氧化應(yīng)激與糖尿病性心肌病的發(fā)生發(fā)展

湯嘉雨，徐政倩，楊君婧，張小芬，杜來(lái)玲

（浙江樹(shù)人學(xué)院樹(shù)蘭國(guó)際醫(yī)學(xué)院，浙江省污染暴露與健康干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310015）

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，中國(guó)大陸糖尿病成年患者人數(shù)預(yù)估達(dá)到了1.298 億人，其中男性0.704億，女性0.594 億[1]。而中國(guó)人民死亡原因中目前占據(jù)首位的疾病是心血管疾病，城市為43.81 % ，農(nóng)村為46.66 % 。慢性病的前瞻研究表明糖尿病明顯增加了患心臟病風(fēng)險(xiǎn)。其中，糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病患者的主要并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者死亡的主要原因[2]。氧化應(yīng)激是超過(guò)細(xì)胞抗氧化能力的活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平升高，使活性氧和抗氧化防御機(jī)制失衡導(dǎo)致的[3]，其在糖尿病并發(fā)癥（包括微血管和心血管?。┑陌l(fā)展中起著關(guān)鍵作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可加速心血管胰島素抵抗、糖尿病性心肌病和心力衰竭[3]。氧化應(yīng)激能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子‐β（TGF‐β）的表達(dá)，活化的TGF‐β 使正常的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致心肌纖維化[5,6]。本文就氧化應(yīng)激對(duì)DCM 的影響及其作用機(jī)制進(jìn)行歸納綜述。

1 糖尿病性心肌病

歐洲心臟病學(xué)會(huì)（European Society of Cardiolo‐gy, ESC）在2008 年發(fā)表了關(guān)于心肌病分類的聲明，在聲明中其將心肌病定義為排除高血壓、先天性心臟病、冠狀動(dòng)脈疾病和瓣膜病的心肌功能和結(jié)構(gòu)異常，是心肌疾病的一種[7]。DCM 這一概念在1974 年被Hamby 等[8]人首次提出，糖尿病患者的高血糖癥與高胰島素血癥致使毛細(xì)血管損傷、心肌纖維化、心肌肥大并伴有線粒體異常和氧化應(yīng)激增加等[9]，這符合心肌病的判斷標(biāo)準(zhǔn)。DCM（這種不符合冠心病、高血壓以及其他心臟病變的心肌疾?。┳罱K可以發(fā)展為心律失常、心力衰竭和心源性休克，嚴(yán)重時(shí)甚至可以發(fā)生猝死。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病女性與男性患者發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)分別提高了5 倍與2.4倍[10]。

雖然糖尿病性心肌病患者機(jī)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一些和擴(kuò)張型心肌病相似的病理改變，如心肌內(nèi)微血管異常、心肌細(xì)胞肥大、彌漫性心肌纖維化等，但其與限制性心肌病更加相似，限制性心肌病患者在左心室無(wú)擴(kuò)張甚至收縮的情況下，左心室壁增厚，導(dǎo)致左心室充盈壓升高?；颊咭话悴粫?huì)從限制性心肌病演變到擴(kuò)張性心肌病[11]，因?yàn)橄拗菩孕募〔『蛿U(kuò)張性心肌病分別反映不同的病理生理機(jī)制[12,13]。擴(kuò)張性心肌病的左心室擴(kuò)張，主要見(jiàn)于長(zhǎng)期存在的I 型糖尿病患者；而限制性心肌病的左心室雖室壁增厚但其大小幾乎不變或更甚者較小[14]，常見(jiàn)于肥胖的II 型糖尿病患者，其患病率是I 型糖尿病的20 倍以上[15]。

病理性心肌肥厚的顯微結(jié)構(gòu)特征是心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡[16]。其中，心肌纖維化在DCM 的心臟結(jié)構(gòu)重建中起著至關(guān)重要的作用，有助于左心室功能的改變和舒張功能障礙。糖尿病心臟的結(jié)構(gòu)和功能改變是由TGF‐β、血栓反應(yīng)蛋白‐1（TSP‐1）及相關(guān)基因等的表達(dá)增加，進(jìn)而增加間質(zhì)和血管周圍膠原沉積加重心肌纖維化引起的[17]。糖尿病性心肌病在早期階段為無(wú)癥狀的亞臨床期，其特征是心臟結(jié)構(gòu)和心功能異常，包括左心室肥厚與心肌纖維化、亞臨床舒張功能障礙等；在有臨床癥狀階段，可發(fā)展為伴有射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭（HFpEF，射血分?jǐn)?shù)≥50%），更甚者出現(xiàn)射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭（HFrEF，射血分?jǐn)?shù)≤40%），此時(shí)心臟存在明顯的收縮期功能障礙[18]。

