符長(zhǎng)彪，明紅梅*，張宿義，李德林，張程，杜向軍，馬世源，馬浩

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓，644000)2(瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州，646000)

濃香型白酒以己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯為主體香，具有“窖香濃郁、甘冽清爽、飲后尤香、回味悠長(zhǎng)”的風(fēng)格特征，這與濃香型白酒采用“泥窖固態(tài)發(fā)酵，續(xù)糟配料，混蒸混燒”的獨(dú)特釀造工藝有關(guān)。濃香型白酒釀造是一個(gè)開(kāi)放式、多菌共同發(fā)酵的過(guò)程。參與釀造的微生物主要來(lái)源于環(huán)境、大曲、窖泥和酒醅等[1]。劉宇等[2]從濃香型白酒釀造環(huán)境中分離篩選了3株酵母，分別為發(fā)酵畢赤酵母、漢斯德巴氏酵母、卡斯特瑙氏酵母，通過(guò)純培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵畢赤酵母具有高產(chǎn)乙酸乙酯的特點(diǎn)?？梢?jiàn)，釀造環(huán)境中的微生物與濃香型白酒風(fēng)格的形成密切相關(guān)。

近年來(lái)，業(yè)內(nèi)學(xué)者針對(duì)白酒釀造環(huán)境微生物進(jìn)行了相關(guān)研究，如，黎瑤依等[3]對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒釀造環(huán)境中真菌菌群多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同輪次釀造環(huán)境樣品中真菌組成相似度較高，但其各輪次標(biāo)志性真菌屬存在差異。隨著傳統(tǒng)白酒釀造機(jī)械化的發(fā)展，圍繞機(jī)械化釀造白酒的研究逐漸增多。王歡等[4]對(duì)醬香型白酒機(jī)械化釀造不同輪次堆積發(fā)酵細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性分析發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在不同輪次堆積發(fā)酵核心微生物菌群中具有重要的生物學(xué)調(diào)控作用。目前，環(huán)境微生物的研究，主要聚焦在探索釀造時(shí)空環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的特征，少有文獻(xiàn)報(bào)道釀造車間不同釀造區(qū)域中環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)變化。隨著機(jī)械化釀造設(shè)備在白酒行業(yè)的應(yīng)用和逐步推廣，機(jī)械化釀造方式下環(huán)境微生物的分布特征及其與傳統(tǒng)釀造方式下環(huán)境微生物的相似相異性等，將成為研究的熱點(diǎn)。

本次研究以機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式下釀造車間環(huán)境區(qū)域微生物為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合數(shù)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)比兩種方式下環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)差異性，以期發(fā)現(xiàn)釀造車間不同環(huán)境區(qū)域微生物群落結(jié)構(gòu)的特征，進(jìn)一步探明機(jī)械化釀造方式對(duì)環(huán)境微生物的影響，從環(huán)境微生物的角度為白酒釀造機(jī)理提供理論依據(jù)，從而提升白酒品質(zhì)，促進(jìn)白酒產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品及采集方法

環(huán)境樣本，采集自四川某白酒企業(yè)機(jī)械化釀造方式、傳統(tǒng)釀造方式的釀造車間環(huán)境區(qū)域的灰塵。機(jī)械化白酒釀造車間的拌料、上甑、打量水，機(jī)械設(shè)備完成，傳統(tǒng)白酒釀造車間對(duì)應(yīng)環(huán)節(jié)，人工操作。樣品采集后立即裝袋密封，24 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室分析，采集樣品均在-80 ℃密封保存、備用。

按照釀造車間內(nèi)的環(huán)境區(qū)域進(jìn)行劃分，具體環(huán)境區(qū)域劃分及樣本情況：濃香型白酒釀造車間內(nèi)四周墻面區(qū)域，因與各釀造環(huán)節(jié)相距較遠(yuǎn)，作為非釀造區(qū)域的代表，樣本編碼：機(jī)械墻面區(qū)域樣品：JFN，傳統(tǒng)墻面區(qū)域樣品：CFN，拌料、蒸餾及堆糟環(huán)節(jié)周圍的環(huán)境代表釀造非核心區(qū)域，樣本編碼：機(jī)械上甑區(qū)域樣品：JHF,傳統(tǒng)上甑區(qū)域樣品：CHF；攤晾和入窖環(huán)節(jié)周圍的環(huán)境代表釀造核心區(qū)域，樣本編碼：機(jī)械攤晾區(qū)域樣品：JHN_T，傳統(tǒng)攤晾區(qū)域樣品：CHN_T，機(jī)械窖池區(qū)域樣品：JHN_J，傳統(tǒng)窖池區(qū)域樣品:CHN_J。

