治療RA疾病的作用.結(jié)果見圖7.

圖7 大鼠足趾腫脹度對比

3.2.2 HE染色及組織病理學比較

通過HE染色及組織病理學比較發(fā)現(xiàn):正常組滑膜關(guān)節(jié)腔內(nèi)被覆單層扁平細胞，滑膜下結(jié)締組織中未見炎性細胞浸潤.RA模型組中的滑膜細胞增殖肥大，呈現(xiàn)多層、少許絨毛狀突出等炎性細胞浸潤，毛細血管數(shù)量增多.相比之下，給藥組關(guān)節(jié)腔改變并不顯著，但滑膜細胞亦增殖肥大明顯，而滑膜細胞增殖情況顯著好于模型組，結(jié)締組織內(nèi)浸潤的炎性細胞數(shù)量少，甚至僅見到個別淋巴細胞，毛細血管的數(shù)量也明顯少于模型組.結(jié)果見圖8～9.

a.正常組；b.模型組；c.陽性組；d.高劑量組；e.中劑量組；f.低劑量組

a.正常組；b.模型組；c.陽性組；d.高劑量組；e.中劑量組；f.低劑量組

3.2.3 瑞香狼毒對RA模型大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的影響

與正常組比較，模型組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05)；與模型組比較，瑞香狼毒高劑量組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)，瑞香狼毒中劑量組血清中TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05).瑞香狼毒低劑量組TNF-α水平表達降低(P<0.05).陽性對照組TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05).見表3.

表3 瑞香狼毒對RA大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響

4 討論

RA屬于全身性炎癥性疑難病，其發(fā)病機制尚未明確.瑞香狼毒為臨床常用蒙藥，其化學成分諸多，具有抗氧化[10-11]、抑菌[12-13]、殺蟲[14-16]、抗癲癇和抗驚厥[17-18]、抗腫瘤[19-22]、抗炎[23-24]、鎮(zhèn)痛[25]、免疫調(diào)節(jié)[26]、抑制破骨細胞活性和促進成骨細胞增殖[27]等作用.瑞香狼毒治療RA療效確切，但其作用機制不清.本研究進行了網(wǎng)絡(luò)藥理學分析及動物實驗驗證，探索瑞香狼毒發(fā)揮抗RA作用分子機制，以期為瑞香狼毒臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).

研究顯示，瑞香狼毒能夠顯著降低RA模型大鼠足趾腫脹度.通過HE染色及組織病理學比較發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒具有較好的抗滑膜炎癥作用.網(wǎng)絡(luò)藥理學研究中共篩選出60個主要活性成分，得出380個與瑞香狼毒相關(guān)交集靶點和84個核心靶點.KEGG富集分析結(jié)果表明，瑞香狼毒抗RA主要與PI3K-AKT、MAPK和TNF信號通路相關(guān).而ERK、JNK 和p38等為MAPK重要亞族，如LPS刺激激活后作用于各自的底物-影響多種轉(zhuǎn)錄因子的活性-從而調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β、IL-6等多種細胞因子的基因表達[28].動物實驗結(jié)果表明，瑞香狼毒能夠顯著降低炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平.

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學及動物實驗的方法與技術(shù)，探索瑞香狼毒治療RA的可能作用機制，發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒治療RA可能與抑制炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平相關(guān).本研究為瑞香狼毒的抗RA作用機制研究提供了實驗數(shù)據(jù)參考.