談沐陽，陳希文，彭政，張娟*，張國強

1(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)3(江南大學,未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122)

禽肉加工業(yè)的快速發(fā)展產(chǎn)生了大量角蛋白質(zhì)廢棄物，如羽毛、爪、喙、蹄、角等，該類蛋白具有大量二硫鍵及交聯(lián)性結構，在自然環(huán)境中很難被降解[1]。角蛋白的粗蛋白含量超過85%，是一個巨大的可再生蛋白資源庫。然而，目前仍然缺乏有效的回收方式。傳統(tǒng)的處理方法如高壓水解、微波消解、酸水解、堿水解，存在反應條件苛刻、二次污染、產(chǎn)物低營養(yǎng)等問題[2]。角蛋白酶(keratinase)是一種能夠特異性降解角蛋白的蛋白酶，可水解角蛋白產(chǎn)生可溶性蛋白、氨基酸和多肽等營養(yǎng)物質(zhì)。角蛋白酶的來源廣泛，其中來自芽孢桿菌屬(Bacillussp.)的細菌為主要的生產(chǎn)菌株[3]。近年來，已有許多微生物發(fā)酵法與酶法處理羽毛及羊毛等的相關研究報道[4-9]，但降解效果難以滿足大規(guī)模應用的要求。特別是在酶法處理羽毛的過程中，較低的角蛋白酶濃度顯著限制了羽毛降解能力。因此提高微生物角蛋白酶分泌能力是提升角蛋白酶應用性的關鍵問題之一。

通過信號肽篩選增強分泌能力是提升異源蛋白胞外表達量的常用策略。WATANABE等[10]通過對谷氨酸棒桿菌CorynebacteriumglutamicumR全基因組系統(tǒng)篩選，得到405條信號肽序列，其中11條信號肽能夠表達嗜熱脂肪地熱芽孢桿菌Geobacillusstearothermophilus來源的α-淀粉酶，表達量相比常見的棒狀細菌分泌蛋白PS2增加了50～150倍不等；GUO等[11]在解淀粉芽孢桿Bacillusamyloliquefaciens111018中以增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)為融合標簽，對裂解多糖單加氧酶(MtC1LPMO)進行重組表達，并選取宿主內(nèi)源的20個信號肽對分泌進行優(yōu)化，最終其胞外熒光強度最高提升4.1倍。此外，核糖體結合位點(ribosomebinding site，RBS)優(yōu)化也是提升異源蛋白胞外表達量的常用方法。MAO等[12]通過RBS優(yōu)化，將在枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis中異源表達二乙?；敲撘阴Ｃ傅陌饷富盍μ嵘? 807.6 U/mL，相較優(yōu)化前提升了30%。

在前期研究中，本實驗室已將從自然環(huán)境中篩選得到1株地衣芽孢桿菌B.licheniformisBBE11-1的角蛋白酶基因ker，并在枯草芽孢桿菌B.subtilisWB600系統(tǒng)中進行了重組表達，其胞外角蛋白酶活力為10.4 kU/mL。但在SDS-PAGE檢驗中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵上清液中的胞外蛋白表達量較低，無法滿足工業(yè)應用的需求。本研究中，通過將角蛋白酶原有信號肽替換為枯草芽孢桿菌內(nèi)源信號肽，并對RBS位點進行基于半理性設計的飽和突變，從而提高角蛋白酶的胞外表達量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌EscherichiacoliJM109，枯草芽孢桿菌B.subtilisstrain 168，枯草芽孢桿菌B.subtilisWB600，質(zhì)粒p43NMK均為本實驗室保藏。

1.1.2 酶與試劑

DNA聚合酶(PrimeSTAR Max)，TaKaRa公司；DNA聚合酶(2×RapidTaqMaster Mix、2×Phanta Max Master Mix)，Vazyme公司；超級感受態(tài)細胞制備試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，上海Sangon Biotech公司；柱純化與回收試劑盒，Thermo fisher公司；Gibson assembly反應所需T5外切酶、Phusion聚合酶、Taq連接酶等，NEB公司；SDS-PAGE所用預制膠，Invitrogen公司，相關試劑，Life公司；胰蛋白胨與酵母提取物，OXOID公司；角蛋白酶(部分磺化，5%水溶液)，TCI梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其他常規(guī)試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與溶液

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 5，pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基需加入2%瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20，酵母提取物5，蔗糖30，KH2PO43，Na2HPO46，MgSO40.3，自然pH。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

菌體活化：菌體保存在-80 ℃的甘油管中，用接種環(huán)取少量菌液在固體LB培養(yǎng)基平板上劃線，在37 ℃條件下培養(yǎng)12～14 h。

種子培養(yǎng)：從平板上挑取直徑在1～2 mm的單菌落，接種至裝液3 mL的12 mL搖菌管中的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)12～14 h。