1.1.2 試劑

FastDNA?Spin Kit For Soil，美國(guó)MPbio；PBS、引物合成，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PX124ZH/E型電子分析天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；JE1201型電子天平，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；YX-24HPD型手提式蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備；Vortex-2型旋渦混勻儀，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-IFD型潔凈工作臺(tái)，蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；DW-HL678型超低溫冷凍儲(chǔ)存箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；MiSeq測(cè)序儀，美國(guó)Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品總DNA提取

提取步驟參見(jiàn)FastDNA?Spin Kit For Soil的操作說(shuō)明。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

PCR引物：真菌引物使用ITS1F/ITS2R(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′/5′-GCTGCGTTCTTC-ATCGATGC-3′)，細(xì)菌16S rRNA基因引物使用338F/806R(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 3 min，27次循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在10 ℃下直到反應(yīng)停止。

PCR反應(yīng)體系：細(xì)菌：4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，0.8 μL上游引物(5 μmol/L)，0.8 μL下游引物(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfuDNA聚合酶，0.2 μL牛血清蛋白，10 ng模板DNA，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。真菌：2 μL 10×FastPfu緩沖液，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，0.8 μL上游引物(5 μmol/L)，0.8 μL下游引物(5 μmol/L)，0.2 μL rTaq聚合酶，0.2 μL牛血清蛋白，10 ng模板DNA，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。

1.3.3 Illumina MiSeq測(cè)序

利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)對(duì)細(xì)菌和真菌序列進(jìn)行測(cè)序分析，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)與圖像處理

采用WPS 2021和IBM SPSS 26進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算與分析。基于Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)繪制群落結(jié)構(gòu)柱形圖、微生物熱圖、Venn圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同釀造方式下釀造車間的環(huán)境微生物多樣性分析

本研究利用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)平臺(tái)對(duì)在不同釀造方式下釀造車間6組環(huán)境樣本的微生物(真菌、細(xì)菌)在OTU水平上進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，結(jié)果如表1所示。

表1 不同釀造方式下釀造車間的環(huán)境微生物α多樣性指數(shù)

由表1可知，從各個(gè)區(qū)域微生物類群來(lái)看，細(xì)菌的Shannon值、Chao1值和ACE值均高于真菌，說(shuō)明各個(gè)區(qū)域中細(xì)菌類群比真菌類群更加豐富，原因可能是細(xì)菌類群的存活條件相較于真菌類群來(lái)說(shuō)，它具有更好的抗逆性、適應(yīng)性等[5]。從機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式相同區(qū)域?qū)Ρ葋?lái)看，除了Shannon指數(shù)的部分?jǐn)?shù)據(jù)規(guī)律有所區(qū)別外，真菌、細(xì)菌的Shannon值、Chao1值和ACE值均是傳統(tǒng)高于機(jī)械化，說(shuō)明從整體上來(lái)看傳統(tǒng)釀造區(qū)域的微生物種類更加豐富且分布較為均勻。從3組機(jī)械化釀造方式下不同區(qū)域的樣本來(lái)看，真菌的Shannon值在釀造核心區(qū)最高，說(shuō)明機(jī)械化釀造方式真菌種類在釀造核心區(qū)更豐富，原因可能是釀造核心區(qū)的攤晾環(huán)節(jié)會(huì)添加富含真菌的大曲，大曲微生物與環(huán)境微生物相互影響[6]。

2.2 不同釀造方式下釀造車間的環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)分析

為了進(jìn)一步分析在機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式下釀造車間各個(gè)區(qū)域的環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)，利用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)平臺(tái)得到在屬水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)情況。在屬水平上，由于相對(duì)豐度<0.01的物種較多，因此本研究將樣品中相對(duì)豐度<0.01的物種歸為一類(others)以及其他物種(相對(duì)豐度≥0.01)分成為不同的類，繪制群落結(jié)構(gòu)柱形圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

a-真菌；b-細(xì)菌

采用高通量測(cè)序技術(shù)從不同釀造方式下濃香型白酒釀造車間的6組環(huán)境樣本中共檢測(cè)到8個(gè)真菌門，28個(gè)真菌綱，65個(gè)真菌目，159個(gè)真菌科，331個(gè)真菌屬；31個(gè)細(xì)菌門，82個(gè)細(xì)菌綱，222個(gè)細(xì)菌目，411個(gè)細(xì)菌科，982個(gè)細(xì)菌屬。