2 氧化應(yīng)激與糖尿病性心肌病

糖尿病會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥和氧化應(yīng)激增加[19,20]。氧化應(yīng)激是由自由基的形成和清除之間的不平衡引起的一種現(xiàn)象[21]。最有效的自由基來(lái)源于分子氧，大約95% 的氧氣作為能量被消耗并最終變成水；然而剩下的5% 會(huì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，稱為ROS，包括超氧陰離子（O2??）、過(guò)氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（1O2）和羥基自由基（?OH），ROS 與未配對(duì)的電子形成分子和原子，稱為自由基[22]。內(nèi)源性ROS 主要產(chǎn)生于線粒體，線粒體中電子泄漏和O2??的形成對(duì)糖尿病性心肌病非常重要。細(xì)胞的代謝越活躍，線粒體越多，心臟是機(jī)體中代謝最活躍、線粒體密度最高的器官。線粒體呼吸鏈傳遞來(lái)的4 個(gè)電子和1 個(gè)氧分子在線粒體細(xì)胞色素氧化酶上結(jié)合還原，并與4個(gè)氫離子作用生成2 個(gè)分子水，在這個(gè)過(guò)程當(dāng)中，線粒體的電子傳遞鏈會(huì)漏出0.2%～2% 的電子并且與氧發(fā)生反應(yīng)，在氧化磷酸化過(guò)程中產(chǎn)生O2??[23]。在這一過(guò)程中，只有少數(shù)氧接受電子轉(zhuǎn)化為ROS，如O2??。

然而，在糖尿病細(xì)胞中血糖病理性提高會(huì)導(dǎo)致線粒體的電子傳遞鏈異常，大量產(chǎn)生ROS[24]，從而引發(fā)氧化應(yīng)激。這主要涉及4 種分子機(jī)制：增強(qiáng)己糖胺生物合成途徑（hexosamine biosynthetic pathway,HBP）與多元醇途徑（polyol pathway），激活蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）和增加晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end‐products, AGEs）的形成。線粒體超氧化物過(guò)量產(chǎn)生可以導(dǎo)致DNA 鏈斷裂，進(jìn)而激活作為DNA 損傷感受器的多聚ADP 核糖聚合酶（PARP）[25]。PARP 會(huì)抑制糖尿病患者體內(nèi)高血糖細(xì)胞中的關(guān)鍵糖酵解酶——3‐磷酸甘油醛脫 氫 酶（glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase,GAPDH）的活性，導(dǎo)致GAPDH 上游的糖酵解代謝產(chǎn)物增多，激活并進(jìn)入以上4 條通路[4]。由糖尿病引發(fā)的4 條通路和線粒體過(guò)量產(chǎn)生ROS 的也會(huì)進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激（圖1）。

圖1 氧化應(yīng)激在糖尿病性心肌病發(fā)展中的作用。高血糖誘導(dǎo)線粒體過(guò)量產(chǎn)生ROS，如O2?? 和 H2O2，由此通過(guò)抑制GAPDH 導(dǎo)致己糖胺生物合成途徑流量增和多元醇途徑流量增加，PKC亞型活化和AGEs形成增加。這些通路本身是額外ROS 和氧化應(yīng)激的來(lái)源。O2??：超氧陰離子自由基；PARP：聚ADP 核糖聚合酶；GAPDH：3‐磷酸甘油醛脫氫酶；AGEs：晚期糖基化終產(chǎn)物。Fig.1 The role of oxidative stress in the development of diabetic car‐diomyopathy. Hyperglycemia induces mitochondrial overproduction of ROS, such as O2?? and H2O2, which induces an increased HBP flux,an increased polyol pathway flux, activation of PKC isoforms, and in‐creased AGEs formation via inhibition of GAPDH. These pathways are themselves a source of additional ROS and oxidative stress. O2??: super‐oxide anion radicals; PARP: poly(ADP‐ribose) polymerase; GAPDH:glyceraldehyde 3‐phosphate dehydrogenase; AGEs: advanced glycation end‐products.

