張紅玉，王丹，吳春劍，侯天宇，趙亞娜，張志軍，雷娜娜，李河*

（1.中北大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山西太原 030051）（2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510641） （3.香港中文大學(xué)化學(xué)院，中國香港 999077）

紫蘇（Perilla frutescensL.）是一種唇形科草本植物，是國家衛(wèi)生部首批頒布的藥食同源的60種中藥之一[1]。在東南亞地區(qū)分布廣泛，尤其在中國、日本、韓國種植歷史更加悠久[2]。我國早有利用新鮮紫蘇葉處理以避免食用蝦蟹中毒的傳統(tǒng)，日本將紫蘇當(dāng)做代表性的風(fēng)味食品，韓國利用紫蘇制作泡菜和烤肉包 裝[3]，因此，紫蘇在食品工業(yè)上應(yīng)用廣泛。

紫蘇代謝物在其生長和自我防御機(jī)制中形成，主要包括黃酮類、脂肪酸類、酚酸類[4]、植物甾醇類及精油[5,6]，具有多種生理功能[3]。研究表明，紫蘇提取物有極強(qiáng)的抗氧化性[7-9]。紫蘇油可改善糖尿病性小鼠的高甘油三酸酯血癥和腸道營養(yǎng)不良[10]、淀粉樣蛋白β誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙[11]和炎癥反應(yīng)[12]；紫蘇葉提取物對脂肪細(xì)胞分化和高脂飲食小鼠有抗肥胖作用[13]，也有降血糖活性[14]；紫蘇醛可調(diào)節(jié)大鼠的α-抑制蛋白減輕其抑郁行為[15]；紫蘇籽多糖可抑制小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長[16]。

研究表明迷迭香酸是紫蘇葉中含量最高的化合 物[3]。薛姣[17]分離純化了紫蘇迷迭香酸，并研究了它的抗氧化和抗菌性能；楊馥菡等[18]利用高速逆流色譜分離純化了紫蘇葉中的迷迭香酸和咖啡酸。何彥康[19]利用高效液相色譜-二極管陣列（HPLC-DAD）、高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）以及核磁共振光譜（NMR）確認(rèn)了紫蘇中花色苷和主要黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)；Assefa等[9]利用超高效液相色譜-電噴霧電子-飛行時間-質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-ESI-TOF-MS）定性分析了73種紫蘇樣品中酚類化合物。Yan等[7]提取測定了冷榨紫蘇子粉中的總多酚含量，并評估了其中的抗氧化性能；上述對紫蘇代謝物的研究多基于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，且以定性為主。在對紫蘇代謝物定量分析的研究中，史月姣等[20]和艾鑫衛(wèi)等[21]利用LC-MS分別測定了紫蘇水煎液和各生長期紫蘇中的酚類物質(zhì)含量；代沙等[22]利用HPLC測定了不同品系紫蘇中的8種酚類物質(zhì)；落艷嬌等[23]測定了不同栽培年份和采收期紫蘇葉中的2種酚酸和6種黃酮的成分含量。此外，5-羥甲基糠醛（HMF）和糠醛等呋喃環(huán)衍生物也被報道為植物代謝物，在中藥中廣泛存在[24,25]，然而在紫蘇中的分布尚未見報道。