搖瓶發(fā)酵：將培養(yǎng)好的種子液按5%的接種量接種至裝液量50 mL的250 mL擋板搖瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

96孔板培養(yǎng)：從平板上挑取直徑在1～2 mm的單菌落接種至裝液量700 μL每孔的96孔板中的發(fā)酵培養(yǎng)基，在37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.2 信號肽序列選擇及替換

利用Signal Peptide Database (http://www.signalpeptide.de/index.php)，檢索到枯草芽孢桿菌來源的信號肽序列。使用SignalP 5.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)[13]和PSORTb 3.0 (https://www.psort.org/psortb/)[14]預測信號肽對應的蛋白分泌途徑和亞細胞位置，選取分泌途徑預測為Sec途徑且亞細胞定位在胞外的信號肽序列。

以枯草芽孢桿菌B.subtilis168基因組為模板，PCR獲得目的信號肽片段SPx。以質(zhì)粒p43NMK為模板，PCR獲得不含信號肽片段的線性質(zhì)粒p43NMK-SP0。將不同的信號肽片段SPx與p43NMK-SP0通過Gibson assembly反應連接，如圖1所示，過程中涉及引物見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220616.1104.003.html，下同)。

a-質(zhì)粒結構；b-信號肽序列替換

按照感受態(tài)制備試劑盒操作手冊轉化大腸桿菌E.coliJM109，經(jīng)菌落PCR及測序驗證后得到含有不同信號肽的重組質(zhì)粒，將測序正確的重組質(zhì)粒使用常規(guī)化學轉化方法轉入枯草芽孢桿菌B.subtilisWB600。培養(yǎng)方法見1.2.1。

1.2.3 半理性設計RBS突變文庫構建與篩選

利用RBS Library Calculator(https://salislab.net/software/predict_rbs_library_calculator)預測對翻譯起始速率影響最大的區(qū)域，并通過含有簡并堿基的引物對選中位點進行飽和突變，利用96孔板進行高通量篩選，所用引物見附表2。轉化流程見1.2.2，培養(yǎng)方法見1.2.1。

1.2.4 角蛋白酶活力測定方法

將發(fā)酵液離心(12 000 r/min，2 min)后取上清液，用0.22 μm濾膜過濾，即為粗酶液。

反應階段：向反應體系中依次加入pH 10.0的Gly-NaOH(0.05 mol/L)緩沖液150 μL、25 g/L底物100 μL、經(jīng)適度稀釋的粗酶液50 μL，空白對照中應在加入酶液前提前加入200 μL三氯乙酸(0.4 mol/L)。將樣品在60 ℃條件下保溫20 min。反應結束后，加入200 μL三氯乙酸終止反應。

顯色階段：將終止反應的反應體系于12 000 r/min下離心2 min。在已加入1 mL 50 g/L Na2CO3溶液的1.5 mL EP管中加入200 μL反應體系上清液，并加入200 μL福林酚。將樣品在50 ℃保溫10 min顯色，并在660 nm下測定吸光值。96孔板高通量測定時，顯色體系中各組分加入量分別為100 μL 50 g/L Na2CO3溶液、20 μL反應體系上清液、20 μL福林酚。

酶活力定義：在上述反應體系中，使吸光度值上升0.001所需酶量定義為1個酶活力單位。

2 結果與分析

2.1 信號肽序列選擇及發(fā)酵驗證

在Signal Peptide Database中以枯草芽孢桿菌來源為限制條件檢索，共得到信號肽序列244條。排除由于命名不同及其他原因?qū)е碌男蛄兄貜秃?，使用SignalP 5.0和PSORTb 3.0預測信號肽對應的蛋白分泌途徑和亞細胞位置，選取分泌途徑預測為Sec途徑且亞細胞定位在胞外的信號肽序列共20條。

Sec途徑信號肽通常被劃分為3個區(qū)域：蛋白N端區(qū)域(N區(qū))、疏水性區(qū)域(H區(qū))、切割識別位點(C區(qū))。目前存在多種在線預測方法劃分信號肽內(nèi)部區(qū)域，如Phobius[15]和SignalP等，但各服務器對于疏水核心范圍的定義和預測方法不同，以及由于部分信號肽不符合信號肽結構的一般規(guī)律，導致無法預測信號肽內(nèi)部區(qū)域。

TJALSMA等[16]通過首先定義信號肽末端信號肽酶的識別切割位點3個氨基酸為C區(qū)，定義N端帶有正電荷的部分為N區(qū)，將C區(qū)與N區(qū)中間包含大量疏水性氨基酸的疏水核心區(qū)選擇出來。在其他定義中，靠近H區(qū)疏水核心但不包含大量疏水氨基酸的區(qū)域往往被劃分到C區(qū)中，該方法有利于信號肽中部序列整體序列保守性的分析。因此，本研究參照該方法對本研究中所選取的信號肽序列中的信號肽區(qū)域進行劃分，如表1所示。