細(xì)胞內(nèi)高血糖、心肌細(xì)胞脂肪氧化和脂毒性增加都導(dǎo)致線粒體過(guò)量產(chǎn)生ROS。糖尿病患者的心臟特征包括脂肪酸氧化增加和葡萄糖利用率降低，從而引發(fā)心臟中血脂過(guò)量累積，導(dǎo)致心肌脂毒性，這可能是觸發(fā)心臟氧化損傷和慢性炎癥的因素[26]。脂肪酸氧化會(huì)直接影響糖酵解和丙酮酸脫氫酶的活性[27]。糖原合成酶激酶‐3β（GSK‐3β）是葡萄糖在心臟代謝的關(guān)鍵酶。脂肪酸氧化增加和特異性胰島素抵抗引起糖尿病心臟和大血管系統(tǒng)中線粒體過(guò)量產(chǎn)生活性氧，而活性氧會(huì)導(dǎo)致胰島素信號(hào)傳導(dǎo)受損。糖尿病患者心肌細(xì)胞中的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)受損會(huì)抑制蛋白激酶β（Akt），導(dǎo)致GSK‐3β 磷酸化失活[28]，從而改變能量代謝。心臟脂毒性是指心臟中脂質(zhì)不斷被攝取氧化，并且伴有線粒體功能障礙。心肌脂肪酸攝取增加導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)重構(gòu)，使其最小直徑顯著減小，這與分離線粒體中棕櫚酰肉堿氧化增加和活性氧產(chǎn)生增加有關(guān)[29]。游離脂肪酸誘導(dǎo)的活性氧過(guò)量產(chǎn)生，也會(huì)導(dǎo)致活化PKC、激活己糖胺途徑和多元醇途徑、形成AGEs[30]。

蛋白質(zhì)的折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也與氧化應(yīng)激有關(guān)系。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的折疊需要在氧化還原穩(wěn)態(tài)的環(huán)境中進(jìn)行，所以氧化應(yīng)激可能會(huì)破壞蛋白質(zhì)折疊機(jī)制，導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤的出現(xiàn)[31]。而心臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能也會(huì)被炎癥和脂毒性所破壞，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）[32,33]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)超負(fù)荷可導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷凋亡與心臟功能異常[34]。有研究表明在2 型糖尿病中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)（UPRER）可通過(guò)激活PERK 通路調(diào)控線粒體未折疊蛋白反應(yīng)（UPRmt），影響細(xì)胞存活[35]。線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(MAMs)是由線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的物理接觸而形成的一個(gè)獨(dú)特的區(qū)域，并介導(dǎo)細(xì)胞器的交流。在高糖條件下，MAMs 的距離和組成的改變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，從而影響其生理功能，導(dǎo)致線粒體功能障礙和異常凋亡[36]。

3 糖尿病性心肌病的分子機(jī)制

高糖導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的機(jī)制主要有4 種假說(shuō)[4,37]，即增加葡萄糖進(jìn)入己糖胺生物合成途徑進(jìn)行代謝的流量，增加葡萄糖代謝的多元醇途徑，激活蛋白激酶C 信號(hào)通路和增加AGEs 的形成并激活其受體RAGE 信號(hào)通路。如圖1 所示，這4 條通路不僅直接導(dǎo)致糖尿病性心肌病，而它們本身也會(huì)加劇氧化應(yīng)激。

