二肽類代謝物生物學功能及分析方法研究進展

唐少冉，周煦婷，侯曉瑩，楊柳,3，許風國*，張培*

(1.中國藥科大學藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009;2.江漢大學醫(yī)學院，武漢生物醫(yī)學研究院，湖北 武漢 430056;3.江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇 南京 210009)

二肽由兩個氨基酸分子通過肽鍵連接形成，平均分子量約260 Da。二肽組成簡單但結(jié)構(gòu)多樣，僅20個構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本α-氨基酸就可組成400個二肽。除此之外，體內(nèi)尚有多達數(shù)百種非必需氨基酸亦可作為二肽的組成單元?，F(xiàn)有研究認為，人體內(nèi)的二肽類代謝物主要來源于膳食攝入后的蛋白質(zhì)消化吸收和內(nèi)源性蛋白降解，廣泛存在于體液、細胞和組織等生物樣本中[1-2]。此外，體內(nèi)還有一部分二肽由兩分子游離氨基酸通過酶促反應(yīng)縮合而成[3-4]。二肽在體內(nèi)發(fā)揮著重要的營養(yǎng)學功能和生物學功能，近年來有研究報道，二肽還可作為肺癌、結(jié)腸癌和肝癌等疾病診斷和分型的潛生物標志物[5-7]。二肽是機體內(nèi)一類重要的內(nèi)源性小分子代謝物，分布廣泛、種類繁多、功能多樣，近年來逐步引起人們的關(guān)注。但同分異構(gòu)體多、濃度范圍廣、標準品缺乏也給二肽類代謝物的定性定量分析、生物學功能研究帶來巨大挑戰(zhàn)。

1 二肽的轉(zhuǎn)運吸收

1.1 吸收 人體內(nèi)二肽類代謝物主要來源于消化道吸收。過去研究認為，蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶促水解后，全部以氨基酸的形式被腸道吸收[8]。隨后的研究揭示，人體吸收蛋白質(zhì)的主要形式還包括寡肽，尤其是二肽和三肽，以寡肽形式的蛋白吸收率相比于氨基酸提高了2～2.5倍，這是人體胃腸道吸收蛋白質(zhì)機制研究的重大突破[9-11]。吸收進入細胞的二肽一部分被胞漿中的肽酶水解后形成游離氨基酸，用于細胞本身代謝合成或被基底側(cè)的氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)運至體循環(huán)；另一部分具有抗水解酶活性的二肽則可直接通過基底側(cè)的肽轉(zhuǎn)運體被完整地轉(zhuǎn)運至體循環(huán)，之后被血漿中的可溶性蛋白酶降解為氨基酸(見圖1)[12-14]。

1.2 轉(zhuǎn)運 寡肽轉(zhuǎn)運載體(POTs)家族中的PepT1(SLC15A1)、PepT2(SLC15A2)、PHT1(SLC15A4)和PHT2(SLC15A3)是目前已知的人體內(nèi)二肽類代謝物的轉(zhuǎn)運體。關(guān)于PepT1和PepT2研究較多，而對PHT1和PHT2研究則較少，其具體功能尚不清楚。PepT1是低親和力、高容量的肽載體，主要在小腸上皮細胞中表達。二肽通過PepT1穿過腸上皮，最終進入血液循環(huán)、器官及細胞組織，迅速發(fā)揮生理作用[15]。PepT2是高親和力、低容量的肽載體，主要在腎髓質(zhì)細胞和上皮細胞的刷狀緣膜側(cè)表達中表達，可以重吸收腎小球濾過的二肽[16-17]。二肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)主要是pH依賴性的H+-Na+交換轉(zhuǎn)運體系(見圖1)。在轉(zhuǎn)運過程中H+向細胞內(nèi)電化學質(zhì)子梯度供能，質(zhì)子向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運產(chǎn)生的動力驅(qū)使二肽以易化擴散的形式進入細胞，引起胞漿的pH值下降，進而活化Na+-H+通道，H+被釋放出細胞，細胞內(nèi)的pH恢復(fù)到初始水平[18]。除二肽轉(zhuǎn)運體外，一部分二肽可通過細胞旁途徑穿過腸上皮膜，直接通過上皮細胞之間的緊密連接(tight junctions)進入細胞間隙而被吸收[19]。研究發(fā)現(xiàn)，二肽轉(zhuǎn)運體更傾向于運輸帶有中性電荷的極性疏水二肽，而親水性、中性或帶負電荷、小分子量二肽則更易經(jīng)緊密連接的胞外通路運輸[12]。