綜上所述，目前對紫蘇代謝物的研究主要集中在迷迭香酸、咖啡酸和部分黃酮上，原料以紫蘇葉為主。鮮有報道紫蘇桿、殼、葉中代謝物同時定量分析方法的研究。與HPLC-MS相比，HPLC價格相對便宜，在各高校實驗室及公司研發(fā)質(zhì)檢部門普遍配備，因此，本實驗以山西不同品種的紫蘇為研究對象，利用HPLC法系統(tǒng)分析紫蘇不同部位的19種代謝物的含量和分布，以期為紫蘇代謝物的定量分析及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇葉、紫蘇桿、紫蘇殼（山西省晉中市）均來源于本課題組實驗田種植所得，品種分別為1#、3#、4#、27#、28#、混1#、晉紫蘇2#、晉紫蘇3#、白蘇、雙面紫。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸均為色譜純，均購自上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司。無水乙醇、沒食子酸（GA）、迷迭香酸（RosA）、蘆丁（RT）購自北京索萊寶科技有限公司。5-羥甲基糠醛（HMF）、糠醛（F）、原兒茶酸（PCA）、對羥基苯甲酸（ρ-HBA）、兒茶素（C）、咖啡酸（CA）、對香豆酸（ρ-CA）、野黃芩苷（SG）、阿魏酸（FA）、楊梅素（MC）、白藜蘆醇（RVT）、木犀草素（LTL）、槲皮素（QC）、芹菜素（AGN）、山奈酚（KMF）均購自上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司，芹菜素-7-O-葡萄糖苷（AG）購自上海紫霞生物科技有限公司。19種植物代謝物的詳細(xì)信息見表1。

表1 19種植物代謝物的詳細(xì)信息Table 1 Detailed information of 19 plant metabolites

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000高效液相色譜儀，美國熱電公司；超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀，Aanquish超高效液相系統(tǒng)，TSQ Altis三重四極桿質(zhì)譜，美國熱電公司；SB25-12DTD超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；CTL550低速離心機(jī)，湖南湘立儀器有限公司；XW-80A渦旋混合器，上海馳唐電子有限公司；ZYCGF-III-20T超純水制備系統(tǒng)，四川卓越水處理設(shè)備有限公司；BCD-576WDPU冰箱，海爾公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

準(zhǔn)確稱取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、糠醛、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、兒茶素、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、迷迭香酸、楊梅素、白藜蘆醇、木犀草素、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品各20 mg，分別用甲醇溶解并定容到10 mL容量瓶中，得到每種標(biāo)準(zhǔn)品濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。利用含0.1%甲酸的乙腈水溶液（乙腈:水=1:1，V/V）對貯備液進(jìn)行梯度稀釋，得到一系列不同濃度梯度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，同時稀釋各標(biāo)準(zhǔn)貯備液，得到單獨標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

1.3.2 色譜分析條件

采用高效液相色譜法對19種物質(zhì)進(jìn)行測定，其中單獨標(biāo)準(zhǔn)品用于定性分析，混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量分析，色譜條件如下：（1）色譜柱：Atlantic C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；（2）柱溫，25 ℃；（3）流動相：A，0.1%甲酸乙腈、B，0.1%甲酸水；（4）洗脫程序：0~15 min，95%~90% B；15~30 min，90%~70% B；30~50 min，70%~60% B；50~51 min，60%~0% B；51~54 min，0% B；54~55 min，0~95% B；55~65 min，95% B。（5）進(jìn)樣量，20 μL；（6）流速，1.0 mL/min；（7）檢測波長見表1。

1.4 未知物定性分析

經(jīng)甲醇水溶液提取之后，樣品色譜圖中有2個色譜峰i和ii（圖2b、2c、2d）與19種標(biāo)品化合物的保留時間均對應(yīng)不上，但其含量相對較高，為了進(jìn)一步對這兩種化合物進(jìn)行定性分析，利用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-TOF-MS）對其質(zhì)譜碎片離子進(jìn)行確定，色譜條件同1.3.2，進(jìn)入質(zhì)譜時通過分流將流速設(shè)為0.3 mL/min，質(zhì)譜條件如下：電噴霧電子（ESI）電離，負(fù)離子模式，全掃描，掃描范圍：100~1 000m/z，離子傳輸管溫度：300 ℃，霧化室溫度：350 ℃，載氣40 arb；輔助氣：10 arb。