由圖1-a可知，從機(jī)械化釀造方式不同區(qū)域3組樣本來(lái)看，在JFN區(qū)域樣本中相對(duì)豐度排前2種的是枝孢菌屬(Cladosporium)、未分類-畸形球菌科(unclassified_f__Teratosphaeriaceae)，其相對(duì)豐度占比總和為95.09%；在JHF區(qū)域樣本中相對(duì)豐度排前2種的是枝孢菌屬、節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia)，其相對(duì)豐度占比總和為79.40%；而在JHN區(qū)域樣本中相對(duì)豐度排前6種的是未分類-畸形球菌科、枝孢菌屬、新葫蘆科菌屬(Neocucurbitaria)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、曲霉屬(Aspergillus)、節(jié)擔(dān)菌屬，其相對(duì)豐度占比總和為57.00%。這些真菌屬的相對(duì)豐度均>5%，為各區(qū)域的優(yōu)勢(shì)菌屬。從構(gòu)成百分比來(lái)看，JFN、JHF、JHN區(qū)域樣本中真菌類群所占構(gòu)成比例之間均有一定差異。從傳統(tǒng)釀造方式不同區(qū)域3組樣本來(lái)看，在CFN區(qū)域樣本中相對(duì)豐度排前2種的是曲霉屬、未分類-畸形球菌科，其相對(duì)豐度占比總和為88.25%；在CHF區(qū)域樣本中相對(duì)豐度排前4種的是絲核菌屬(Rhizoctonia)、曲霉屬、未分類-葫蘆科(unclassified_f__Cucurbitariaceae)、枝孢菌屬，其相對(duì)豐度占比總和為53.48%；而在CHN區(qū)域樣本中相對(duì)豐度排前6種的是未分類-子囊菌門(unclassified_p__Ascomycota)、柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)、節(jié)擔(dān)菌屬、曲霉屬、絲孢酵母屬、未分類-雙足菌科(unclassified_f__Dipodascaceae)，其相對(duì)豐度占比總和為72.85%。這些真菌屬的相對(duì)豐度均>5%，為各區(qū)域的優(yōu)勢(shì)菌屬。從構(gòu)成百分比來(lái)看，CFN、CHF、CHN區(qū)域樣本中所占構(gòu)成比例之間均有一定差異。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，兩種釀造方式下釀造車間環(huán)境區(qū)域共有的優(yōu)勢(shì)菌屬僅有枝孢菌屬、未分類-畸形球菌科、節(jié)擔(dān)菌屬、曲霉屬、絲孢酵母屬，但相同環(huán)境區(qū)域真菌類群構(gòu)成具有較大差異。因此，兩種釀造方式下各環(huán)境區(qū)域真菌群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的構(gòu)成特征，而且各區(qū)域真菌類群構(gòu)成占比具有較為明顯的變化，其主要原因可能是真菌類群之間相互競(jìng)爭(zhēng)、協(xié)同，以及各區(qū)域營(yíng)養(yǎng)條件、環(huán)境因素的不同，造成微生物類群此消彼長(zhǎng)，從而改變各環(huán)境區(qū)域真菌群落結(jié)構(gòu)。

由圖1-b可知，從機(jī)械化釀造方式不同區(qū)域3組樣本來(lái)看，在JFN區(qū)域樣本中相對(duì)豐度排前4種的是風(fēng)疹菌屬(Rubellimicrobium)、奇異球菌屬(Deinococcus)、norank_f_norank_o_Chloroplast、葡萄球菌屬(Staphylococcus)；在JHF區(qū)域樣本中相對(duì)豐度排前2種的是考克氏菌屬(Kocuria)、砷球菌屬(Arsenicicoccus)；而在JHN區(qū)域樣本中相對(duì)豐度排3種的是考克氏菌屬、短桿菌屬(Brachybacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)。這些細(xì)菌屬的相對(duì)豐度均>5%，為各區(qū)域的優(yōu)勢(shì)菌屬。從構(gòu)成百分比來(lái)看，考克氏菌屬、棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬等共有21種細(xì)菌屬分別在JFN、JHF、JHN區(qū)域樣本中構(gòu)成占比總和均在50%～60%，說(shuō)明機(jī)械化釀造方式不同區(qū)域細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有很大的相似性。從傳統(tǒng)釀造方式不同區(qū)域3組樣本來(lái)看，在CFN區(qū)域樣本中相對(duì)豐度排前3種的是芽孢桿菌屬、Methylobacterium-Methylorubrum、嗜熱放線菌屬(Thermoactinomyces)；在CHF區(qū)域樣本中相對(duì)豐度排前5種的是norank_f_JG30-KF-CM45、Nakamurella、Micropruina、unclassified_f__Nocardiaceae、Microlunatus；而在CHN區(qū)域樣本中相對(duì)豐度排前3種的是魏斯氏菌屬(Weissella)、棒狀桿菌屬、乳酸桿菌屬。這些細(xì)菌屬的相對(duì)豐度均>5%，為各區(qū)域的優(yōu)勢(shì)菌屬。從構(gòu)成百分比來(lái)看，魏斯氏菌屬、乳酸桿菌屬、棒狀桿菌屬等共有22種細(xì)菌屬分別在CFN、CHF、CHN區(qū)域樣本中構(gòu)成占比總和均在50%～60%，說(shuō)明傳統(tǒng)釀造方式不同區(qū)域細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有很大的相似性。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，兩種釀造方式下釀造車間環(huán)境區(qū)域共有的優(yōu)勢(shì)菌屬只有棒狀桿菌屬。因此，兩種釀造方式下各環(huán)境區(qū)域細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)相似的構(gòu)成特征，說(shuō)明機(jī)械釀造方式和傳統(tǒng)釀造方式的各環(huán)境區(qū)域的細(xì)菌類群具有較好的穩(wěn)定性，與細(xì)菌類群的抗逆性、適應(yīng)性較強(qiáng)有關(guān)；而兩種釀造方式相同環(huán)境區(qū)域細(xì)菌類群構(gòu)成具有較大差異，除與真菌類群一樣，受到微生物相互作用、營(yíng)養(yǎng)及環(huán)境條件的影響以外，還可能與傳統(tǒng)釀造車間是開(kāi)放式環(huán)境，各區(qū)域細(xì)菌類群受糟醅和大曲微生物影響較大[7]。