圖1 二肽轉(zhuǎn)運吸收示意圖

2 二肽的生物學功能

2.1 營養(yǎng)調(diào)節(jié)作用 二肽與游離氨基酸的吸收分別依賴于各自的蛋白轉(zhuǎn)運體進行(見圖1)，既相互獨立又互為補充。吸收進入細胞的部分二肽可以水解成游離氨基酸，有助于減弱由于游離氨基酸之間相互競爭共同吸收位點而產(chǎn)生的拮抗作用，增加細胞內(nèi)氨基酸吸收量，加速蛋白質(zhì)合成，從而發(fā)揮營養(yǎng)調(diào)節(jié)作用。Paulussen等[20]研究了Leu-Leu攝入后對餐后肌肉蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)代謝的影響，Leu-Leu通過刺激人體中肌纖維蛋白質(zhì)的合成，從而提高血漿中Leu-Leu的濃度以及肌肉蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)率。Mantuano等[21]對Ala-Ala作為營養(yǎng)補充劑對骨骼肌萎縮的影響進行了研究，發(fā)現(xiàn)Ala-Ala可以增加支鏈氨基酸的生物利用度，改善肌肉萎縮。另有研究表明，添加Gln-Gln強化的腸外營養(yǎng)，可以改善重癥患者的預(yù)后，顯著降低重癥患者的感染率及住院時間[22]。

2.2 生理調(diào)節(jié)作用

2.2.1 促細胞增殖 已有研究揭示，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的某些二肽具有促細胞增殖的作用。成纖維細胞在傷口愈合中發(fā)揮重要作用，其能形成肉芽組織，合成胞外基質(zhì)化合物。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠皮膚傷口愈合處內(nèi)源性膠原蛋白降解可產(chǎn)生Pro-Hyp，Pro-Hyp能促進附著在膠原蛋白上的成纖維細胞的生長[23]。Hyp-Gly也被證實具有促成纖維細胞增殖的功能[24]。另外，Pro-Hyp還可以提高海馬內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子的基因表達，促進海馬神經(jīng)細胞增殖，從而發(fā)揮抗抑郁活性[25]。除上述來自膠原蛋白水解的含有Hyp的二肽外，Tyr-Gly也被證實具有促進人外周血淋巴細胞增殖的作用[26]。

2.2.2 抗炎活性 炎癥是生物組織受到某種刺激如外傷、感染等損傷因子的刺激所發(fā)生的一種以防御反應(yīng)為主的基本病理過程。一般情況下，炎癥是有益的，但過度炎癥反應(yīng)則會造成機體損傷，并且炎癥與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，多種二肽具有抗炎活性。Ano等[27]報道，口服Trp-Met可以抑制阿爾茨海默癥模型小鼠大腦炎癥反應(yīng)，推斷可能是Trp-Met口服后被輸送到大腦，通過抑制腦內(nèi)單胺氧化酶B的活性，從而抑制大腦中的炎癥反應(yīng)。Engevik等[28]報道，TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid solution)誘導的結(jié)腸炎小鼠灌胃給予γ-Glu-Cys后，組織中促炎細胞因子水平顯著降低，提示該二肽具有抗炎活性。El-Lekawy等[29]研究了Ala-Gly對胃潰瘍大鼠的作用效果，結(jié)果顯示Ala-Gly可以使NF-κB p65失活發(fā)揮其抗炎作用，從而促進胃潰瘍愈合。Cruzat等[30]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素血癥小鼠口服Ala-Gln后，體內(nèi)的谷氨酰胺的利用度顯著增強，證實Ala-Gln通過抑制NF-κB通路發(fā)揮抗炎作用。

2.2.3 神經(jīng)類活性 二肽可以作為神經(jīng)遞質(zhì)通過間接刺激腸道受體激素或酶的分泌而發(fā)揮作用。肌肽是一種組氨酸二肽，被認為可能是嗅覺受體神經(jīng)元中的一種的神經(jīng)遞質(zhì)[31-32]。研究發(fā)現(xiàn)，肌肽可以刺激下丘腦-垂體-腎上腺軸，從而發(fā)揮類似興奮劑樣作用[33]。Tyr-Trp可以增強去甲腎上腺素的合成和代謝，并可以改善由β-淀粉樣肽(25～35)所致小鼠學習記憶障礙[34]。此外，芳香二肽也具有神經(jīng)類活性，如 Tyr-Arg、Tyr-Leu、Phe-Leu 和Trp-Leu表現(xiàn)出較強的抗焦慮活性[8,35-36]。Tyr-Arg還具有鎮(zhèn)痛作用[35]，Tyr-Leu具有抗抑郁作用[37]。

2.2.4 降血壓活性 研究表明，從沙丁魚肌肉水解液中提取的二肽Val-Tyr、Val-Trp、Ile-Tyr和Ile-Trp均有降血壓作用[38-40]。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)[41]，Val-Tyr主要通過抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶發(fā)揮降血壓作用。