3.1 己糖胺生物合成途徑

葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后，被磷酸化為葡萄糖‐6‐磷酸，并代謝為果糖‐6‐磷酸，其中一部分被允許進(jìn)入己糖胺生物合成途徑（hexosamine biosynthesis path‐way, HBP）。在糖酵解的果糖‐6‐磷酸步驟中，HBP通常只是葡萄糖代謝的次要替代途徑；但當(dāng)外源性葡萄糖輸入心肌細(xì)胞的量超過(guò)了其通過(guò)糖酵解和丙酮酸氧化代謝的能力時(shí)，HBP 通量會(huì)增加[38]。HBP的葡萄糖代謝使糖基分子β‐N‐乙酰氨基葡萄糖（O‐linked β‐N‐acetylglucosamine, O‐GlcNAc）連接到蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基上形成O‐GlcNAc修飾，影響其生物活性（類似于磷酸化），O‐GlcNAc 修飾廣泛存在，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的許多信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用。在正常生理情況下，HBP/O‐GlcNAc機(jī)制的短暫激活是提高細(xì)胞存活的一種適應(yīng)性、保護(hù)性的手段；但在高血糖等病理情況下，HBP/O‐GlcNAc異常增加在糖尿病并發(fā)癥中起重要作用[39]。在心肌細(xì)胞中，高血糖、氧化應(yīng)激和導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的HBP 之間的聯(lián)系已被證實(shí)[40]。高血糖導(dǎo)致在心肌中發(fā)生過(guò)量脂肪酸氧化，糖酵解中間體果糖‐6‐磷酸因濃度提高被轉(zhuǎn)移到HBP 中，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能和基因表達(dá)的變化。除此之外，氧化應(yīng)激也可通過(guò)抑制糖酵解的限速酶GAPD 來(lái)增加HBP 通量，誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致DCM 的發(fā)病。在高葡萄糖水平的肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子ATP 酶2a（sarcoplasmic reticulum calcium ion ATPase 2a, SERCA2a）蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平降低，核蛋白O‐GlcNAc 增加，SERCA2a啟動(dòng)子活性降低[41]。谷胱甘肽（glutathione, GSH）作為機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，能夠清除掉人體內(nèi)的自由基，具有抗氧化作用，GSH 的消耗會(huì)引起氧化應(yīng)激從而來(lái)激活HBP[42]。

3.2 多元醇途徑

在糖尿病患者中，多元醇途徑非?；钴S，消耗體內(nèi)約30% 的葡萄糖[43]。多元醇途徑經(jīng)醛糖還原酶（aldose reductase, AR）、山梨醇脫氫酶（sorbitol dehydrogenase, SDH）前后兩步代謝將葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖。在這一途徑中，AR 利用還原型輔酶Ⅱ（nico‐tinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）作為電子供體將葡萄糖轉(zhuǎn)移到山梨醇中，然后山梨醇被SDH 氧化為果糖，輔助因子NAD+轉(zhuǎn)化為NADH[44]。多元醇途徑導(dǎo)致ROS 過(guò)量產(chǎn)生，因?yàn)锳R 過(guò)度利用NADPH 導(dǎo)致GSH 無(wú)法再生，從而降低了整體抗氧化能力，導(dǎo)致或加劇細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激；同樣，SDH會(huì)導(dǎo)致NADH 的積累，而NADH 是一種產(chǎn)生ROS的NADH 氧化酶的底物[45]。研究人員使用新型AR抑制劑AT‐001 治療28 天后，可以顯著降低糖尿病患者血液中的山梨醇水平[46]。目前AT‐001 正在被進(jìn)行一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照、全球3 期臨床研究，旨在發(fā)現(xiàn)這種具有更高特異性的AR 抑制劑對(duì)有高風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)展為心力衰竭的DCM 患者的療效[47]。

3.3 蛋白激酶C

PKC 是一組蛋白激酶，可以磷酸化其他蛋白并影響其功能，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能、細(xì)胞存活和死亡等。PKC 異構(gòu)體已被證明在糖尿病和許多高血糖并發(fā)癥（尤其動(dòng)脈粥樣硬化和DCM）中發(fā)揮重要作用[48‐50]。在心肌組織中，PKCα 和PKCβ2 是主要的PKC亞型[51]。通過(guò)失活PKCα 信號(hào)通路減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，山楂葉黃酮（Hawthorn leaf flavonoids,HLF）對(duì)大鼠糖尿病性心肌病有保護(hù)作用[50]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)PKCβ 激活，促進(jìn)p66Shc磷酸化，使其被肽基脯氨酰基順?lè)串悩?gòu)酶（Pin‐1）識(shí)別并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，誘導(dǎo)線粒體H2O2產(chǎn)生，從而進(jìn)一步增加細(xì)胞內(nèi)H2O2水平，H2O2、PKCβ、p66Shc三者形成循環(huán)，在一種自觸發(fā)的控制回路中維持或提高PKCβ 的激活[52]。PKCβ2/p66Shc氧化應(yīng)激通路在糖尿病性心肌中過(guò)度激活，引發(fā)心肌細(xì)胞肥大、纖維化以及心臟收縮功能下降[53]。高糖誘導(dǎo)PKCβ2 的過(guò)度激活可通過(guò)損害小泡蛋白‐3（caveolin‐3）的表達(dá)和Akt/eNOS 信號(hào)通路導(dǎo)致心臟舒張功能障礙[54]。選擇性PKCβ 抑制劑ruboxistaurin（RBX）和抗氧化劑N‐乙酰半胱氨酸（N‐acetyl‐cysteine, NAC），可以抑制PKCβ2 活化，減少氧化應(yīng)激，緩解糖尿病的心肌肥大和功能障礙[55]。