2.3 不同釀造方式下釀造車間的環(huán)境微生物群落變化分析

為了深入分析機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式環(huán)境微生物群落的變化，進(jìn)一步將釀造車間非釀造區(qū)、釀造非核心區(qū)及釀造核心區(qū)(攤晾、窖池區(qū)域)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)平臺(tái)得到在屬水平上豐度前30的微生物群落Heatmap圖，如圖2所示，圖中顏色越接近紅色表示相對(duì)豐度越高，顏色越接近綠色表示相對(duì)豐度越低。

a-真菌；b-細(xì)菌

由圖2-a可知，在真菌屬水平上，從機(jī)械化釀造方式不同區(qū)域來(lái)看，JHN_T區(qū)域中有17種相對(duì)豐度>1%的微生物，但在JFN、JHF及JHN_J區(qū)域中分別對(duì)應(yīng)有2、7、9種相對(duì)豐度>1%的微生物。JHN_T區(qū)域中相對(duì)豐度較高的真菌屬分別有新葫蘆科菌屬、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、嗜熱真菌屬(Thermomyces)等。嗜熱子囊菌屬在JFN、JHF、JHN_T、JHN_J區(qū)域中相對(duì)豐度分別為0.004 2%、0.008 5%、6.00%、0.17%，該菌屬是大曲和酒醅中的優(yōu)勢(shì)微生物，能夠產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶等多種酶類，對(duì)白酒產(chǎn)香具有促進(jìn)作用[8]。可以認(rèn)為，機(jī)械化釀造方式攤晾區(qū)域真菌類群種類較多且豐度較高，原因可能是機(jī)械化釀造車間處于半開(kāi)放式的環(huán)境，攤晾區(qū)域的環(huán)境微生物受到大曲微生物的影響較大。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，還有一些微生物在窖池區(qū)域中的相對(duì)豐度最高，如節(jié)擔(dān)菌屬、絲孢酵母屬、曲霉屬、Apiotrichum等。絲孢酵母屬在JFN、JHF、JHN_T、JHN_J區(qū)域中相對(duì)豐度分別為0.002 1%、0.39%、6.90%、12.38%，該菌屬能夠代謝產(chǎn)生多元醇，使白酒具備醇甜味[9]。曲霉屬在JFN、JHF、JHN_T、JHN_J區(qū)域中相對(duì)豐度分別為0.27%、1.38%、3.64%、12.65%，該菌屬是大曲和糟醅中的重要微生物，并能夠在酒醅發(fā)酵中代謝產(chǎn)生白酒呈香呈味的重要風(fēng)味物質(zhì)或者風(fēng)味前體物質(zhì)[10]。除此之外，枝孢菌屬在JFN、JHF區(qū)域中相對(duì)豐度均較高，分別為80.19%、72.20%，而在JHN_T、JHN_J區(qū)域中相對(duì)豐度分別為20.60%、0.53%。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，枝孢菌屬在自然界中廣泛存在，尤其是墻面區(qū)域最容易富集，對(duì)于白酒釀造的影響，還有待進(jìn)一步研究。從傳統(tǒng)釀造方式不同區(qū)域來(lái)看，CFN區(qū)域中只有5種相對(duì)豐度>1%的微生物，但在CHF、CHN_T、CHN_J區(qū)域中分別對(duì)應(yīng)有15、13、13種相對(duì)豐度>1%的微生物。CHF、CHN_T、CHN_J 3個(gè)區(qū)域中相對(duì)豐度較高的真菌屬有絲孢酵母屬、嗜熱子囊屬、假絲酵母屬(Candia)等共13種，這些真菌屬在JHN_T區(qū)域中也有檢測(cè)到。其中，絲孢酵母屬在CHF、CHN_T、CHN_J區(qū)域中相對(duì)豐度分別為4.22%、2.71%、8.18%，但在CFN區(qū)域中相對(duì)豐度為0.12%?？逻_(dá)酵母屬在CFN、CHF、CHN_T、CHN_J區(qū)域中相對(duì)豐度分別為0.002 1%、0.021%、37.49%、0.15%，該菌屬是一類能夠?qū)ι锇愤M(jìn)行降解的菌株[12]，在機(jī)械化釀造方式下各區(qū)域的相對(duì)豐度均<1%?？梢哉J(rèn)為，傳統(tǒng)釀造方式的釀造核心區(qū)、非核心區(qū)域的真菌類群相對(duì)豐度均較高，原因可能是傳統(tǒng)釀造車間處于開(kāi)放式的環(huán)境，大曲、糟醅微生物與環(huán)境微生物相互影響，且該區(qū)域環(huán)境條件、營(yíng)養(yǎng)狀況適于真菌類群的生長(zhǎng)和繁殖。