2.2.5 降血脂活性 Aldini等[42]發(fā)現(xiàn)肌肽具有顯著降血脂活性，能夠降低肥胖Zucker大鼠的肥胖相關(guān)疾病(高血脂、高血壓、糖尿病和肥胖性腎病等)的發(fā)生。也有研究表明，人體補充含組氨酸的二肽(如肌肽)可以降低脂肪量，減少中心性肥胖[43]，但是目前肌肽降脂機制尚不清楚。除肌肽外，Trp-Glu也被證實具有降脂作用，其可能機制是通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體-α增加細胞脂肪酸攝取，從而減少肝細胞中的肝脂積累[44]。

2.2.6 其他作用 除促細胞增殖、抗炎、神經(jīng)類活性、降血壓、降血脂外，二肽亦可發(fā)揮多種生物學功能。Matsui等[45]人研究發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白E基因敲除后動脈粥樣硬化小鼠口服Trp-His可有效減輕動脈粥樣硬化病變。Khedr等[46]報道，Trp-Leu可以通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子進而抗血管生成。Nakato等[47]篩選了具有調(diào)節(jié)胃饑餓素釋放的二肽代謝物，發(fā)現(xiàn)Leu-Ile和Ser-Val分別表現(xiàn)出最強的胃饑餓素釋放抑制和刺激作用，并且Leu-Ile降低了小鼠的血漿胃饑餓素水平，Ser-Val增加了小鼠攝食量(見表1)。

表1 二肽生物學功能匯總表

3 二肽類代謝物的分析

目前用于二肽類代謝物分析的儀器方法有氫核磁共振(1H-NMR)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)和毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)等均被報道。LC-MS將液相色譜的高效分離特性和質(zhì)譜的強大定性和定量優(yōu)勢有機結(jié)合，是目前二肽類物質(zhì)分析中最有潛力且應(yīng)用最多的分析手段[48]。但由于二肽類代謝物結(jié)構(gòu)的特殊性，LC-MS在二肽類代謝物高靈敏、寬覆蓋檢測上仍面臨巨大挑戰(zhàn)。首先，二肽類代謝物濃度范圍廣(fmol·L-1～mmol·L-1)[1,13,49]，一般質(zhì)譜的動態(tài)范圍難以滿足分析要求；其次，二肽類代謝物的組成單元中存在互為同分異構(gòu)體的氨基酸(亮氨酸與異亮氨酸)，且氨基酸連接順序不同可產(chǎn)生順序異構(gòu)體，使得二肽在常規(guī)色譜柱上的分離難以實現(xiàn)。目前，基于LC-MS的二肽代謝物分析方法包括非靶向代謝組學、靶向代謝組學、化學衍生化輔助的靶向測定等。

3.1 二肽類代謝物的定性分析 隨著高特異性、高靈敏度質(zhì)譜的興起和各類離子源的快速發(fā)展，二肽的鑒定分析技術(shù)愈加成熟。但是二肽自身的質(zhì)譜信息較為簡單，難以產(chǎn)生豐度較高的定性碎片離子進行無歧義結(jié)構(gòu)鑒定，因此研究者多借助化學衍生化來豐富二肽的質(zhì)譜結(jié)構(gòu)信息。Madmon等[50]采用 LC-ESI-MS/MS技術(shù)獲取二肽的[M+H]+、[M+Na]+以及二肽氨基甲酸酯衍生化之后的質(zhì)譜裂解信息，綜合多種碎片離子信息對二肽進行結(jié)構(gòu)表征。Poliseli等[51]開發(fā)了一種5 min快速LC-ESI-MS/MS分析方法，其基于二肽中羧基的中性丟失46 Da，對乳清蛋白以及豬肝蛋白水解物中的二肽進行鑒定，分別鑒定出18和14種二肽。Tang等[52]利用二甲基標記和未標記二肽的MS/MS圖譜比對，對二肽中氨基酸序列進行識別，并建立二肽結(jié)構(gòu)預(yù)測的MS/MS圖譜數(shù)據(jù)庫。Li等[53]借助激光輔助化學轉(zhuǎn)移技術(shù)結(jié)合衍生化試劑4-羥基-3-甲氧基肉桂醛對組織中二肽化學衍生化后，使用MALDI-MS對組織中二肽進行原位檢測分析，并應(yīng)用該策略對大鼠腦組織中34種二肽的空間分布進行了表征。

3.2 二肽類代謝物的定量分析 二肽類代謝物定量分析方法按是否衍生化可分為兩大類：直接代謝組學分析和基于化學衍生化的靶向測定，而代謝組學分析中又包括非靶向和靶向兩種方法。

