二肽的生物合成及應(yīng)用研究進(jìn)展

范曉光，洪翔，朱新雅，張成林，陳寧

（1.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津300457；3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

二肽的生物合成及應(yīng)用研究進(jìn)展

范曉光1,2,3，洪翔1,2,3，朱新雅1,2,3，張成林1,2,3，陳寧1,2,3

（1.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津300457；3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

二肽是由兩個(gè)氨基酸組成的最簡單的肽，但與蛋白質(zhì)和氨基酸相比，由于缺少有效的制備方法，許多二肽的生理功能尚不清楚。目前，只有少數(shù)二肽實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，如阿斯巴甜（L-天門冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯）以及丙谷二肽（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）等。近年來，隨著微生物體內(nèi)一些非依賴于核糖體系統(tǒng)的二肽合成途徑的發(fā)現(xiàn)，使得人們開始利用酶轉(zhuǎn)化或發(fā)酵的方法制備不同種類的二肽。因此，對一些商品化二肽的功能和應(yīng)用、二肽的現(xiàn)有制備方法以及生物合成二肽的技術(shù)和新思路進(jìn)行綜述。

二肽；生理功能；制備方法；生物合成

二肽是由一分子氨基酸的α-羧基和另一分子氨基酸的α-氨基脫水縮合形成的酰胺鍵（即—CO—NH—）組成的蛋白質(zhì)片段或物質(zhì)。二肽分子中一般包含一個(gè)肽鍵，特殊的二肽如環(huán)二肽則可以存在兩個(gè)肽鍵。近年來，隨著一些商品化二肽產(chǎn)品如阿斯巴甜（L-天門冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯）以及丙谷二肽（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）在食品和醫(yī)藥行業(yè)中的廣泛應(yīng)用，人們對于二肽的營養(yǎng)與功能越發(fā)關(guān)注。但與此同時(shí)，由于缺乏合理有效的制備方法，許多二肽產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用研究停滯不前。筆者將結(jié)合現(xiàn)有的研究報(bào)道，對一些商品化二肽的功能和應(yīng)用、二肽的現(xiàn)有制備方法以及生物合成二肽的技術(shù)和新思路進(jìn)行綜述。

1 二肽的功能和應(yīng)用

二肽在生物體內(nèi)會(huì)被分解為氨基酸，因此二肽具有相應(yīng)氨基酸的功能，但其物化性質(zhì)卻不同于相應(yīng)氨基酸[1]。例如，谷氨酰胺是人體所需的重要氨基酸，但熱穩(wěn)定性較差，而丙氨酰-谷氨酰胺的熱穩(wěn)定較高；酪氨酸幾乎不溶于水，但丙氨酰-酪氨酸在水中的溶解度可達(dá)到14 g/L。有意思的是，一些二肽要比其兩種相應(yīng)氨基酸的溶解性更好，例如丙氨酸和谷氨酰胺在水中的溶解度分別為89 g/L和36 g/L，而丙氨酰-谷氨酰胺的溶解度則可達(dá)到586 g/L。基于上述性質(zhì)，這類二肽如Ala-Gln和Gly-Tyr常作為注射液的主要營養(yǎng)組成成分應(yīng)用于患者的術(shù)后恢復(fù)[2]。除了物化性質(zhì)改變以外，一些二肽本身還具有氨基酸所不具備的特殊生理功能。肌肽，又名β-丙氨酰-L-組氨酸，是由β-丙氨酸和L-組氨酸構(gòu)成的二肽化合物，廣泛存在于肌肉細(xì)胞和腦部組織細(xì)胞。研究結(jié)果表明肌肽在細(xì)胞內(nèi)具有一定的抗氧化能力，可清除在氧化應(yīng)激過程中脂肪酸過度氧化形成的活性氧自由基（ROS）以及α，β不飽和醛[3]。鵝肌肽是由β-丙氨酸和甲基-L-組氨酸構(gòu)成的一種水溶性二肽化合物，廣泛存在于脊椎動(dòng)物的骨骼肌組織和腦組織中，在酸性條件下（pH＜3.0）能夠穩(wěn)定存在。鵝肌肽與肌肽在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能上相近，在食品工業(yè)中已用作天然的抗氧化劑，在醫(yī)藥領(lǐng)域作為抗氧化和抗衰老保健品使用[4]。阿斯巴甜（L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯）是為數(shù)不多的具有甜味的二肽類衍生物，甜度是蔗糖的200倍左右，比蔗糖所含熱量少。使人感到甜味所需的阿斯巴甜用量非常少，以至于可忽略其所含的熱量，所以阿斯巴甜被廣泛用作蔗糖的替代品[5]。目前，世界上有超過90個(gè)國家批準(zhǔn)使用阿斯巴甜作為食品添加劑。此外，存在于魚肉、海藻或蘑菇水解液或提取物中的二肽（如Ile-Tyr，Lys-Trp，Val-Tyr，Ile-Trp）由于能夠抑制人體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的活性，發(fā)揮抗高血壓的功效，在日本已批準(zhǔn)作為特殊的營養(yǎng)保健品使用[6]。