1.5 樣品前處理

分別對不同品種紫蘇葉、桿及殼取樣，經(jīng)自然風(fēng)干后攪碎，然后過60目篩，得到各部位的粉末狀樣品，取樣部位及樣品見圖1。準(zhǔn)確稱取0.50 g粉末樣品至50 mL塑料離心管中，加入10 mL酸化甲醇水溶液（甲醇:水=60:40，0.1%甲酸），渦旋振蕩1 min，超聲萃取20 min后，5 000 r/min離心15 min，收集上清液。殘渣繼續(xù)用10 mL上述甲醇水溶液繼續(xù)萃取1次，重復(fù)超聲和離心步驟，收集上清液，過0.22 μm濾膜后，待HPLC分析。對于紫蘇葉樣品中的迷迭香酸，因其含量較高（出現(xiàn)平頭峰，圖2b），進(jìn)樣前需進(jìn)行10倍稀釋。

圖1 紫蘇取樣部位圖Fig.1 Sampling sites of Perilla

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 檢出限與定量限

紫蘇桿樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后得到信噪比（S/N）為3時對應(yīng)的濃度為樣品的檢出限（LOD），以信噪比為10時對應(yīng)的濃度為定量限（LOQ）。具體方法為：在紫蘇桿樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過前處理之后，濃度為C，HPLC分析得到信噪比為n，則此時利用以下公式計算得到理論的LOD和LOQ：

注：

LOD——樣品的檢出限；

LOQ——定量限；

C——紫蘇桿樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)前處理之后的濃度；

n——信噪比。

以計算得到的LOD和LOQ為參考，加入濃度越來越低的標(biāo)準(zhǔn)溶液，直到實際測得信噪比為3或10時，對應(yīng)的濃度即為實際的LOD和LOQ（實際值一般比理論值偏高）。

1.6.2 線性方程與范圍

利用外標(biāo)法對植物樣品中19種物質(zhì)進(jìn)行定量。分別配置濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3.2色譜條件下進(jìn)樣分析。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于各物質(zhì)響應(yīng)有差異，其對應(yīng)的線性范圍見表2。

1.6.3 回收率和精密度

精確稱取紫蘇桿樣品0.50 g，加入19種混合標(biāo)準(zhǔn)品適量，使其濃度分別達(dá)到2.0、10.0和50.0 mg/L，每個濃度平行6次，各物質(zhì)的回收率通過以下公式計算：

式中：

R——回收率，%；

m總——各物質(zhì)加標(biāo)和樣品的總含量，mg；

m樣品——樣品本身各物質(zhì)的含量，mg；

m加標(biāo)——加入各物質(zhì)的含量，mg。

回收率6次平行的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）作為方法的精密度。

1.7 統(tǒng)計分析

除了回收率平行6次外，其余結(jié)果均為三次檢測均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行整理與初步分析，SPSS 21.0進(jìn)行方差分析，Origin 2018進(jìn)行作圖以及擬合處理。置信區(qū)間為95%，即P＜0.05視為數(shù)據(jù)之間有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測19種植物代謝物

采用HPLC對紫蘇不同部位的19種植物代謝物進(jìn)行檢測，在1.3.2的色譜條件下，19種物質(zhì)在55 min實現(xiàn)完全分離，峰型和分離度均較理想。三種紫蘇不同部位的樣品中，19種物質(zhì)種類與含量的分布差異較大。圖2為19種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和典型的紫蘇葉、紫蘇桿、紫蘇殼樣品液相色譜圖。由圖可知，在無需凈化的過程中，樣品中19種化合物的峰型干擾不影響定量積分。

圖2 19種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品及典型樣品的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 19 mixed standard compounds and typical samples