由圖2-b可知，在細(xì)菌屬水平上，從機(jī)械化釀造方式不同區(qū)域來(lái)看，JFN、JHF、JHN_T、JHN_J區(qū)域中相對(duì)豐度>1%的微生物均衡分布，分別對(duì)應(yīng)有12、13、15、15種細(xì)菌屬。JFN、JHF、JHN_T、JHN_J 4個(gè)區(qū)域中至少有兩個(gè)區(qū)域相對(duì)豐度均較高的細(xì)菌屬有考克氏菌屬、短桿菌屬、Knoellia、魏斯氏菌屬等共15種。其中，Knoellia在JFN、JHF、JHN_T、JHN_J區(qū)域中的相對(duì)豐度均較高，分別為1.25%、1.62%、4.87%、1.96%?？梢哉J(rèn)為，細(xì)菌類群因耐受性、適應(yīng)性更強(qiáng)，在機(jī)械化釀造方式的車間環(huán)境區(qū)域內(nèi)較為穩(wěn)定。魏斯氏菌屬在JFN、JHF、JHN_T、JHN_J區(qū)域中相對(duì)豐度分別為0.19%、1.24%、0.22%、1.53%，該屬能夠代謝產(chǎn)乳酸、乙酸等有機(jī)酸類物質(zhì)，并有助于乳酸乙酯的生成和酒體風(fēng)味的形成[13]。除此之外，棒狀桿菌屬只在JHN_J區(qū)域中相對(duì)豐度最高為10.44%，而在JFN、JHF、JHN_T區(qū)域中的相對(duì)豐度分別為0.78%、0.17%、0.13%，該菌屬可通過(guò)糖酵解途徑，利用二羥酸脫水酶、轉(zhuǎn)氨酶等酶的作用形成L-異亮氨酸，進(jìn)一步代謝產(chǎn)生酒體中的風(fēng)味物質(zhì)[14]。乳酸桿菌屬只在JHN_J區(qū)域中相對(duì)豐度最高為3.77%，而在JFN、JHF、JHN_T區(qū)域中的相對(duì)豐度分別為0.47%、0.30%、0.39%，該菌屬是酒醅中的優(yōu)勢(shì)菌屬，主要代謝產(chǎn)生乳酸，在發(fā)酵體系中經(jīng)生化反應(yīng)合成多種呈香呈味物質(zhì)，如乳酸乙酯[15]。從傳統(tǒng)釀造方式不同區(qū)域來(lái)看，CFN、CHF、CHN_T、CHN_J區(qū)域中相對(duì)豐度>1%的微生物分布較為均衡，在CFN、CHF、CHN_T、CHN_J區(qū)域中分別對(duì)應(yīng)有10、13、12、12種相對(duì)豐度>1%細(xì)菌屬，主要集中在CHF、CHN_T兩個(gè)區(qū)域。CFN、CHF、CHN_T、CHN_J 4個(gè)區(qū)域中相對(duì)豐度較高的細(xì)菌屬有考克氏菌屬、Microbacterium、雙魚(yú)屬(Piscicoccus)、魏斯氏菌屬等共12種?？伎耸暇鷮僭贑HF、CHN_T區(qū)域中的相對(duì)豐度均較高，分別為1.76%、3.24%，但在CFN、CHN_J區(qū)域中的相對(duì)豐度分別為0.36%、0.75%，該菌屬具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，并且利于合成白酒中乙酸乙酯等關(guān)鍵香氣物質(zhì)[16]。因此，傳統(tǒng)釀造方式不同區(qū)域細(xì)菌類群在CHF、CHN_T兩個(gè)區(qū)域相對(duì)豐度較高，其原因主要是受糟醅、大曲細(xì)菌類群的影響及其微生物之間相互作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬在CFN、CHN_J區(qū)域中相對(duì)豐度均較高，分別為30.87%、1.18%，而在CHF、CHN_T區(qū)域中相對(duì)豐度分別為0.21%、0.72%，該菌屬具有很好的耐熱性質(zhì)，是一類能夠代謝產(chǎn)生吡嗪類化合物菌株，而吡嗪類化合物是白酒中具有重要作用的風(fēng)味物質(zhì)。高溫放線菌屬只在CFN區(qū)域中相對(duì)豐度最高為4.95%，而在CHF、CHN_T、CHN_J區(qū)域中相對(duì)豐度分別為0.007%、0.55%、0.07%，該菌屬是大曲中重要的核心功能細(xì)菌微生物，有較強(qiáng)的耐高溫特性，具有產(chǎn)高溫淀粉酶、蛋白酶等能力[17]。