2 二肽的現(xiàn)有制備方法

目前，二肽常用的制備方法包括天然提取法、化學(xué)合成法及化學(xué)-酶轉(zhuǎn)化法。其中化學(xué)合成法和化學(xué)-酶轉(zhuǎn)化法是制備二肽的經(jīng)典方法，也是目前商品化二肽的主要生產(chǎn)方法。而天然提取法由于原料來源有限，植源性或動(dòng)物源性的肽類化合物種類繁多，含量有限，不具備經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢和大規(guī)模生產(chǎn)的可行性。

2.1 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法是利用氨基酸作為原料，通過化學(xué)方法人工構(gòu)建肽鍵制備二肽的方法，主要包括以下步驟[7]：1）保護(hù)除了肽鍵所需的官能團(tuán)以外的其他所有的活性官能團(tuán)；2）激活保護(hù)的氨基酸中游離的羧基；3）將激活的氨基酸與另一種已保護(hù)的氨基酸連接；4）去除二肽中所有的保護(hù)基團(tuán)。化學(xué)合成法的優(yōu)勢在于通過選擇合適的保護(hù)基團(tuán)和激活劑能夠合成多種二肽，且反應(yīng)得率較高。同時(shí)，根據(jù)已知二肽的性質(zhì)和功能，通過改變氨基酸上連接的結(jié)構(gòu)，可以合成出天然無法獲取的具有特殊結(jié)構(gòu)的二肽，從而開發(fā)出特殊用途的藥物及功能食品。因此，化學(xué)合成法是制備商品化二肽的主要方法。化學(xué)合成法的不足在于反應(yīng)步驟及反應(yīng)試劑較多導(dǎo)致的反應(yīng)成本過高。同時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物易于消旋化，副反應(yīng)較多，有毒試劑的使用也會(huì)對人體造成潛在的危害。

2.2 化學(xué)-酶轉(zhuǎn)化法

該方法運(yùn)用蛋白酶和酯酶催化逆反應(yīng)連接氨基酸，與化學(xué)法相比具有更專一的立體選擇性，反應(yīng)條件更溫和。現(xiàn)已知兩種反應(yīng)機(jī)制：熱力學(xué)控制和動(dòng)力學(xué)控制的過程（圖1）。熱力學(xué)控制過程基于蛋白酶和酯酶的逆反應(yīng)過程，在生理?xiàng)l件下酶反應(yīng)更偏向于水解方向。為推動(dòng)反應(yīng)向肽鍵形成方向進(jìn)行，可以利用產(chǎn)物沉淀，底物過量或者在兩相條件下將產(chǎn)物從水相轉(zhuǎn)移至另一不溶相中等方法促進(jìn)合成反應(yīng)[8-9]。動(dòng)力學(xué)控制過程取決于適當(dāng)活化的羧基端酯（或酰胺）迅速?；粋€(gè)絲氨酸或者半胱氨酸蛋白酶。?；钢虚g體經(jīng)歷了一個(gè)限速脫?；磻?yīng)，它發(fā)生在水與另一種親核試劑的競爭中，該過程可以短暫積累產(chǎn)物。該機(jī)制下，二肽的產(chǎn)率取決于水和親核試劑對?；傅墓羲俣群投牡乃馑俣?，所以酶自身和反應(yīng)條件如pH，離子強(qiáng)度和親核試劑濃度都很重要[10-11]。

3 二肽的生物合成

生物體中多數(shù)的肽鍵合成反應(yīng)是在細(xì)胞中核糖體的指導(dǎo)下進(jìn)行的。但近年來，研究者們相繼發(fā)現(xiàn)了一些非依賴于核糖體系統(tǒng)的肽鍵合成反應(yīng)。這些反應(yīng)所涉及到的酶包括：非核糖體肽合成酶（NRPS）[12]、聚谷氨酰胺合成酶[13]、藻青素合成酶[14]、谷胱甘肽合成酶[15]、L-氨基酸-α-連接酶（Lal）[16]等。上述酶催化合成的次級代謝產(chǎn)物往往是細(xì)胞組分形成或者細(xì)胞生長所必須的。其中NRPS和Lal的發(fā)現(xiàn)使得生物法制備二肽成為可能。