3.2.1 非靶向代謝組學 很多研究者利用非靶向代謝組學分析方法，在不同疾病模型中，發(fā)現(xiàn)了二肽類差異代謝物。Hou等[54]采用UPLC-IT-TOF/MS非靶向代謝組學方法，尋找腸道菌群介導的FOLFOX抗結(jié)腸癌療效個體差異的潛在生物標志物，發(fā)現(xiàn)小鼠糞便樣本中Phe-Val、Leu-Gln、Ile-Ala在FOLFOX敏感和非敏感個體間存在顯著差異。Li等[5]對3 482名志愿者血清樣本進行非靶向代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)Glu-Leu可作為結(jié)腸癌早期診斷的生物標志物。Vallianatou等[55]應(yīng)用UPLC-MS/MS對睡眠期間小鼠大腦的氨基酸及二肽進行非靶向代謝組學分析，揭示晝夜節(jié)律與不同大腦區(qū)域特有的二肽代謝之間存在顯著相關(guān)性。

3.2.2 靶向代謝組學 在質(zhì)譜聯(lián)用法中可直接對生物樣本中的二肽進行定量或半定量分析。然而二肽類代謝物一般極性較大，在反向色譜柱上難以保留，如果對其直接進行LC/MS分離分析，一般會選用對極性化合物保留強的親水色譜柱或耐水型色譜柱。Ozawa等[1]建立LC-MS/MS和CE-MS/MS兩種分析方法應(yīng)用大于鼠肝臟中335種二肽的定量分析，兩種分析方法的結(jié)合可對二肽中的同分異構(gòu)體進行有效分離并準確定量。Nogimura等[25]用LC-MS/MS多重反應(yīng)監(jiān)測模式直接對血漿中Pro-Hyp和Hyp-Gly進行了含量測定。

3.2.3 化學衍生化輔助的定量測定 二肽類代謝物一般極性較大，在反向色譜柱上分離困難，不易離子化，而且二肽結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜信息缺乏，難以產(chǎn)生穩(wěn)定的定量特征碎片離子。在此情況下，科研人員也嘗試將化學衍生化技術(shù)與LC/MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合，將強極性的二肽轉(zhuǎn)化為適于反相色譜分離并易于質(zhì)譜離子化的化合物。雖然引入化學衍生化使得分析流程復(fù)雜、耗時費力且容易引入誤差，但對于復(fù)雜體系中的特殊性質(zhì)(如低豐度、難離子化、種類多、濃度范圍寬、無內(nèi)標等)物質(zhì)的檢測往往能實現(xiàn)1+1>2的效果，可以極大提高常規(guī)LC/MS整體性能。經(jīng)化學衍生化之后的二肽色譜保留增強、離子化效率提高、定性定量碎片離子對信息豐富。目前，二肽的衍生化反應(yīng)主要是針對二肽中的氨基，衍生化試劑有丹磺酰氯(DNSCl)[6]、6-氨基喹啉基-N-琥珀酰-亞胺基甲酸酯(AQC)[24,49]、三硝基苯磺酸(TNBS)[56]等。不同的衍生化試劑與二肽發(fā)生反應(yīng)的方程式分別如圖2所示。

A.DNSCl;B.AQC;C.TNBS

4 結(jié)語與展望

二肽類物質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單、組成多樣、活性繁多，其生物學機制及與疾病的關(guān)聯(lián)值得深入研究。目前對于內(nèi)源性二肽代謝物研究還處于起步階段，對其種類、數(shù)量及產(chǎn)生過程認識有限，文獻報道或數(shù)據(jù)庫收錄的代謝物較少且只有極少部分標準品可得，未知代謝物結(jié)構(gòu)難以有效鑒定，二肽類代謝物的高靈敏、寬覆蓋定量分析仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。針對二肽類代謝物種類多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜、標品來源受限的問題，可采用擬靶向代謝組[57]學和一測多評[58]的分析方法，實現(xiàn)基于有限標品的寬覆蓋定量測定。針對該類代謝物離子化效率低、質(zhì)譜響應(yīng)差的問題，可利用化學衍生化實現(xiàn)高靈敏測定。未來針對該類物質(zhì)設(shè)計反應(yīng)效率高、衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性好、質(zhì)譜增敏效果好的衍生化試劑尤為重要。針對此類代謝物同分異構(gòu)體的分離分析難題，可考慮采用多維度(保留時間、離子淌度、特征碎片)整合分析方法，改善分離、提高鑒定可信度。隨著基礎(chǔ)研究和分析方法的快速發(fā)展，未知二肽代謝物的發(fā)現(xiàn)，二肽的轉(zhuǎn)運吸收、與受體之間的相互作用新機制，二肽在不同疾病中的關(guān)鍵作用發(fā)現(xiàn)與驗證，將成為未來研究熱點。