2.4 不同釀造方式下釀造車間的環(huán)境微生物差異性分析

為了對(duì)比分析機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式不同區(qū)域的環(huán)境微生物，利用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)平臺(tái)將各個(gè)區(qū)域的微生物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析獲得Venn圖。LEfSe統(tǒng)計(jì)方法分析兩種釀造方式釀造核心區(qū)的差異微生物，并結(jié)合Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)環(huán)境區(qū)域的2組樣品的差異微生物相對(duì)豐度進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖3、圖4所示。

a-Venn圖；b-LDA柱形圖；c-兩組比較秩和檢驗(yàn)條形圖

a-Venn圖；b-LDA柱形圖；c-兩組比較秩和檢驗(yàn)條形圖

由圖3-a可知，機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式不同區(qū)域共有真菌屬達(dá)46種，其共有真菌屬在各環(huán)境區(qū)域的真菌屬種類中占比為13.90%。從機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式相同區(qū)域?qū)Ρ葋?lái)看，機(jī)械化釀造方式釀造核心區(qū)具有僅在該區(qū)域檢出Septoria、Cercophora、Funbolia等共25種特有真菌屬，傳統(tǒng)釀造方式釀造核心區(qū)具有Butlerelfia、Paraboeremia、Corynespora等共14種特有真菌屬。機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式核心釀造區(qū)分別檢出的特有微生物均是文獻(xiàn)報(bào)到的釀造環(huán)境中不常見(jiàn)且相對(duì)豐度較低的真菌類群。因此，機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式核心區(qū)域真菌種類具有較大差異，主要原因可能是兩種方式下釀造核心區(qū)域環(huán)境條件及營(yíng)養(yǎng)狀況存在差異，以及與微生物之間的相互作用有關(guān)。由圖3-b、圖3-c可知，機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式釀造核心區(qū)兩組環(huán)境樣品中在真菌屬水平上共檢測(cè)出16種(LDA>3)差異微生物，其中未分類-畸形球菌科、Neodevriesia、未分類-煤炱目(unclassified_o_Capnodiales)、unclassified_o__Hypocreales、unclassified_f__Bionectriaceae共6種差異真菌相對(duì)豐度均是機(jī)械化釀造方式顯著高于傳統(tǒng)釀造方式(P<0.05)；假絲酵母屬、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、石竹菌屬(Baudoinia)、Diutina、Cyberlindnera共6種差異真菌相對(duì)豐度均是傳統(tǒng)釀造方式顯著高于機(jī)械化釀造方式(P<0.05)。這些真菌差異微生物中，除了未分類-畸形球菌科、Stilbocrea、假絲酵母屬、威克漢姆酵母屬外，其余真菌類群相對(duì)豐度均<1%。兩種釀造方式釀造核心區(qū)中共檢測(cè)到多種酵母菌，如假絲酵母屬、威克漢姆酵母屬及伊薩酵母屬等，均為大曲功能微生物[18]。威克漢姆酵母屬在白酒發(fā)酵過(guò)程具有發(fā)酵力和產(chǎn)香能力，其代謝產(chǎn)生的苯乙醇具有玫瑰花香[19]。