2.2 未知物的定性分析

如圖2b、2c、2d所示，利用UPLC-TOF-MS對色譜峰i和ii進(jìn)行定性分析，結(jié)果見圖3。對于化合物i，負(fù)離子模式下，脫氫后質(zhì)荷比為m/z637.151 00，未觀察到可能的碎片離子，根據(jù)質(zhì)譜信息與文獻(xiàn)對 照[9,19]，判斷i化合物為木犀草素-7-O-二葡萄糖苷；對于化合物ii，負(fù)離子模式下，脫氫后質(zhì)荷比為m/z621.121 03，較高的碎片離子為m/z351.167 05，應(yīng)為黃酮骨架上脫去一個葡萄糖苷酸基團(tuán)（177 u）和一個苯酚基團(tuán)（93 u），將其質(zhì)譜信息與已發(fā)表的文獻(xiàn)對比[4,9]，可確定化合物ii為芹菜素-7-O-二葡萄糖苷，由于這兩種苷類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品很難商業(yè)購買，本文利用芹菜素-7-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品對它們進(jìn)行定量分析。

圖3 兩種未知物i和ii的TOF-MS圖Fig.3 TOF-MS spectrum two unknown compounds: i and ii

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

由于純有機(jī)試劑對待測物的溶解性大于流動相，使用純有機(jī)試劑（如甲醇）對樣品進(jìn)行提取，會導(dǎo)致進(jìn)入色譜柱的待測物在溶劑和流動相之間分配不均，出現(xiàn)部分物質(zhì)色譜峰前置拖尾的現(xiàn)象，從而影響分離度。因此在對提取溶劑選擇時，本文參照文獻(xiàn)及課題組研究經(jīng)驗[23,26]，比較了甲醇、乙腈、乙醇水溶液（40%體積水）對19種待測物的提取回收率，結(jié)果見圖4。如圖4所示，三種溶劑對糠醛和楊梅素的回收率均較低，相比之下，甲醇水溶液更為理想。乙醇對對羥基苯甲酸、對香豆酸、迷迭香酸和白藜蘆醇的回收率均超過100%，可能由于乙醇極性較低，提取了較多的雜質(zhì)；乙腈對沒食子酸和蘆丁的回收率偏低；綜上所述，本研究最終選擇甲醇水溶液作為提取溶劑。

圖4 三種溶劑對19種化合物回收率的影響（n=3）Fig.4 Effects of three extract solvents on the recoveries of 19 compounds (n=3)

2.4 方法學(xué)認(rèn)證

2.4.1 檢出限、定量限與標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.6方法學(xué)考察，采用峰面積外標(biāo)法定量，以質(zhì)量濃度1.0、2.0、5.0、10.0、25.0和50.0 mg/L為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，19種化合物的保留時間、檢出限、定量限與標(biāo)準(zhǔn)曲線等信息見 表2。19種物質(zhì)在線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.997 6~0.999 9之間，檢出限在0.10~ 0.40 mg/L之間。史月姣等[20]利用LC-MS測定了紫蘇水煎液的部分代謝物，但未報道檢出限；艾鑫衛(wèi)等[21]建立了高靈敏度的HPLC-MS測定紫蘇不同生長期代謝物的方法，但僅能測定5種多酚，且質(zhì)譜價格昂貴，較難普及。代沙等[22]建立了HPLC測定紫蘇中分類的方法，也沒有報道方法的檢出限。雖然與LC-MS相比較，本研究的靈敏度較低，但僅就高效液相色譜而言，本方法具有更廣泛的適用范圍，能滿足紫蘇中代謝物定性和定量分析的要求。

表2 19種植物代謝物的保留時間、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Retention time, linear range and equation, correlation coefficient, limit of detection (LOD) and limit of qualification (LOQ) of 19 plant metabolites

2.4.2 回收率和精密度

由表3可知，19種植物代謝物的加標(biāo)回收率在61.65%~111.42%之間，RSD在1.02%~17.20%之間。由于糠醛類物質(zhì)粘度較大，且在紫蘇中含量極少，在加標(biāo)量較少時，其回收率較低。由于本文采用的HPLC法同時測定多種含紫外吸收基團(tuán)的化合物，在提取中無法避免共洗脫的干擾，歐盟委員會規(guī)定，當(dāng)加標(biāo)量較低時，回收率在-50%到+20%之間可以接受[27]。因此，在沒有質(zhì)譜輔助的情況下，該方法在實驗室及工業(yè)檢測同時定量19種化合物時是可行的。