3.4 晚期糖基化終產(chǎn)物

非酶糖基化（non‐enzymatic glycosylation, NEG）是發(fā)生在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，還原糖與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸之間的非酶促過(guò)程。NEG 會(huì)改變抗氧化酶的結(jié)構(gòu)，從而使其失去抗氧化的功能，無(wú)法清除自由基，提高糖尿病患者的氧化應(yīng)激[56]。美拉德反應(yīng)中，還原糖類羰基物質(zhì)和蛋白質(zhì)氨基化合物發(fā)生反應(yīng)形成席夫堿，再通過(guò)阿馬道里重排(Amadori rearrangement）反應(yīng)，形成酮胺。席夫堿和酮胺是可逆的反應(yīng)產(chǎn)物，但和氨基酸殘基會(huì)產(chǎn)生不可逆反應(yīng)，形成AGEs。因?yàn)榇蠖鄶?shù)AGEs 是由氧化和糖基化形成的，所以被稱為糖氧化產(chǎn)物。在高血糖環(huán)境下，AGEs 的形成比在生理?xiàng)l件下大幅度提高。AGEs 大量存在于糖尿病患者的心臟中，因此可能是一種導(dǎo)致糖尿病性心肌病的主要源由[57]。RAGE是一類模式識(shí)別受體，能特異性識(shí)別和結(jié)合AGEs而且產(chǎn)生對(duì)應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)的免疫球蛋白超家族受體（IgSFR）[58]。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）中的RAGE 和AGEs 反應(yīng)增加了NADPH 氧化酶的活性，NADPH氧化酶將電子從NADPH 轉(zhuǎn)移到分子氧并產(chǎn)生活性氧，氧化應(yīng)激、AGEs 和RAGE 之間的反應(yīng)激活JNK信號(hào)通路，導(dǎo)致心臟細(xì)胞凋亡，而使用siRNA 阻斷RAGE 可以阻止JNK 的活化[59]。

4 總結(jié)與展望

迄今為止，氧化應(yīng)激一直被認(rèn)為在DCM 中起著關(guān)鍵作用。由于心臟是人體代謝最活躍的器官，且其線粒體含量與其他組織相比也是最高的，所以心臟極其容易過(guò)量產(chǎn)生ROS 并受到氧化應(yīng)激的損傷。高血糖致使線粒體過(guò)量產(chǎn)生ROS，進(jìn)而促進(jìn)心臟中的氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激致使HBP 與多元醇通路通量增加、PKC 活化、AGEs 形成增加以及RAGE 的活化。這些代謝通路的異常增強(qiáng)又導(dǎo)致ROS 過(guò)量產(chǎn)生，從而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激永久化。氧化應(yīng)激的增加會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞線粒體損傷、心肌纖維化與肥厚以及心臟功能障礙。因此，抑制ROS 的產(chǎn)生和清除心肌細(xì)胞中過(guò)多的ROS 可以保護(hù)心肌免受高糖介導(dǎo)的氧化損傷。在對(duì)糖尿病性心肌病的動(dòng)物研究中，發(fā)現(xiàn)提高原發(fā)性抗氧化酶的表達(dá)可以減少心肌病理學(xué)改變并且改善心臟功能。鈉糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（SGLT2）抑制劑是目前治療糖尿病相關(guān)心力衰竭最有效的方法之一，其被證實(shí)可以對(duì)抗氧化應(yīng)激[60]，但其具體藥理活性和作用機(jī)制，以及對(duì)DCM 的病理變化影響，都需要進(jìn)一步研究[61]。未來(lái)若一些主要抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)移治療能夠成功逆轉(zhuǎn)DCM，這些實(shí)驗(yàn)將最終證明氧化應(yīng)激是DCM 的關(guān)鍵因素，并為臨床預(yù)防及治療DCM 提供新的治療方法。