3.1 利用NRPS合成二肽

NRPS是一個(gè)很大的酶系，分子量達(dá)到了100～1 700 kDa。它由很多個(gè)具有獨(dú)立催化能力的模塊構(gòu)成，每個(gè)模塊含有一系列結(jié)構(gòu)域用來把一個(gè)氨基酸作為底物結(jié)合到新生肽鏈上[17]。腺苷?；Y(jié)構(gòu)域（A位點(diǎn)）負(fù)責(zé)識(shí)別氨基酸的類別并且通過腺苷酰化作用將其活化，這是一個(gè)需要消耗ATP的過程?；罨^的氨基酸隨后被轉(zhuǎn)移到肽載體蛋白（PCP）上，PCP作為中介再將被活化的氨基酸轉(zhuǎn)移到縮合結(jié)構(gòu)域（C位點(diǎn)），氨基酸在此脫水縮合成肽。最后經(jīng)硫酯結(jié)構(gòu)域（Te位點(diǎn)）把合成的肽鏈從NRPS上釋放出去（圖2）。圖2中閉合菱形和三角形代表兩種不同氨基酸。A domain:腺苷酰化結(jié)構(gòu)域；PCP domain：肽載體蛋白；C domain：縮合結(jié)構(gòu)域；Te domain：硫酯結(jié)構(gòu)域；A，PCP和C結(jié)構(gòu)域共同組成一個(gè)模塊。

NRPS系統(tǒng)已經(jīng)成功地應(yīng)用到二肽的合成中。Doeckel和Marahiel通過連接部分bac基因（在地衣芽孢桿菌中編碼桿菌肽素生物合成的NRPS）和tyc基因（在短芽孢桿菌中編碼短桿菌酪肽生物合成的NRPS），設(shè)計(jì)了二肽合成的生物模板[18]。其中第一個(gè)A區(qū)域BacA1，能夠識(shí)別并激活異亮氨酸，將其跟TycC包含的C-PCP-A2（識(shí)別并激活亮氨酸）區(qū)域融合在一起，并通過4-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中成功表達(dá)了人工合成的NRPS全酶。將此酶純化后與異亮氨酸、亮氨酸和ATP混合形成了異亮氨酸-亮氨酸二肽。他們利用同樣的策略完成了苯丙氨酸-亮氨酸和異亮氨酸-苯丙氨酸的生物合成。

盡管人們已經(jīng)能夠通過人工構(gòu)建的NRPS全酶催化合成所需的二肽，但是仍有一些問題需要克服。第一個(gè)問題是C區(qū)域的選擇性，這對于控制二肽合成的順序至關(guān)重要；第二個(gè)問題是人工合成的NRPS的活力不夠，使得二肽的產(chǎn)率較低。

3.2 利用Lal合成二肽

Lal屬于ATP依賴型的羧酸鹽-胺/硫醇連接酶超家族，使用?；?磷酸鹽作為活性中間體，如圖3所示。該酶可以以無活性基團(tuán)保護(hù)的氨基酸為底物合成二肽，其反應(yīng)伴隨著ATP到ADP的去磷酸化過程，但是不能催化合成三肽或更長的肽鏈。

第一個(gè)報(bào)道的Lal來源于Bacillus subtilis 168（ATCC 23857），由ywfE基因編碼，負(fù)責(zé)催化L-Ala和抗莢膜菌素（L-anticapsin）形成二肽類抗生素芽孢桿菌溶素（bacilysin）[19]（圖4）。晶體結(jié)構(gòu)分析表明[20-21]：該酶N-末端的底物選擇性較為嚴(yán)格，只能接受小分子酸性氨基酸（如L-Ala），而其C-末端的底物選擇性相對寬泛，可以接受許多疏水性氨基酸如L-Phe和L-Met等，同時(shí)該酶不能識(shí)別D型氨基酸。隨后，大約20種不同的Lal相繼被發(fā)現(xiàn)，其對各種氨基酸的親和力也有所不同。例如，Bacillus subtilis NBRC3134中rizA基因編碼的Lal只能接受Arg作為其N-末端的底物[22]。Bacillus subtilis NBRC12200中BL00235基因編碼的Lal只能接受Met和Leu作為其N-末端的底物[23]。然而，Pseudomonas syringae NBRC14081中tabS基因編碼的Lal對底物的選擇性較為寬泛，在236個(gè)待測的二肽合成反應(yīng)中共檢測到136個(gè)二肽產(chǎn)物，一些非常規(guī)的氨基酸如L-哌啶酸，羥基脯氨酸及β-丙氨酸亦可作為其催化底物[24]。