表1 本研究中選擇的信號肽序列

經(jīng)搖瓶發(fā)酵驗證，20株菌株中，有10株的酶活力有不同程度的提高，如圖2所示。其中胞外角蛋白酶活力最高的重組菌株為WB600-p43 NMK-Ker-SPdacB，其胞外酶活力達到84.3 kU/mL，為出發(fā)菌株的8.1倍。

圖2 不同信號肽對胞外角蛋白酶活力的影響

對4株含有高效信號肽重組菌株的發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE分析，如圖3所示，角蛋白酶條帶所在位置如箭頭所示。4株含有高效信號肽的重組菌株發(fā)酵上清液中的角蛋白酶條帶顏色較對照組更深，且根據(jù)觀察，顏色加深程度與各菌株胞外酶活力總體呈正相關，這與實驗結果基本吻合。

1-B.subtilis WB600(對照)；2-SPdacB；3-SPpelC；4-SPbsn；5-SPmpr；6-初始信號肽

2.2 信號肽性質(zhì)分析

對所選取的20個信號肽性質(zhì)進行了分析，統(tǒng)計了其長度、N區(qū)正電荷、疏水性和mRNA折疊Gibbs自由能(ΔG)。

信號肽N區(qū)正電荷的計算方法為，將精氨酸(arginine, R)和賴氨酸(lysine, K)帶電量定義為+1，天冬氨酸(aspartic acid, D)和谷氨酸(glutamic acid, E)帶電量為-1，其他氨基酸帶電量均視為0，計算N區(qū)的總帶電量。信號肽的疏水性計算方法為計算丙氨酸(alanine, A)、異亮氨酸(isoleucine, I)、亮氨酸(leucine, L)、纈氨酸(valine, V)、苯丙氨酸(phenylalanine, F)、色氨酸(tryptophan, W)和酪氨酸(tyrosine, Y)8種疏水性氨基酸個數(shù)占信號肽總氨基酸個數(shù)的比例。20條所選取的信號肽性質(zhì)見表2。信號肽mRNA折疊ΔG的計算方法為在mfold(http://www.unafold.org/mfold/applications/rna-folding-form-v2.php)，輸入所選取的20個信號肽包含RBS序列在內(nèi)向后共150 bp的序列。

表2 信號肽性質(zhì)分析

選取胞外酶活力較高的菌株對其各項性質(zhì)與胞外酶活力的相關性進行分析。

信號肽文庫中的信號肽長度集中在2～35 AA，隨著信號肽的增長其胞外酶活力總體上呈現(xiàn)下降趨勢，證明信號肽長度增加對于角蛋白酶的分泌是不利的，其最佳的長度為25～30 AA左右。此外，高效信號肽的N區(qū)正電荷量普遍分布在在2～4，但隨著N端電荷的增加，信號肽的角蛋白酶分泌能力并未顯示出同步的上升。分泌能力最高的4條信號肽序列SPdacB、SPbsn、SPmpr和SPbdbD相對正電荷量分別為50%、50%、40%、40%，以上結果說明信號肽中N端相對正電荷量處于一個特定的范圍內(nèi)時，信號肽的分泌能力更高，這與以往的研究中提出的觀點相似[17]。

信號肽H區(qū)疏水性與胞外酶活力分析的結果表明，在篩選得到的高效信號肽中，角蛋白酶的胞外酶活力水平與H區(qū)疏水性有顯著的正相關性，及隨著H區(qū)疏水性的提高，角蛋白酶的胞外酶活力提高。此外，有相關研究報道了H區(qū)內(nèi)的疏水性氨基酸會形成疏水核心，通過影響信號肽的蛋白二級結構的方式影響其跨膜時的效率[18]。

如圖4所示，信號肽mRNA折疊的ΔG與胞外酶活力分析的結果表明，在篩選得到的高效信號肽中，角蛋白酶的胞外酶活力水平與ΔG有顯著的正相關性，即隨著ΔG的提高，角蛋白酶的胞外酶活力提高，這與此前相關研究的結果基本一致[11]。

a-長度；b-N區(qū)電荷；c-H區(qū)疏水性；d-mRNA折疊的ΔG

總體而言，許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通常被認為高效且應用于異源蛋白表達的信號肽，如SPaprE、SPpel、SPyoaW等，對于其他蛋白在枯草芽孢桿菌中的表達并不一定是最優(yōu)的[19-21]。事實上，已有研究提出并不存在廣泛適用于多種蛋白分泌的高效信號肽[22]。