由圖4-a可知，機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式不同區(qū)域共有細(xì)菌屬達(dá)229種，其共有細(xì)菌屬在各環(huán)境區(qū)域的細(xì)菌屬種類中占比為23.32%。從機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式相同區(qū)域?qū)Ρ葋?lái)看，機(jī)械化釀造方式釀造核心區(qū)具有Geovibrio、Tenggerimyces、Tistlia等共62種特有細(xì)菌屬，傳統(tǒng)釀造方式釀造核心區(qū)具有Pelosinus、Anaerococcus、Pricia等共35種特有細(xì)菌。機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式核心釀造區(qū)分別檢出的特有微生物均是文獻(xiàn)報(bào)到的釀造環(huán)境中不常見(jiàn)且相對(duì)豐度較低的細(xì)菌類群。因此，機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式核心區(qū)域細(xì)菌種類具有一定差異，主要原因可能是細(xì)菌類群的環(huán)境應(yīng)答[20]以及與真菌類群的相互作用有關(guān)。由圖4-b、圖4-c可知，機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式釀造核心區(qū)兩組環(huán)境樣品中在細(xì)菌屬水平上共檢測(cè)出25種(LDA>3)差異微生物。其中短桿菌屬、Knoellia、Pseudonocardia、扁菌屬(Planomicrobium)、黃體單胞菌屬(Luteimonas)、谷氨酸桿菌屬(Glutamicibacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Kytococcus、球菌屬(Tessaracoccus)共9種差異細(xì)菌相對(duì)豐度均是機(jī)械化釀造方式顯著高于傳統(tǒng)釀造方式(P<0.05)。魏斯氏菌屬、片球菌屬(Pediococcus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、TM7a、Sphingomonas、Novosphingoium、Methylobacterium-Methylorubrum及norank_f_norank_o_chloroplast共9種差異細(xì)菌相對(duì)豐度均是傳統(tǒng)釀造方式顯著高于機(jī)械化釀造方式(P<0.05)。兩種釀造方式釀造核心區(qū)細(xì)菌差異微生物中，除了魏斯氏菌屬、短桿菌屬、諾氏菌屬、片球菌屬、假單胞菌屬外，其余細(xì)菌類群相對(duì)豐度均<1%。其中，短桿菌屬等微生物對(duì)白酒釀造具有重要作用，該菌屬產(chǎn)酯化酶、過(guò)氧化氫酶等多種酶類，可以為白酒釀造提供酶類，產(chǎn)生豐富的風(fēng)味物質(zhì)[21]。

綜上所述，機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式不同區(qū)域共有微生物所占比例是細(xì)菌高于真菌?？梢猿醪椒治?，由于機(jī)械化釀造方式對(duì)于環(huán)境因子的改變以及微生物的相互作用等原因，導(dǎo)致了真菌類群在種類和相對(duì)豐度上具有一定差異，而對(duì)于細(xì)菌類群也有一定影響，如枝孢菌屬、風(fēng)疹菌屬、頂孢屬(Acremonium)、副球菌屬(Paracoccus)等微生物，而傳統(tǒng)釀造方式下在連續(xù)的白酒生產(chǎn)過(guò)程中微生物得以不斷馴化和富集，如曲霉屬、魏斯氏菌屬、假絲酵母屬、醋酸桿菌屬(Acetobacter)等微生物。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，絲孢酵母屬、嗜熱子囊屬、考克氏菌屬等與白酒釀造相關(guān)的微生物在機(jī)械化釀造方式下得以富集。但是，白酒生產(chǎn)是一個(gè)開(kāi)放、連續(xù)的生產(chǎn)過(guò)程，由于稻殼、糧食的不斷補(bǔ)充，導(dǎo)致車間內(nèi)外的微生物交換，并且因空氣流動(dòng)等原因各環(huán)節(jié)之間微生物又相互影響，而這些微生物的適應(yīng)性較強(qiáng)，使得傳統(tǒng)釀造方式下自然富集的微生物難以形成絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。因此，連續(xù)的白酒生產(chǎn)過(guò)程有利于釀造功能菌屬的富集，進(jìn)而對(duì)白酒生產(chǎn)產(chǎn)生影響。