由于不同來源的Lal對底物氨基酸的親和能力不同，因此目前研究更多集中在對Lal的定點(diǎn)改造以增強(qiáng)其對特定二肽的合成能力。例如，BL00235基因編碼的Lal可以催化合成Met-Gly，但同時(shí)伴隨著Met-Met副產(chǎn)物的產(chǎn)生，對該酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，將其85位Pro轉(zhuǎn)變?yōu)榉枷阕灏被崛鏟he，Tyr和Trp等能夠阻止該酶C-末端與Met的結(jié)合[25]。tabS基因編碼的Lal可以催化20 mmol/L的Pro和20 mmol/L的Gly合成8.3 mmol/L的咸味肽Pro-Gly，其85位Ser以及294位His的改變能夠顯著影響酶的活力，其中S85T/ H294D突變酶催化的Pro-Gly產(chǎn)量增加了一倍[26]。

3.3 直接發(fā)酵法制備二肽

直接發(fā)酵法是將氨基酸發(fā)酵與Lal催化反應(yīng)進(jìn)行偶聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)使用基礎(chǔ)底物葡萄糖和氨水生產(chǎn)二肽的過程。但研究發(fā)現(xiàn)，在野生型大腸桿菌中表達(dá)Lal基因時(shí)沒有二肽產(chǎn)生，這說明Lal對底物氨基酸的親和力較低，同時(shí)菌體自身能夠利用二肽作為氮源[27]。對于前一問題，可以通過提高底物氨基酸的通量予以克服，例如可以通過基因過表達(dá)或解除氨基酸對合成酶的反饋調(diào)控提高胞內(nèi)底物氨基酸的濃度，從而增加Lal的底物選擇性，減少其他二肽的產(chǎn)生。對于后一問題，可以通過破壞一些相關(guān)的蛋白酶基因和二肽攝取酶基因予以克服，例如敲除幾個(gè)大腸桿菌中編碼二肽酶或氨肽酶的pepA，pepB，pepD或pepN基因，弱化二肽運(yùn)輸?shù)鞍谆騞pp，能有效減少菌體自身對二肽的降解。Tabata和Hashimoto運(yùn)用上述策略構(gòu)建了一株產(chǎn)Ala-Gln的基因工程大腸桿菌。經(jīng)過47 h的發(fā)酵培養(yǎng)，Ala-Gln的產(chǎn)量達(dá)到100 mmol/L（25 g/L），副產(chǎn)物Ala-Ala的產(chǎn)量為26 mmol/L（3.6 g/L），對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到11.5%[28]。

4 結(jié)論

二肽的生物合成技術(shù)目前仍處在初步研發(fā)階段，但非核糖體肽合成酶以及L-氨基酸-α-連接酶的發(fā)現(xiàn)說明微生物中確實(shí)存在特異性的肽合成酶。與現(xiàn)有的二肽制備方法相比，使用基于NRPS以及Lal的生物合成技術(shù)制備二肽能夠帶來更好的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。在二肽發(fā)酵工程菌的構(gòu)建方面，既需要通過合理設(shè)計(jì)NRPS或?qū)ふ彝吹腖al來合成更多種類的二肽，又需要通過強(qiáng)化胞內(nèi)氨基酸的供給及能量供應(yīng)，減弱二肽降解和輸入途徑來增加二肽的積累。上述生物合成途徑的建立和優(yōu)化將有助于打破目前二肽的生產(chǎn)瓶頸，為更多種類二肽的制備及應(yīng)用研究提供幫助。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Research advances on the biosynthesis and application of dipeptides

FAN Xiaoguang1,2,3,HONG Xiang1,2,3,ZHU Xinya1,2,3,ZHANG Chenglin1,2,3,CHEN Ning1,2,3
(1.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology,Tianjin 300457,China;
2.Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture,Tianjin 300457,China;
3.College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Dipeptide is the simplest peptide composed of two amino acids.The functions of dipeptides have been poorly studied compared with proteins or amino acids due to the lack of efficient preparation method.Only a few dipeptides,such as aspartame(L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester)and L-alanyl-L-glutamine,are commercially used.Recently,the discovery of nonribosomal-dependent synthetic pathway of dipeptide enabled its production via enzymatic methodor fermentative processes.In this review,the functions and applications of dipeptides,as well as the existed methods and new strategies for dipeptide production are summarized.

dipeptides;physiological function;production methods;biosynthesis process

TQ922

A

1674-2214（2016）04-0199-05

2016-05-13

天津市科技特派員項(xiàng)目（15JCTPJC62800）

范曉光（1987—），男，天津人，講師，博士，研究方向?yàn)榇x控制發(fā)酵，E-mail:xiaoguangfan@tust.edu.cn.