已有研究中[11,16-17]對N區(qū)、H區(qū)、C區(qū)的序列分析表明，N區(qū)通常含有較多帶正電荷的氨基酸，如R和K；H區(qū)通常疏水性氨基酸較多，如A、V、L等；C區(qū)最顯著的特點是信號肽末端切割位的A-X-A保守序列。對表達效率最高的5條信號肽序列進行了類似的分析，如圖5所示，發(fā)現(xiàn)高效信號肽表現(xiàn)出的性質(zhì)符合上述中的總體規(guī)律。

a-N區(qū)序列；b-H區(qū)序列；c-C區(qū)序列

此外，LOW等[23]的研究發(fā)現(xiàn)N區(qū)的MKK序列和H區(qū)的甘氨酸對于蛋白的高效易位可能是有利的。本研究中的結果顯示，對胞外酶活力提升最顯著的SPdacB并不具備N區(qū)的MKK和H區(qū)的甘氨酸這2個特點；含有MKK序列的信號肽，如SPbdbD、SPnucB、SPpel和SPvpr，其胞外酶活力未表現(xiàn)出與該序列的相關性。SPbdbD的H區(qū)含有強疏水性區(qū)域5V片段，這顯著提高了H區(qū)的疏水性。

綜上所述，對于特定蛋白的表達，信號肽篩選仍是必要的，但通過分泌途徑和亞細胞定位預測少量篩選信號肽而篩選宿主全信號肽文庫的信號肽優(yōu)化方案，能夠顯著地提高篩選效率。

2.3 半理性設計選擇RBS突變位點

利用RBS Library Calculator(https://salislab.net/software/predict_rbs_library_calculator)預測對翻譯起始速率影響最大的區(qū)域。通過比較從RBS起始位點逐步向翻譯起始位點移動的方式進行預測。比較了不同位點預測翻譯起始速率前50的RBS序列的分布，如圖6所示。

圖6 RBS半理性設計突變區(qū)域?qū)Ψg起始速率的影響

我們發(fā)現(xiàn)在1～6位和2～7位時的飽和突變對理論起始翻譯速率提升最顯著，且1～6位相較2～7位具有更高的最大翻譯起始速率，有利于高通量篩選的進行。因此，選擇RBS 1～6位進行飽和突變，構建了含有4 096個突變體的突變文庫，選擇理論數(shù)量3倍的轉化子進行篩選以達到95%的覆蓋率。

2.4 RBS飽和突變篩選

通過96孔板發(fā)酵初篩得到7株較優(yōu)化前酶活力有提高的重組菌株，如表3所示。

表3 RBS飽和突變篩選

搖瓶復篩后，其中僅3株胞外酶活力較優(yōu)化前菌株有顯著提高，如圖7所示。

圖7 RBS突變對胞外酶活力的影響

其中菌株R16D12的胞外酶活力達到109.1 kU/mL，較優(yōu)化前提高了29%，是出發(fā)菌株胞外酶活力的10.5倍。對其進行了SDS-PAGE分析，結果如圖8所示，發(fā)現(xiàn)其表達量提升并不顯著，與實驗結果基本吻合。結合以上研究結果，我們發(fā)現(xiàn)預測得到的mRNA折疊ΔG和翻譯起始速率與胞外酶活力的相關性并不顯著，在RBS Library Calculator預測中得到具有較高的翻譯起始速率或較低的吉布斯自由能并不能說明RBS序列是高效的，其數(shù)據(jù)并不能作為RBS選擇的直接依據(jù)，但基于RBS飽和突變的高通量篩選對于RBS優(yōu)化仍是有效的策略。

1-SPdacB；2-R16D12

3 結論

本研究結合信號肽篩選和RBS優(yōu)化策略，提高了重組枯草芽孢桿菌BacillussubtilisWB600-p43NMK-Ker的角蛋白酶胞外表達量。通過篩選來自枯草芽孢桿菌的20條信號肽序列，得到帶有SPdacB的重組菌株其胞外角蛋白酶活力達到84.3 kU/mL，約為出發(fā)菌株胞外酶活力的8.1倍。在此基礎上，通過對RBS進行基于半理性設計的飽和突變，篩選得到的1株高產(chǎn)菌株R16D12，其胞外酶活達到109.1 kU/mL，較RBS優(yōu)化前提高了29%，是出發(fā)菌株胞外酶活力的10.5倍。研究結果表明，信號肽篩選和RBS優(yōu)化的組合策略顯著提高了角蛋白酶在枯草芽孢桿菌中的胞外表達量，所得重組菌株在搖瓶發(fā)酵條件下的角蛋白酶胞外酶活力在目前已報道的研究中處于較高水平。