表3 19種化合物加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and precision of 19 compounds (n=6)

2.5 實際樣品的檢測

應(yīng)用所建立的方法對10種不同品種紫蘇的葉、殼、桿進(jìn)行定量分析，檢測結(jié)果見表4。通過對結(jié)果分析（圖5），12種樣品中，含量較大的化合物為咖啡酸、木犀草素-7-O-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-二葡萄糖苷、野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、迷迭香酸和芹菜素，在0.04~24.05 mg/g之間，含量差異跨度較大，不同紫蘇部位的化合物含量分布也不同。結(jié)果顯示，28#紫蘇殼中共檢出11種物質(zhì)，含量在0.08~0.57 mg/g之間；21種化合物中，酚酸類如咖啡酸和迷迭香酸；黃酮及黃酮苷類，如木犀草素-7-O-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-二葡萄糖苷、野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷和芹菜素在12種樣品中均有檢出，其中迷迭香酸為紫蘇葉中含量最高的物質(zhì)，這與前人的研究一致[17,28]，其次為野黃芩苷和芹菜素-7-O-葡萄糖苷。胡惠軍等[26]報道了紫蘇葉中咖啡酸、迷迭香酸和野黃芩苷的含量，其含量分別在0.10~0.49、0.29~9.58和0.26~4.38 mg/g之間；落艷嬌等[23]測定了51個紫蘇葉樣品中咖啡酸、迷迭香酸和6種黃酮苷的含量，發(fā)現(xiàn)迷迭香酸含量為為2.13~33.97 mg/g；其次是木犀草素-7-O-二葡萄糖苷，含量為1.31~14.80 mg/g；芹菜素-7-O-二葡萄糖苷含量為2.68~7.60 mg/g；芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量為0.56~1.00 mg/g；咖啡酸含量最少，為0.11~0.68 mg/g。造成含量差異的原因可能與紫蘇品種、生成環(huán)境、水分含量及提取溶劑等有關(guān)。此外，本文中原兒茶酸和對羥基苯甲酸在部分樣品中也有檢出。木犀草素在紫蘇殼和桿中有檢出，含量較少，在0.05~0.18 mg/g之間，但在紫蘇葉中沒有檢出。值得注意的是，本文在紫蘇殼中檢出了HMF和糠醛兩種呋喃環(huán)衍生物。

表4 12種不同紫蘇品種殼、葉、桿中植物代謝物的含量（n=3）Table 4 Contents of 21 studied compounds in seed shell, leaf and stem of 12 different types ofPerilla (n=3)

圖5 21種化合物在不同品種紫蘇不同部位的分布圖Fig.5 Distribution of 21 compounds in different parts of different varieties of Perilla

3 結(jié)論

本實驗基于高效液相色譜-紫外檢測儀建立了不同品種紫蘇不同部位中19種植物代謝物同時檢測的方法，19種化合物保留時間穩(wěn)定，峰型和分離度良好。方法的檢出限在0.05~0.40 mg/L之間，回收率和精密度分別在61.65%~111.42%和1.02%~17.20%之間。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用該方法對不同品種分不同部位的紫蘇進(jìn)行了檢測。19種化合物在不同紫蘇部位中的含量差異極大，其中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素-7-O-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-二葡萄糖苷、野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷和芹菜素等含量較大，在12個樣品中均有檢出，含量在0.05~24.05 mg/g之間。28#紫蘇殼中共檢出11種物質(zhì)，含量在0.08~0.57 mg/g之間；紫蘇殼和桿中均有木犀草素檢出，含量在0.05~0.18 mg/g之間；紫蘇葉中化合物含量順序為迷迭香酸＞野黃芩苷＞芹菜素-7-O-葡萄糖苷。此外，本實驗在紫蘇殼中檢出HMF和糠醛兩種呋喃環(huán)衍生物。