3 結(jié)論

采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式釀造車間的非釀造區(qū)、釀造非核心區(qū)、釀造核心區(qū)的環(huán)境微生物進(jìn)行檢測(cè)并利用測(cè)序平臺(tái)分析，共檢測(cè)出8個(gè)真菌門、331個(gè)真菌屬；31個(gè)細(xì)菌門、982個(gè)細(xì)菌屬。從微生物多樣性分析結(jié)果來(lái)看，不同釀造方式的釀造車間內(nèi)環(huán)境微生物種類較為豐富但有一定差異，可能與傳統(tǒng)釀造的開(kāi)放式環(huán)境有關(guān)；從兩種釀造方式不同區(qū)域的微生物群落構(gòu)成分析，真菌類群構(gòu)成呈現(xiàn)不同的特征，而細(xì)菌類群構(gòu)成呈現(xiàn)相似的特征；兩種釀造方式的相同區(qū)域微生物群落構(gòu)成比較，發(fā)現(xiàn)真菌類群構(gòu)成具有一定差異性，而細(xì)菌群落構(gòu)成具有較大的差異性。通過(guò)對(duì)兩種釀造方式下不同區(qū)域微生物類群的變化情況分析，發(fā)現(xiàn)機(jī)械化釀造車間環(huán)境中真菌類群主要集中在攤晾區(qū)域，而細(xì)菌類群在所有區(qū)域中均衡分布；傳統(tǒng)釀造車間環(huán)境中真菌類群在釀造非核心區(qū)及釀造核心區(qū)(攤晾區(qū)域、窖池區(qū)域)相對(duì)豐度較高，而細(xì)菌類群在所有區(qū)域分布較為均衡，但主要集中在釀造非核心區(qū)、釀造核心區(qū)的攤晾區(qū)域。經(jīng)機(jī)械化與傳統(tǒng)釀造方式環(huán)境微生物的差異分析，發(fā)現(xiàn)兩種釀造方式所有區(qū)域共有46種真菌屬，其中枝孢菌屬、未分類-畸形球菌科、節(jié)擔(dān)菌屬、曲霉屬、絲孢酵母屬為共有優(yōu)勢(shì)微生物；共有229種細(xì)菌屬，其中棒狀桿菌屬為共有優(yōu)勢(shì)微生物。從釀造核心區(qū)差異微生物分析結(jié)果來(lái)看，機(jī)械化釀造方式釀造核心區(qū)具有Septoria、Cercophora、Funbolia等共25種特有真菌屬，且具有Geovibrio、Tenggerimyces、Tistlia等共62種特有細(xì)菌屬；傳統(tǒng)釀造方式釀造核心區(qū)具有Butlerelfia、Paraboeremia、Corynespora等共14種特有真菌屬，且具有Pelosinus、Anaerococcus、Pricia等共35種特有細(xì)菌屬。這些核心釀造區(qū)分別檢出的特有微生物，均是釀造環(huán)境中不常見(jiàn)且相對(duì)豐度較低的微生物類群?？梢猿醪椒治?，由于機(jī)械化操作方式對(duì)于環(huán)境因子的改變以及微生物的相互作用等原因，導(dǎo)致了真菌類群在種類和相對(duì)豐度上具有一定差異，而對(duì)于細(xì)菌類群也有一定影響，如枝孢菌屬、風(fēng)疹菌屬、頂孢屬(Acremonium)、副球菌屬(Paracoccus)等微生物，以及與白酒釀造相關(guān)的微生物，如絲孢酵母屬、嗜熱子囊屬、考克氏菌屬等，而傳統(tǒng)釀造方式下在連續(xù)的白酒生產(chǎn)過(guò)程中微生物得以不斷馴化和富集，如曲霉屬、魏斯氏菌屬、假絲酵母屬、醋酸桿菌屬(Acetobacter)等微生物。

本次研究以機(jī)械化和傳統(tǒng)釀造方式下各環(huán)境區(qū)域采集的灰塵為環(huán)境樣本，未有涉及空氣微生物等環(huán)境樣本的研究。采集的樣本數(shù)量、樣本區(qū)域，還需進(jìn)一步拓展。研究中發(fā)現(xiàn)的一些微生物，如枝孢菌屬、Knoellia、Kytococcus等微生物對(duì)于白酒釀造的影響，有待進(jìn)一步解析。研究中檢測(cè)到的Fusicolla、假單胞菌屬等微生物，在其他香型白酒的釀造環(huán)境中也有發(fā)現(xiàn)，這些微生物與白酒酒體風(fēng)格特征形成的關(guān)聯(lián)，還有待進(jìn)一步研究。今后，研究中發(fā)現(xiàn)的環(huán)境微生物，特別是差異性菌屬，對(duì)于釀造區(qū)域環(huán)境的應(yīng)答特性、遷移規(guī)律以及對(duì)白酒釀造的影響，還需進(jìn)一步深入分析和跟蹤研究。